WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Метод иммуноцитохимического анализа в модификации In Home использовали для оценки распределения в ЦНС улитки серотонинового рецептора SR-1A. Для этого из животных выделяли ЦНС, препарат фиксировали формалином (4%), обрабатывали проназой, снимали соединительно-тканные оболочки, затем инкубировали с TRITON (0,5%); 5% обезжиренным молоком; первичными антителами к рецептору SR-1A (Santa Cruz, rabbit, разведение 1:50) и вторичными антителами («Amersham» (ECL-система) разведение 1: 2500). Окрашивание осуществляли в 0,1% растворе DAB (диаминобензидин), в присутствии NiCl2 (Novocastra), H2O2 (0,03%). Далее препарат осветляли и фиксировали.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительный анализ экспрессии MAPK/ERK в ЦНС виноградной улитки и высших позвоночных животных (крыса).

Так как MAP-киназа ERK у виноградной улитки не исследована, в качестве первой стояла задача выявить экспрессию этих киназ у Helix. Исследование экспрессии MAP-киназ ERK проводили на уровне синтеза м-РНК методом ОТ-ПЦР и на уровне синтеза белка методом Вестерн блот анализа. Было показано, что на уровне синтеза м-РНК в ЦНС виноградной улитки происходит значительная экспрессия MAP-киназ ERK (Рис.1).

Для оценки содержания и/или активацию МАР-киназ использовали антитела к тотальным и фосфорилированным формам MAPK/ERK. Фосфорилирование МАР-киназ ERK вышележащей МЕК-киназой вызывает их активацию. Исследования показали, что антитела к тотальным формам MAPK/ERK выявляют в ЦНС Helix одну полосу с молекулярным весом 42 kDa, которая равна подвижности ERK2 крысы (Рис. 2, А). Протеинкиназа ERK1 с молекулярным весом 44 kDa у улитки не обнаруживается. Антитела к фосфо-p44/p42 MAPK также выявляют только одну полосу MAPK/ERK2 (Рис. 2, Б).

Чтобы подтвердить специфичность связывания антител, провели пептид-связывающий контроль (peptide competition control). Как показано на рисунке 2 В, использование блокирующего пептида phospho-p44/42 MAPK (Thr 202/Tyr 204) (Cell Signalling) полностью предотвращает связывание антител. Этот результат подтверждает данные о специфичности сигнала p-ERK. Таким образом, проведенные эксперименты позволяют утверждать, что MAP-киназа ERK2 экспрессируется в ЦНС Helix lucorum и коммерческие антитела могут применяться для дальнейшего анализа ее содержания и активации.

2. Анализ экспрессии и активации МАР-киназ ERK в функционально различных ганглиях ЦНС виноградной улитки при обучении.

Исследования экспрессии и активации MAPK/ERK при обучении проводили в функционально различных ганглиях ЦНС улитки (париетовисцеральном, педальном и церебральном). В париетовисцеральном комплексе ганглиев локализованы нервные клетки, участвующие в организации оборонительного поведения, в том числе сенсорные, моторные и командные. По литературным данным (Балабан, Захаров, 1992) около 90% нейронов в этом ганглии реагируют на ноцицептивную стимуляцию. Удар электрическим током использовали в качестве безусловного стимула. Нейроны педального ганглия непосредственно не участвуют в замыкании дуги изучаемого рефлекса и осуществляют модуляторные функции. В церебральном ганглии осуществляется анализ сенсорной информации - обработка запахов, связанных с пищевыми стимулами, которые использовались нами в качестве условных.

2.1 Сравнительное изучение активации МАРK/ERK в париетовисцеральном комплексе ганглиев виноградной улитки при обучении.

Методом Вестерн блот-анализа с применением антител к тотальным и фосфорилированным формам МАР-киназ ERK1/2 показано, что в париетовисцеральном комплексе ганглиев детектируется значительное количество MAPK/ERK (рис.3, A).

Анализ активации МАРK/ERK спустя разные сроки после окончания процедуры обучения показал, что через 10 мин после обучения в этом ганглии происходит значительная активация МАРK/ERK каскада, что отражается в увеличении содержания фосфо-форм МАРK/ERK по сравнению с контролем (рис. 3 Б – темные столбики). Спустя 1 ч после обучения уровень фосфорилирования МАРK/ERK снижается, однако остается достоверно выше контрольного уровня. Через 2 ч после обучения уровень фосфорилирования падает ниже базального, снова увеличиваясь к 4 ч (рис. 3). Таким образом, при формировании условного рефлекса пищевой аверзии наблюдаются два пика активации МАРK/ERK (10/60 мин и 4 ч) и дезактивация ниже базального уровня спустя 2 ч после обучения.

