WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Нитрит натрия вводили крысам внутрибрюшинно за 15 минут до лазерного воздействия в количестве 20 мг/кг массы. При этом лазерное воздействие создавало нестойкий эффект: через сутки после лазерного воздействия на сосуды происходило их полное восстановление.

Иммуногистохимическим методом TUNEL было показано, что предварительное введение нитрита натрия животным приводило к значительному снижению количества TUNEL-положительных ядер в ганглиозном слое и защищало от апоптоза клетки внутреннего ядерного слоя (рис. 9).

НС

ВЯС

НСС

ВЯС

ВСС

ГС

Рис. 9. Защитный эффект нитритов при ишемии сетчатки: а - контроль; б - апоптоз клеток при ишемии; в - сетчатка после лазерной коагуляции на фоне предварительного введения нитрита натрия. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра сетчатки.

При предварительном введении нитрита натрия до лазерной коагуляции сосудов сетчатки количество апоптотических клеток в ганглиозном слое сетчатки снижалось на 66%, а во внутреннем ядерном слое - на 50% (рис. 10).

Рис. 10. Количество апоптотических ядер в сетчатке при ишемии и введении нитрита натрия.

Важно отметить, что изменения затрагивали, главным образом, внутренние отделы сетчатки (до внутреннего ядерного слоя), которые кровоснабжаются ретинальными сосудами. В наружных отделах, которые питаются из слоя хориокапилляров (слой наружных сегментов фоторецепторов, наружный ядерный слой), видимых морфологических изменений не обнаружено.

4. Роль оксида азота в механизме развития апоптоза при ишемии сетчатки

Известно, что гибель нервных клеток мозга и сетчатки при некоторых патологиях происходит апоптотическим путем при участии оксида азота. Естественно предполагать, что и при развитии ишемии оксид азота может быть индуктором развития апоптоза. Ранее было установлено, что введение животным конкурентного ингибитора NO-синтазы L-NAME приводит к существенному снижению концентрации оксида азота в клеточных слоях сетчатки и таким образом можно предполагать, что введение этого ингибитора будет влиять на развитие апоптоза.

Для подтверждения этого экспериментальным животным вводили ингибитор NO-синтазы L-NAME. Внутрибрюшинное введение этого препарата в количестве 20 мг/кг массы снижало концентрацию оксида азота в клетках сетчатки, и пероксинитрит не образовывался. При предварительном введении L-NAME за 15 минут до лазерного воздействия на ретинальные сосуды апоптотические клетки во внутренних слоях сетчатки не выявлялись (рис. 11).

НС

НЯС

НСС

ВЯС

ВСС

ГС

Рис. 11. Защитный эффект L-NAME при ишемии сетчатки: а – контроль, б – апоптоз клеток сетчатки при ишемии, в - сетчатка после лазерной коагуляции на фоне предварительного введения L-NAME. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра сетчатки.

Лазерная коагуляция сосудов сетчатки глаза приводит к гибели 50% клеток ганглиозного слоя и 30% клеток внутреннего ядерного слоя (ВЯС) сетчатки. При предварительном введении препарата L-NAME крысам лазерное воздействие на ретинальные сосуды приводит к гибели всего 20% ганглиозных клеток и 15% клеток ВЯС от общего числа клеток (рис. 12).

Рис. 12. Количество апоптотических ядер в сетчатке крысы при ишемии и при введении ингибитора NO-синтазы L-NAME.

Можно сделать вывод, что ингибитор NO-синтазы L-NAME защищает клетки сетчатки от апоптоза при ишемии. Таким образом, оксид азота является необходимым элементом развития апоптоза в клеточных слоях сетчатки.

  1. Повреждение сетчатки глаза крыс при глутаматной интоксикации

Глутаматная интоксикация может являться одной из ступеней длинной цепи ишемического повреждения (Louzada-Junior et al., 1992), но может происходить и независимо от ишемии при различных дегенеративных нарушениях. В работе нами исследовалось влияние повышения концентрации глутамата на возникновение нейродегенеративных нарушений в сетчатке и роль оксида азота в этих процессах.

