WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Эта модель является удобной, так как, с одной стороны, позволяет избежать указанных выше недостатков. С другой стороны, избирательное тромбирование сосудов, создаваемое лазерной коагуляцией, дает возможность, выбирая различные отделы магистральных ретинальных сосудов или их ветвей и изменяя параметры лазерного излучения, создавать как локальную, так и обширную ишемию сетчатки. Предлагаемая нами модель имеет ряд преимуществ. Во-первых, изменение скорости кровотока происходит не в результате длительного (1-2 часа) воздействия, а в доли секунды (время экспозиции лазерного излучения). Это позволяет изучать ишемические нарушения в остром периоде. Во-вторых, модель быстро и легко реализуема при наличии лазерного оборудования и, в-третьих, лазерная коагуляция моделирует такое офтальмологическое заболевание, как тромбоз ретинальных сосудов.

Защитное действие оксида азота от ишемических повреждений клеток сетчатки продемонстрировано нами на описанной выше модели. Показано, что введение нитрита натрия экспериментальным животным до и после лазерного воздействия на сосуды сетчатки приводит к восстановлению диаметра сосудов, и поэтому характерные ишемические повреждения в сетчатке не наблюдаются. Это можно объяснить тем, что нитриты в условиях гипоксии могут восстанавливаться гемсодержащими белками до оксида азота, что приводит к расширению сосудов.

Как уже отмечалось, восстановление нитритов рассматривается рядом авторов как альтернативный источник оксида азота в организме в условиях гипоксии. Предполагается, что восстановление неорганических нитритов до оксида азота происходит на геме гемсодержащих белков, прежде всего, гемоглобина и ксантиноксидазы, которые в условиях гипоксии могут работать как редуктазы. Наиболее убедительно это подтверждается в экспериментах in vitro на выделенных ферментах и культурах клеток. (Rifkind, J.M. 2003, Millar et al., 1998). Следует отметить, что при обсуждении механизма восстановления нитритов гемсодержащими белками основным возражением служит то, что при закислении среды восстановление нитритов до NO in vivo может происходить в результате неферментативной окислительно-восстановительной реакции. Создание гипоксии в любых органах неизбежно приводит к ацидозу. Причиной этого является переход клетки от окислительного фосфорилирования к гликолизу, что сопровождается закислением. Однако этот процесс требует времени. Так, в мозге – структуре наиболее близкой к сетчатке, закисление происходит лишь через 15 минут после создания экспериментальной ишемии (Shimizu et al., 1993).

Очевидно, что в наших экспериментах ацидоз никак не может быть причиной восстановления нитрита до NO, которое, судя по быстрой реакции сосуда, происходит за времена менее минуты. Так, проведение коагуляции сосудов после введения животному нитрита натрия не приводило к стойкому тромбированию сосудов, наблюдалось лишь кратковременное сужение сосуда, а затем немедленное восстановление его диаметра. Можно предположить, что при этом возникает кратковременная гипоксия, которая и является условием для быстрого восстановления присутствующего в сосуде нитрита натрия до NO.

На той же модели ишемии сетчатки глаза мы продемонстрировали нейротоксические свойства оксида азота в нервной ткани. В данном случае наиболее адекватными являются модели ишемии сетчатки на крысах, так как у них соотношение ретинального и хориоидального кровоснабжения сетчатки близко к таковому у человека. В нашей работе показано, что апоптоз клеток при ишемических повреждениях сетчатки происходит именно во внутренних слоях сетчатки, которые кровоснабжаются ретинальными сосудами. Отсутствие апоптотических клеток в фоторецепторном слое объясняется тем, что фоторецепторы в значительной степени снабжаются кислородом через хориоидальные сосуды и не страдают от ишемии ретинальных сосудов.

Ранее нами было показано, что предварительное введение экспериментальным животным ингибитора NO-синтазы L-NAME значительно снижает концентрацию эндогенного NO в клетках сетчатки. При лазерной коагуляции ретинальных сосудов введение L-NAME предотвращает развитие апоптоза клеток во внутренних слоях сетчатки. Важно отметить, что апоптоз в этом случае индуцирован исключительно ишемией, тогда как в других моделях дегенерация может быть обусловлена прямым воздействием на нервные клетки сетчатки.