Известно, что в формировании ассоциативных и неассоциативных форм обучения у моллюсков значительную роль играет серотонин. Этот медиатор опосредует передачу подкрепляющего ноцицептивного стимула и лежит в основе формирования механизмов сенситизации и условных оборонительных рефлексов (Балабан и Захаров, 1992; Шевелкин и др., 1997; Martin et al., 1997). Дисфункция синаптических терминалей серотонинергических нейронов препятствует развитию потенциации, сенситизации и условных оборонительных рефлексов у Helix (Балабан и Захаров, 1992; Малышев, 1997). В связи с этим группе улиток был введен нейротоксин 5,7-диокситриптамин (5,7-ДОТ), разрушающий серотонинергические терминали. Через 7 дней после последнего введения нейротоксина животных подвергали обучению. Далее методом Вестерн блот-анализа сравнивали активацию МАР-киназ ERK у животных, инъецированных физ. раствором, и у животных, которым вводили нейротоксин 5,7-ДОТ. Обнаружено, что разрушение серотонинергических терминалей не сказывается на базальном уровне синтеза МАРK/ERK (рис. 3). Однако введение 5,7-ДОТ приводит к значительному снижению активации МАРK/ERK спустя 10 мин после обучения по сравнению с обученными и инъецированными физ. раствором животными, что свидетельствует о важной роли серотонина в регуляции активации этого каскада на данных этапах обучения. Через 4 ч после обучения у 5,7-ДОТ-обработанных животных, как и у нативных обученных наблюдается рост содержания фосфо- МАРK/ERK.

Таким образом, введение 5,7-ДОТ, приводящее к снижению способности улиток к выработке условного рефлекса пищевой аверзии, приводит к драматическому снижению активации МАРK/ERK каскада на ранних этапах формирования этого рефлекса. 1

2.2 Исследование содержания и активации МАРK/ERK в педальном комплексе ганглиев виноградной улитки при обучении.

Далее нами был проведен анализ активации МАРK/ERK спустя разные сроки после окончания процедуры обучения в педальном ганглии. Нейроны этого ганглия не входят в сеть оборонительного рефлекса и осуществляют модуляторные функции (Балабан и Захаров, 1992; Иерусалимский и др., 1992).

Из рис. 4 видно, что, в отличие от париетовисцерального комплекса ганглиев, в педальных ганглиях через 10 мин после обучения активации MAPK/ERK не наблюдается, а через 1 ч происходит даже падение. Спустя 2 ч, так же как и в париетовисцеральном комплексе, происходит достоверное снижение фосфорилирования MAPK/ERK ниже базального уровня, а спустя 4 ч также наблюдается увеличение. Введение животным нейротоксина 5,7-ДОТ достоверных отличий в уровне фосфорилирования MAPK/ERK не вызывает.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что при успешной выработке условного рефлекса пищевой аверзии в ЦНС виноградной улитки происходит значительная активация МАРK/ERK каскада, что подтверждает данные об участии МАР-киназ ERK в обучении, полученные на других видах животных (Silva et al, 1998; Herdegen and Leah, 1998; Kaminska et al, 1999; Davis et al., 2000; Thiels et al, 2002; Sananbenesi et al, 2003). Динамика активации МАРK/ERK носит волнообразный характер с пиками в 10/60 мин и 4 часа, что коррелирует с наличием 2 пиков экспрессии генов при обучении (Анохин, 1997).

Известно, что основными индукторами МАРK/ERK-каскада являются факторы роста, взаимодействующие с тирозинкиназными рецепторами (Kaplan and Miller, 2000). Однако этот каскад может также активироваться ПКА и кальцием (Kormhauser and Greenberg, 1997). Как отмечалось выше, в формировании оборонительных форм обучения у моллюсков, в том числе у Helix, значительную роль играет серотонин. При этом свое действие на механизмы пластичности серотонин оказывает через цАМФ-зависимый регуляторный путь (Martin et al, 1997; Гринкевич и др., 2001). Таким образом, первый пик активности МАР-киназ может индуцироваться серотонином. В пользу этого положения свидетельствуют наши данные по значительному снижению активации МАРK/ERK на ранних стадиях обучения в париетовисцеральном комплексе ганглиев при введении нейротоксина 5,7-ДОТ, вызывающего дисфункцию серотониновых терминалей и редуцирующего способность к данной форме обучения. Сходная картина активации МАРK/ERK наблюдается также в церебральном комплексе ганглиев, осуществляющих анализ сенсорной информации, о к пищевых стимулах, которые использовались нами в качестве условных. Так, спустя 10 мин после обучения уровень фосфорилирования ERK составлял 2,22±0,32 по отношению к контролю (который принят за 1) и уменьшался до 1,23±0,12 при введении 5,7-ДОТ (достоверно, р<0,01).

С другой стороны, известно, что CRE-зависимым путем МАРК каскады могут индуцировать экспрессию генов факторов роста (Xing et al, 1996; Finkbeiner et al, 1997; Xu Tao et al, 1998). При этом факторы роста, выделяясь во внеклеточное пространство, через тирозинкиназные рецепторы, способны осуществлять положительную обратную связь на активацию МАР-киназных сигнальных каскадов. Таким образом, факторы роста могут обеспечить активацию МАР-киназных каскадов спустя длительное время после обучения. Кроме того, при выработке данного рефлекса в качестве подкрепления мы использовали сильный сенситизирующий стимул – удар электрическим током. Поэтому не исключено влияние на формирование этого рефлекса и стресса. Действием стресса можно также объяснить и увеличение фосфорилирования МАРK/ERK спустя 4 ч после обучения у 5,7-ДОТ-обработанных животных. Один из механизмов положительного влияния стресса на обучение через синтез рецептора кортикотропин–рилизинг-фактора детально описан в работе (Sananbenesi et al, 2003). Авторы показали, что стресс-индуцируемое улучшение обучения связано с активацией МАРK/ERK.