NMDA (агонист глутамата) вводили непосредственно в глаз экспериментальным животным в количестве 200 нмоль/глаз. И уже через сутки методом TUNEL можно было выявить апоптотические ядра во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток сетчатки (рис. 13). Введение NMDA приводит к апоптотической гибели 60% ганглиозных клеток от общего числа клеток ганглиозного слоя и 50% клеток внутреннего ядерного слоя от общего числа клеток этого слоя.

НС

НЯС

НСС

ВЯС

ВСС

ГС

Рис. 13. Структурные изменения клеток сетчатки после введения NMDA: а – контроль, б – через 24 часа после введение NMDA. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра.

ЭРГ также ясно свидетельствует о снижении функциональной активности во внутренних слоях сетчатки: наблюдается уменьшение амплитуды b-волны на 50% от нормы (рис. 14). Известно, что передача сенсорного сигнала от фоторецепторов к последующим слоям сетчатки осуществляется посредством глутамата. Введение агониста глутамата NMDA приводит к блокированию этой передачи и увеличению концентрации глутумата в синаптической щели. Это приводит к тому, что ответы фоторецепторных клеток сохраняются, а ответы более глубоких слоев сетчатки значительно уменьшаются. Именно такая картина наблюдается и при электроретинографических исследованиях. Как видно, а-волна ЭРГ, которая обусловлена электрической активностью фоторецепторов, практически не изменяется, а b-волна, основной вклад в которую вносят ответы биполярных клеток, существенно уменьшена

Рис. 14. Запись электроретинограммы крысы.

а - ЭРГ контрольного животного, б - ЭРГ того же глаза через 1 сутки после введения NMDA.

Введение NMDA приводило к развитию апоптоза в клеточных слоях сетчатки. Так, через 24 часа после введения апоптотические ядра обнаруживались во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток, то есть именно в тех слоях, где медиаторная роль глутамата установлена.

Для того чтобы выяснить, по какому пути идёт гибель клеток, в стекловидное тело глаза вместе с NMDA вводили ингибитор NO-синтазы L-NAME (0,1 мг/глаз). При этом количество апоптотических ядер в сетчатке резко снижалось (рис. 15).

НС

НЯС

НСС

ВЯС

ВСС

ГС

Рис. 15. Защитный эффект L-NAME при глутаматной интоксикации сетчатки: а – контроль, б – 24 часа после введения NMDA, в – 24 часа после введения NMDA и L-NAME. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра сетчатки.

Введение L-NAME вместе с NMDA в стекловидное тело глаза приводило к снижению количества апоптотических ядер во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток на 50% и 70%, соответственно (рис. 16).

Рис. 16. Количество апоптотических ядер в сетчатке глаза крысы при введении NMDA и ингибитора NO-синтазы L-NAME.

  1. Повреждение сетчатки крысы при повышении концентрации оксида азота

(Эксперименты проводились совместно с А.Ф. Ваниным)

Для подтверждения предположения, что в разработанных нами экспериментальных моделях глазных патологий именно высокая концентрация NO является токсическим фактором, нам требовалось создать 20-кратный избыток NO в сетчатке. Для этого мы вводили в глаз донор оксида азота динитрозильный комплекс железа с глутатионом (ДНК-Ж). Динитрозильные комплексы железа в тканях животных и человека продуцируют свободные молекулы оксида азота и могут функционировать в качестве эндогенных универсальных регуляторов биохимических и физиологических процессов. ДНК-Ж обеспечивают стабилизацию и перенос NO в биосистемах. Так как компоненты этого комплекса уже содержатся в системе, то его введение не является токсичным для клеток сетчатки. Ниже приведена структурная формула ДНК-Ж с глутатионом и распад этого соединения на составляющие компоненты с образованием оксида азота.