На второй использованной нами модели нейродегенерации сетчатки глаза, вызванной глутаматной интоксикацией, мы показали, что апоптотическая гибель клеток также происходит во внутренних слоях сетчатки. Это объясняется тем, что передача сенсорного сигнала посредством глутамата осуществляется в синаптических слоях, таким образом, избыток глутамата приводит к гибели клеток всех слоёв сетчатки, исключая фоторецеторный.

Каков механизм развития апоптоза в обоих случаях К настоящему времени накоплено немало доказательств того, что оксид азота является необходимым фактором развития апоптоза при дегенеративных нарушениях нервных клеток. Развитие ишемии, как известно, приводит к развитию окислительного стресса в клетках сетчатки и повышению содержания активных форм кислорода (Cuzzocrea et al., 2001). Именно это является, как считается, причиной развития апоптоза. Однако сам по себе супероксид анион-радикал в отсутствие NO не приводит к развитию апоптоза. Интересно отметить, что ингибирование NO-синтазы не только не уменьшает генерацию супероксид-анион радикала, а напротив, увеличивает ее. Так, при работе NO-синтазы электрон с НАДФ-Н последовательно переносится на кислород, затем на аргинин с последующим образованием NO. В присутствии в системе аргинина NO-синтаза работает как синтаза, образуя NO, в отсутствие аргинина – как оксидаза, образуя О2-.

Предполагается, что оксид азота связывается с образовавшимся супероксид-анион радикалом, что приводит к появлению пероксинитрита (ONOO-), который является проапоптотическим фактором и ведёт к гибели клеток. Сам по себе пероксинитрит развития апоптоза не вызывает, а является короткоживущим промежуточным продуктом. Дальнейшее химическое превращение ONOO- выглядит так:

Мы предполагаем, что при глутаматной интоксикации апоптотическая гибель клеток происходит по-другому. Известно, что действие глутамата приводит к активации входного кальциевого тока в клетку, и внутриклеточная концентрация кальция возрастает. NO-синтаза является кальций-зависимым ферментом, и увеличение концентрации кальция в клетке приводит к увеличению продукции оксида азота в клетке, в результате образуется большее количество пероксинитрита, что ведет к развитию апоптоза по уже описанному механизму. Ключевым фактором в этом случае является не увеличение концентрации супероксида, а увеличение концентрации оксида азота.

Интересно отметить, что повышение активности NO-синтазы, опосредованное глутаматом, может происходить и при развитии ишемии. Как известно, ишемия вследствие энергодефицита приводит к изменению потенциала нервных клеток, что в свою очередь может приводить к изменению работы как метаботропных, так и ионотропных глутаматных рецепторов и увеличению внутриклеточной концентрации кальция. Таким образом, глутаматная интоксикация при развитии ишемии также является одним из повреждающих факторов, которые реализуются через образование пероксинитрита.

В экспериментах, когда содержание оксида азота в сетчатке глаза напрямую повышалось введением донора NO (ДНК-Ж с глутатионом) в низких концентрациях, наблюдалось появление апоптотических клеток в сетчатке через сутки после введения препарата. При ведении ДНК-Ж в высоких концентрациях апоптоз клеток в сетчатке не наблюдался. Это можно объяснить тем, что введённый ДНК-Ж связан с глутатионом, который обладает антиоксидантными свойствами. И при увеличении концентрации препарата соответственно увеличивалась и концентрация глутатиона, когда токсическое действие NO уже находилось в насыщении.

Это подтверждает наше предположение о токсичности высокой концентрации оксида азота в нервной ткани, которая возникает при различных нейродегенеративных заболеваниях сетчатки глаза.

Таким образом, снижение внутриклеточной концентрации NO могло бы предотвратить апоптотическую гибель при развитии ретинальных патологий глаза.

