WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Для выяснения возможного действия нитритов на сетчатку глаза и ретинальные сосуды нитрит натрия вводили животным как до, так и после проведения лазерной коагуляции.

В том случае, когда нитрит натрия вводили кролику в течение 15 минут после лазерной коагуляции в количестве 20 мг/кг массы, наблюдается восстановление кровенаполнения сосудов непосредственно за зоной лазерного воздействия (рис. 1в). В самих поврежденных сосудах начинается восстановление кровообращения. Таким образом, введение нитрита натрия на фоне гипоксии приводит к быстрому расслаблению сосудов, что свидетельствует о том, что в условиях ишемии нитрит быстро восстанавливается до оксида азота.

Рис. 1. Действие нитрита натрия на сосуды глазного дна после лазерной коагуляции.

а - фотография глазного дна кролика до лазерной коагуляции (стрелка указывает место последующего лазерного воздействия); б – то же сразу после лазерной коагуляции, в – то же, что «б» через 15 минут после введения нитрита натрия.

В контрольных экспериментах было показано, что введение нитрита животному без лазерного воздействия не приводит к значительному расширению сосудов, что свидетельствует о том, что восстановление нитрита до оксида азота может происходить, как и предполагалось, только в условиях недостатка кислорода.

В следующей серии экспериментов мы попытались выяснить, насколько предварительное введение нитритов может предотвращать сужение сосудов. В этих экспериментах животному сначала вводили нитрит натрия (20 мг/кг), а затем, через 15 минут, производили лазерную коагуляцию и наблюдали за изменением сосудов глазного дна (рис. 2).

Рис. 2. Введение нитрита натрия предотвращает развитие ишемии сетчатки при лазерной коагуляции сосудов. а – фотография глазного дна кролика после введения нитрита (до лазерной ишемии), (стрелка указывает место последующего лазерного воздействия); б - то же сразу после лазерного воздействия на фоне предварительного введения препарата.

В этом случае лазерное воздействие создавало не стойкий, а лишь кратковременный спазм сосуда с быстрым последующим восстановлением кровенаполнения и проводимости сосуда.

Таким образом, можно заключить, что нитрит натрия в условиях острой гипоксии приводит к почти мгновенному расширению сосудов, что и делает лазерную коагуляцию неэффективной. Можно предполагать, что в условиях гипоксии, когда нитриты могут связываться с гемом гемсодержащих белков, может происходить их восстановление до оксида азота в концентрациях, достаточных для быстрого и полного расслабления сосудов.

2.1. Регистрация электроретинограммы при ишемии сетчатки глаза кроликов

Известно, что ишемия сетчатки, вызванная недостаточным кровоснабжением через ретинальные сосуды, сопровождается характерными изменениями в картине фотоэлектрической активности сетчатки – электроретинограмме. Использование ЭРГ позволило оценить действие нитритов на ретинальные сосуды по изменению электрической реакции сетчатки глаза, то есть независимым методом. Измерение выполнялось сразу после лазерной коагуляции, после введения препарата на фоне лазерного воздействия и после лазерного воздействия на фоне предварительного введения нитрита натрия.

Лазерная коагуляция сосудов сетчатки приводила к резкому снижению амплитуд а- и b- волн ЭРГ (рис.3). Введение нитрита натрия в количестве 20 мг/кг массы через 15 минут после лазерной коагуляции приводило к более быстрому восстановлению а- и b- волн ЭРГ. Наибольший положительный эффект препарата был выявлен при его введении до создания лазерной ишемии сетчатки, где не наблюдалось угнетения биопотенциалов.

Глиальный индекс КГ, рассчитываемый по отношению амплитуд b-волны ЭРГ и РЭРГ (12 Гц), равнялся 1,8 при норме 2,3-2,5 относительных единиц. Известно, что возрастание глиального индекса, отражающее активизацию метаболизма клеток Мюллера, является характерным признаком ретинальной ишемии. Однако, при острых нарушениях кровообращения в бассейне центральной артерии сетчатки, b-волна ЭРГ быстрее реагирует на гипоксию сетчатки, связанную с сосудистой катастрофой, чем низкочастотная РЭРГ. Поэтому опережающее снижение амплитуды b-волны ЭРГ сразу после лазерной коагуляции сосудов приводит к снижению КГ, отражая значительные нарушения в сетчатке. Действительно, клинические наблюдения свидетельствуют о развитии обтурации, кровотечения и запустения сосудов после лазерного воздействия и последующей острой ишемии сетчатки.