GSH-S- NO+…..RS-

Fe+ Fe2+ + NO + RS-NO

GSH-S- NO+…..RS-

Введение в стекловидное тело глаза крыс динитрозильного комплекса железа с глутатионом (10-5–10-8 моль/глаз) через сутки приводило к появлению апоптотических ядер в сетчатке. Методом TUNEL было выявлено, что апоптозу подверглись клетки внутреннего ядерного и ганглиозного слоев сетчатки (рис. 17). При этом апоптоз был выявлен только при введении ДНК-Ж в дозах 10-7 и 10-8 моль/глаз. А при введении большего количества препарата (10-6 и 10-5 моль/глаз) TUNEL-положительные ядра в сетчатке выявить не удалось.

НС

НЯС

НСС

ВЯС

ВСС

ГС

Рис. 17. Введение ДНК-Ж в стекловидное тело глаза крысы: а – контроль, б – ДНК-Ж, 10-5 моль/глаз, в – ДНК-Ж, 10-6 моль/глаз, г – ДНК-Ж, 10-7 моль/глаз, д – ДНК-Ж, 10-8 моль/ глаз. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра сетчатки.

При введении ДНК-Ж в количестве 10-7 моль/глаз количество апоптотических клеток в ганглиозном слое сетчатки увеличилось на 30% от нормы (рис. 18). При введении препарата в количестве 10-8 моль/глаз апоптозу подверглось до 70% клеток ганглиозного слоя сетчатки от общего количества клеток. При этом клетки внутреннего ядерного слоя подвергались апоптозу в незначительной степени и составили всего 15% от нормы.

Рис. 18. Количество апоптотических ядер в сетчатке глаза крысы при введении ДНК-Ж.

Таким образом, введение донора оксида азота ДНК-Ж в низких дозах приводит к апоптозу клеток сетчатки экспериментальных животных, так как избыток NO в ткани ведёт к образованию пероксинитрита, а, следовательно, и к гибели клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Действие оксида азота двояко: с одной стороны, он защищает сосуды от ишемии, так как он является сосудорасслабляющим фактором, с другой стороны, при дегенеративных нарушениях сетчатки он взаимодействует с активными формами кислорода, что приводит к образованию пероксинитрита – сильнейшего токсического фактора, который действует на митохондрии и индуцирует развитие апоптоза клеток. Поэтому нас интересовало, во-первых, участие NO в патологии, так как он играет нейротоксическую роль, во-вторых, - защитное действие оксида азота при патологии.

Для изучения обоих свойств оксида азота нами были разработаны модели ишемии и глутаматной интоксикации сетчатки глаза на экспериментальных животных.

Существует несколько методик создания экспериментальной ишемии, из которых наиболее распространенными являются искусственное повышение внутриглазного давления (Buchi E.R. et al., 1991) или наложение лигатуры на сосуды в районе зрительного нерва (Otori Y. et al., 1997). Каждый из этих подходов имеет свои недостатки. Так, для повышения внутриглазного давления требуется жесткая фиксация иглы, через которую создается повышенное давление на длительное время (до 1 часа). Этот метод очень чувствителен к любым механическим воздействиям, что делает результаты нестабильными. Кроме того, повышение внутриглазного давления неизбежно ведет к дегенерации ганглиозных клеток, которая может быть обусловлена и не ишемией. Во втором случае, при наложении лигатуры, неизбежно повреждаются не только сосуды, но и зрительный нерв, что приводит к независимым от ишемии дополнительным патологическим изменениям в сетчатке (Masurawa K. et al., 2006). Таким образом, имеющиеся модели не могут дифференцировать гибель клеток сетчатки, вызванную ишемией, от гибели клеток, обусловленной независимой от ишемии дегенерацией клеток сетчатки. Понимание отличий этих механизмов патогенеза принципиально важно как для поиска перспективных лекарственных средств, так и для выбора правильной стратегии лечения. Так, антиишемические средства могут и не предотвращать гибель нейронов, вызванную другими причинами.

Избежать этих недостатков в модели можно путем непосредственного локального воздействия лазерного излучения на магистральные ретинальные сосуды, что вполне выполнимо, поскольку они хорошо видны и доступны для лазерной коагуляции.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»