Выводы

  1. Впервые разработана оригинальная модель ишемии сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретинальных сосудов.
  2. Установлено, что предварительное введение нитритов в условиях гипоксии приводит к быстрому расширению сосудов, защищает сетчатку от ишемии и вызванной ею апоптотической гибели клеток.
  3. Показано, что ингибирование NO-синтазы предовтращает развитие апоптоза при ретинальной ишемии. Предполагается, что ключевую роль в развитии апоптоза в данной зрительной патологии играет образование пероксинитрита.
  4. Показано, что ингибирование NO-синтазы предотвращает развитие апоптоза при глутаматной интоксикации сетчатки глаза.
  5. Показано, что введение в глаз динитрозильных комплексов железа в количестве 10-7 – 10-8 моль/глаз приводит к развитию апоптоза во внутренних слоях сетчатки.

Список сокращений:

ДНК-Ж – динитрозильный комплекс железа

ЭРГ – электроретинограмма

НС – наружные сегменты

НЯС – наружный ядерный слой

НСС – наружный синаптический слой

ВЯС – внутренний ядерный слой

ВСС – внутренний синаптический слой

ГС – ганглиозный слой

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Г.Р. Каламкаров, И.В. Цапенко, М.В. Зуева, А.Н. Иванов, С.В. Резвых, Т.С. Константинова, Т.Ф. Шевченко. Нитриты способны расширять сосуды при гипоксии и защищать сетчатку от ишемии. Докл. Академии наук, 2007, Т. 417, № 2, С. 1-3.

2. Г.Р. Каламкаров, Т.Ф. Шевченко, Т.С. Константинова, М.А. Островский, А.В. Агеев, С.А. Кочергин, Л.К. Мошетова. Прогнозирование развития офтальмологических патологий с помощью выявления специфических антител сетчатки. Технологии живых систем. 2007, Т. 4, № 5-6, С. 11-19.

3. Г.Р. Каламкаров, И.В. Цапенко, М.В. Зуева, А.Н. Иванов, Т.С. Константинова, А.Е. Бугрова, С.В. Резвых, А.А. Федоров, Т.Ф. Шевченко. Экспериментальная модель острой ишемии сетчатки глаза у крыс. Бюлл. эксп. биологии и медицины. 2008, № 6, С. 634-638.

4. Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский, А.Е. Бугрова, Т.Ф. Шевченко, Т.С. Константинова. Разработка иммунологических методов выявления глазных патологий; роль оксида азота в дегенерации сетчатки глаза. «Фундаментальные науки – медицине», Москва. Декабрь 2007, С. 60.

5. Константинова Т.С., Каламкаров Г.Р., Цапенко И.В., Зуева М.В.,. Иванов А.Н, Шевченко Т.Ф. Нитриты могут быть источником оксида азота в условиях гипоксии и защищать сетчатку глаза от ишемии. Международная молодёжная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика». Сборник статей. Москва. Ноябрь. 2006 г. С. 135-136.

6. Константинова Т.С., Каламкаров Г.Р., Цапенко И.В., Зуева М.В.,. Иванов А.Н, Шевченко Т.Ф. Роль оксида азота в развитии дегенеративных заболеваний сетчатки глаза. Международная молодёжная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика». Сборник статей. Москва. Ноябрь. 2007 г. С 57-58.

7. Константинова Т.С., Цапенко И.В., Зуева М.В., Иванов А.Н., Бугрова А.Е., Шевченко Т.Ф., Каламкаров Г.Р. Участие оксида азота в развитии апоптоза клеток сетчатки при ишемии. Международная молодёжная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика». Сборник статей. Москва. Ноябрь. 2008, С. 109-113.

8. Каламкаров Г.Р., Бугрова А.Е., Константинова Т.С., Шевченко Т.Ф., Зуева М.В., Цапенко И.В., Иванов А.Н. Молекулярные механизмы протекторного и нейротоксического действия оксида азота при развитии ретинальных патологий. Актуальные вопросы нейроофтальмологии. Сборник статей. Москва. 2009, С. 14-15.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»