Суммируя вышеизложенное, следует отметить, что активация МАРK/ERK в ранние сроки после обучения носит специфический характер и снимается при введении нейротоксина 5,7-ДОТ. В то время как увеличение активности этих киназ спустя 4 ч после обучения носит неспецифический характер и наблюдается как у обучившихся животных, так и у неспособных к выработке оборонительного рефлекса животных, подвергнутых обучению. Кроме того, активация МАР-киназ спустя 4 ч наблюдается как в париетовисцеральном, так и в педальных, и церебральных ганглиях. [В церебральном ганглии уровень фосфорилирования ERK составлял 3,0±0,25 по отношению к контролю, который принят за 1 (достоверно при р < 0,001)]. Активация МАРK/ERK спустя 4 ч, вероятно, отражает адаптивные механизмы, индуцируемые в ответ на подкрепляющий стимул. Таким образом, первый пик активации МАРK каскада может вызываться серотонин/цАМФ-зависимой индукцией, опосредующей подкрепляющий стимул, а второй – через положительную обратную связь вновь синтезируемыми факторами роста, взаимодействующими с тирозинкиназными рецепторами, а также пептидами или другими биологически активными соединениями.

Чтобы убедиться в специфичности эффекта активации MAPK/ERK мы вводили животным ингибитор MAP-киназного каскада PD 98059 (Cell Signaling) (40 мкМ), который предотвращает активацию MAPK/ERK через ингибирование вышележащей MEK-киназы.

Было показано, что введение PD 98059 ингибирует увеличение активации MAPK/ERK, вызванное обучением (F(1, 12)=6,2; p<0,03 между тренированными PD-обработанными животными и тренированными животными, которым вводили физиологический раствор с растворителем для PD 98059) (Рис. 5). Более того, инъекция животным MEK-ингибитора PD 98059 за 30 минут до обучения предотвращала выработку рефлекса пищевой аверзии (животных тестировали через 24 часа после обучения). У всех 7 животных, которым вводили PD 98059, рефлекс не вырабатывался.

2.3. Исследование функционирования МАРK/ERK-каскада в функционально различных нейронах ЦНС виноградной улитки при обучении.

Дальнейшее изучение экспрессии и активации МАР-киназ ERK проводили на функционально различных нейронах, связанных с формированием условного оборонительного рефлекса (нейроны процеребрума и командные нейроны оборонительного поведения).

Нейроны процеребрума (высшей обонятельной структуры наземных легочных моллюсков) участвуют в организации поведения, связанного с восприятием и обработкой запахов (Gelperin and Tank, 1990; Zakharov et al, 1998; Nikitin and Balaban, 2000; Inoue et.al, 2001). Как мы уже отмечали выше, в качестве условного стимула мы использовали морковь, запах которой привлекает животное. Командные нейроны оборонительного поведения вызывают генерализированную оборонительную реакцию и являются основным пластическим звеном данного рефлекса (Литвинов, Логунов, 1979; Balaban, 2002). Контролем служили нейроны пула Д, которые не входят непосредственно в дугу изучаемого оборонительного рефлекса, и группа Н (Рис.6). В экспериментах анализировали объединенные экстракты из командных нейронов левого париетального ганглия ЛПа2 и ЛПа3 (ЛПа(2/3)) и, независимо, сумму командных нейронов из правого париетального ганглия, ППа2 и ППа3 (ППа(2/3)). Кроме того, объединяли идентичные командные нейроны из 3-х улиток. Основываясь на данных предыдущих экспериментов, для исследования экспрессии и активации MAPK/ERK в функционально различных нейронах была выбрана временная точка 10 минут после обучения. Для анализа экспрессии и активации MAРK/ERK в отдельных нейронах был отработан метод микроварианта Вестерн блот анализа, который позволяет идентифицировать белки 3-4 нервных клеток.

Получено, что спустя 10 минут после обучения значительно возрастает активация MAPK/ERK в нейронах процеребрума, связанных с анализом запахов и в командных нейронах оборонительного поведения правого париетального ганглия ППа(2/3). Следует отметить, что в командных нейронах левого париетального ганглия, ЛПа(2/3), уровень активации MAPK/ERK почти не отличим от уровня контроля (1,01±0,18; p=0,95) (Рис. 7). В нейронах пула Д, которые не входят напрямую в дугу изучаемого рефлекса, достоверного увеличения активации MAPK/ERK не наблюдали. В группе Н уровень активации MAP-киназ ERK достоверно повышается. Функция этих нейронов пока остается невыясненной.

Таким образом, через 10 минут после обучения самые значительные изменения наблюдаются в нейронах, которые вовлечены в формирование оборонительного рефлекса пищевой аверзии: нейронах процеребрума и командных нейронах оборонительного поведения правого париетального ганглия ППа(2/3).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»