Рис. 3. Динамика изменения амплитуд волн ЭРГ при действии нитритов.

а – амплитуда a- волны ЭРГ, б – амплитуда b-волны ЭРГ.

– амплитуды а- и b- волн ЭРГ до проведения операции. – то же через 15 мин после проведения лазерной коагуляции. – амплитуды а- и b- волн в том случае, когда через 15 мин после проведения лазерной коагуляции животному вводилcя нитрит натрия. – амплитуда волны в том случае, когда лазерная коагуляция проводилась через 15 мин после введения нитрита натрия.

Таким образом, полученные двумя независимыми методами (ЭРГ и офтальмоскопия) результаты показывают, что введение нитритов экспериментальным животным защищает сетчатку от острой ишемии. Такое действие, по-видимому, обусловлено тем, что при недостатке кислорода in vivo нитрит натрия может восстанавливаться до оксида азота в концентрациях, достаточных для полного расслабления сосудов.

3. Модель ишемии сетчатки глаза на крысах

Модель ишемии сетчатки глаза на кроликах в некоторых экспериментах очень удобна, т.к. сосуды глаза хорошо видны, и для регистрации ЭРГ эти животные не требуют адаптации к темноте. Однако кровоснабжение сетчатки кролика отличается от кровоснабжения сетчатки человека. У кроликов 2/3 сетчатки питается от хориоидальных сосудов, которые снабжают наружные слои сетчатки. И всего 1/3 сетчатки питается от ретинальных сосудов, которые распадаются на капилляры в пределах ганглиозного слоя и слоя нервных волокон.

В то время как у человека, наоборот, только 1/3 сетчатки питается от хориоидальных сосудов и 2/3 – от ретинальных. Важно отметить, что основной причиной патологий человека является ишемия, вызванная нарушениями именно в ретинальных сосудах. Наиболее близким объектом является крыса, у которой кровоснабжение сетчатки осуществляется, как и у человека. Кроме того, сетчатка крысы является хорошо изученным гистологическим объектом, что позволяет использовать эту модель для применения гистологических и иммуногистохимических методов выявления апоптоза на ранних стадиях. Поэтому перед нами стояла задача разработать новую модель ишемии сетчатки глаза на крысах. Ишемию создавали при помощи лазерного воздействия именно на ретинальные сосуды, так же, как и в предыдущих экспериментах.

3.1. Исследование глазного дна крыс после лазерной коагуляции.

При офтальмоскопии сразу после лазерной коагуляции отмечалось резкое сужение магистральных сосудов с полной или почти полной остановкой кровотока, сохраняющейся на протяжении нескольких минут, после чего кровоток частично восстанавливался, но просвет сосуда оставался значительно суженным.

На следующий день после коагуляции на глазном дне у некоторых крыс наблюдалась стушеванность границ диска зрительного нерва из-за отека окружающей сетчатки, суженные артерии, местами до полной их непроходимости, кровоток в них становился прерывистым. Некоторое расширение вен, по-видимому, было обусловлено одновременным нарушением венозной гемодинамики в результате распространения коагулирующего действия лазерного излучения на стенку расположенного рядом магистрального венозного сосуда.

Рис. 4. Фотография глазного дна экспериментальной крысы.

а - до лазерного воздействия. Глазное дно - в норме: сосуды - нормального калибра, центральные отделы глазного дна - без изменений; б - сразу после лазерного воздействия: лазерные коагуляты почти полностью перекрыли 2 магистральных сосуда (стрелка 1), что привело к развитию периваскулярного отека сетчатки; в – через сутки после лазерного воздействия: в зоне воздействия отек сетчатки сохраняется, наблюдается сужение сосудов (стрелка 2) и компенсаторное расширение расположенных рядом ретинальных сосудов (стрелка 3).

Через сутки после лазерной коагуляции в результате тромбоза магистральных ретинальных сосудов отмечались достаточно выраженные гемодинамические нарушения в ретинальной системе микроциркуляции, приводящие к ишемии внутренних слоев сетчатки.

3.2. Регистрация электроретинограмы при ишемии сетчатки глаза крыс

Стойкие гемодинамические нарушения в системе ретинального кровотока через сутки приводили к электрофизиологическим изменениям в сетчатке, характерным для ишемии. Для оценки степени развития ишемии сетчатки широко используется соотношение амплитуд b- и а- волн ЭРГ - индекс b/a (Нероев В.В. и др., 2004). а-волна ЭРГ характеризует функциональную активность фоторецепторных клеток, b-волна – внутренних слоев сетчатки, прежде всего, биполярных клеток. На следующий день после лазерной коагуляции сосудов амплитуда b-волны ЭРГ снижалась на 40-70% от исходных значений (рис. 5). Угнетение a-волны ЭРГ отмечалось через сутки не у всех животных. В тех случаях, когда амплитуда a-волны снижалась, угнетение b-волны было более значительным. Изменения b-волны развиваются, как правило, раньше угнетения а-волны и являются более выраженными из-за ухудшения трофики нейронов внутреннего ядерного слоя сетчатки при нарушениях ретинальной циркуляции. В нашем исследовании при развитии острой ишемии сетчатки коэффициент b/a резко снижался – до 1,0-2,0 отн. единиц при его нормальных значениях у крыс 3,3-4,8 ед.

Рис. 5. Запись электроретинограммы крысы.

а - ЭРГ интактного животного, б - ЭРГ того же глаза через 1 сутки после лазерной коагуляции ретинальных сосудов.

3.3. Гистологические и иммуногистохимические исследования сетчатки глаз крыс после лазерного воздействия

Данные электроретинографических исследований подтверждаются гистологическими результатами. Нарушение кровотока в ретинальных сосудах вследствие их тромбирования уже через сутки приводили к ишемическим повреждениям во внутренних слоях сетчатки глаза (рис. 6). Типичными проявлениями ишемического повреждения были кровоизлияния, микрокистовидные изменения в слое нервных волокон, отек ганглиозных клеток, локальное уменьшение плотности нейронов в слое биполярных клеток. Следствием периваскулярного отека явилось истончение и микроразрывы внутренней пограничной мембраны, через которые происходила миграция мононуклеарных клеток крови из просвета сосуда в корковые отделы прилежащего стекловидного тела.

Рис. 6. Гистологическое исследование сетчатки крысы.

а – контроль; б – через сутки после лазерной коагуляции сосудов. НЯС - наружный ядерный слой, НСС - наружный синаптический слой, ВЯС - внутренний ядерный слой, ВСС - внутренний синаптический слой, ГС - ганглиозный слой. Стрелками на рисунке указаны: 1 - тромбоз ретинальной артериолы, 2 - уменьшение плотности нейронов в слое биполярных клеток, 3 - отек ганглиозных клеток. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.х400.

Таким образом, результаты наших электрофизиологических и гистологических исследований позволяют заключить, что лазерная коагуляция ретинальных сосудов приводит к развитию характерных ишемических изменений в сетчатке.

Для подтверждения того, что гибель клеток идёт по апоптотическому пути, был применён метод TUNEL. Данным методом были выявлены TUNEL-положительные ядра в ганглиозном слое уже через 6 часов после лазерного воздействия на сосуды (рис. 7). Также наблюдался апоптоз амакриновых и ганглиозных клеток через 18 и 24 часа после лазерной коагуляции.

НС

НЯС

НСС

ВЯС

ВСС

ГС

Рис. 7. Выявление апоптотических клеток в сетчатке при ишемии: а - контроль; б - 6 часов после лазерной коагуляции; в - 9 часов после лазерной коагуляции; г - 24 часа после лазерной коагуляции. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра сетчатки.

При лазерной коагуляции ретинальных сосудов наибольшее количество апоптотических ядер в ганглиозном слое выявлено через 24 часа после тромбирования сосудов (60 % от общего числа клеток) (рис. 8). Максимальное количество TUNEL-положительных ядер во внутреннем ядерном слое (ВЯС) было обнаружено уже через 9 часов после лазерного воздействия.

Рис. 8. Зависимость образования апоптотических ядер в сетчатке глаза крысы при ишемии от времени.

3.4. Действие нитритов на клетки сетчатки глаза крысы при ишемии

Понимание молекулярного механизма гибели клеток при патологии особенно важно при попытках фармакологически предотвратить их гибель. Известно, что гибель нервных клеток при развитии ишемии может идти апоптотическим путем. Можно предполагать, что поскольку повышенная концентрация нитритов в сосудах защищала сетчатку от появления признаков ишемии, то этот механизм должен предотвращать и развитие апоптоза клеток сетчатки.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»