WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

Дата размещения: 26 - 05 – 2009

ОБЪЯВЛЕНИЕ О ЗАЩИТЕ КАНДИДАТСКОЙ ДИССЕРТАЦИИ

КОНСТАНТИНОВА ТАТЬЯНА СЕРГЕЕВНА

ПРОТЕКТОРНОЕ И НЕЙРОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ОКСИДА АЗОТА В МОДЕЛЯХ ЗРИТЕЛЬНЫХ ПАТОЛОГИЙ

03.00.02 – биофизика

Биологические науки

Диссертационный совет Д 002.039.01

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики

им. Н.М. Эмануэля РАН

119334 г. Москва, ул. Косыгина, д. 4

Тел. +7 (495) 939 74 00

e-mail:ibcp@ sky.chph.ras.ru

Предполагаемая дата защиты: 01 июля 2009 г.

Автореферат Константиновой Т.С.

На правах рукописи

КОНСТАНТИНОВА Татьяна Сергеевна

ПРОТЕКТОРНАЯ И НЕЙРОТОКСИЧЕСКАЯ РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В МОДЕЛЯХ ЗРИТЕЛЬНЫХ ПАТОЛОГИЙ

03.00.02 – биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Каламкаров Григорий Рафаэлевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Петренко Юрий Михайлович

доктор биологических наук

Дудник Людмила Борисовна

Ведущая организация: ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи

Защита состоится «01» июля 2009г. в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.039.01 в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 117977, Москва, ул. Косыгина, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН

Автореферат разослан «__» ________ 2009г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 002.039.01

кандидат химических наук М.А. Смотряева

Общая характеристика работы

Актуальность работы.

Оксид азота играет ключевую роль в регуляции самых разных биологических функций. Известно также, что оксид азота играет важную роль в развитии патологий сетчатки и зрительного нерва. В сетчатке глаза относительно высокая концентрация оксида азота обнаруживается в двух слоях – во внутренних сегментах фоторецепторного слоя и слое ганглиозных клеток. Оксид азота является регулятором синаптической передачи, одним из медиаторов которой является глутамат.

Сетчатка глаза находится в тесном контакте с ретинальными сосудами, которые проходят через все внутренние слои сетчатки и снабжают их кислородом и необходимыми метаболитами. Оксид азота, являясь сосудорасслабляющим фактором, регулирует состояние сосудов как в норме, так и при патологиях и, следовательно, оказывает значительное влияние на работу всех элементов сетчатки. Это особенно важно в условиях гипоксии, когда недостаток кислорода приводит к развитию ишемии сетчатки – причины многочисленных офтальмологических заболеваний.

С другой стороны, известно, что оксид азота может играть и нейротоксическую роль, приводя к апоптозу нервных клеток. Предполагаемой причиной такого действия является взаимодействие оксида азота с супероксид-анион радикалом с образованием пероксинитрита. Пероксинитрит может разлагаться с образованием гидроксильного радикала – сильного токсического агента, приводящего, среди прочего, к апоптотической гибели клеток.

В данной работе нами исследованы оба механизма действия оксида азота – как нейропротекторного фактора, защищающего сетчатку глаза от ишемии, так и нейротоксического фактора, вызывающего апоптотическую гибель клеток.

Для изучения защитных и нейротоксических свойств оксида азота нами была разработана модель ишемии сетчатки глаза на экспериментальных животных. Изучение ишемии сетчатки важно для понимания патогенеза таких связанных с сосудистой недостаточностью заболеваний, как окклюзия ретинальной артерии, глаукома, макулярная дегенерация и др. (Osborne N.N. et al., 2004). Мы создавали ишемию сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретинальных сосудов. Такое воздействие, с одной стороны, позволяет резко снизить концентрацию кислорода непосредственно в сосудах и наблюдать за изменением их диаметра при действии нитритов в условиях недостатка кислорода in vivo, с другой стороны, как следствие, вызывать развитие ишемии сетчатки и по состоянию сетчатки оценить степень ее кровоснабжения. Кроме того, такая модель не затрагивает прямо нервные элементы сетчатки.

Оксид азота продуцируется в клетке ферментом NO-синтазой, основным субстратом которой является аргинин. До последнего времени аргинин считался, по существу, единственным источником оксида азота в организме. В последние годы внимание многочисленных исследователей привлек процесс восстановления нитритов до оксида азота и таким образом нитриты также могли бы оказаться источником оксида азота. Предполагается, что нитриты могут восстанавливаться до оксида азота гемсодержащими белками. Особенно активно этот процесс будет происходить в условиях пониженной концентрации кислорода, когда образующийся оксид азота, во-первых, не окисляется до диоксида, а, во-вторых, может связываться с гемом белка, занимая сайт связывания кислорода.

В данной работе мы показали, что такой процесс может происходить в ретинальных сосудах in vivo, причем, за времена порядка минуты. Продемонстрировано, что восстановленный из нитрита оксид азота действует как фактор расслабления сосудов и защищает сетчатку глаза от ишемии.

Целью настоящей работы являлось установить роль и химические механизмы действия оксида азота как нейропротекторного и нейротоксического факторов при развитии патологий в сетчатке глаза.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

  1. Создать адекватные модели зрительных патологий на экспериментальных животных (ретинальная ишемия и глутаматная интоксикация сетчатки глаза).
  2. Выяснить, участвует ли оксид азота в развитии нейродегенерации при ишемии сетчатки глаза и является ли он проапоптотическим фактором.
  3. Создать модель, позволяющую наблюдать изменения отдельного сосуда сетчатки при гипоксии на экспериментальных животных.
  4. Выяснить возможность восстановления нитритов до оксида азота в ретинальных сосудах при ишемии сетчатки.
  5. Выяснить, может ли введение нитритов вызывать расширение сосудов и таким образом защищать сетчатку от ишемии в условиях гипоксии в разработанной нами модели ретинальной ишемии.
  6. Исследовать нейротоксическое действие избытка оксида азота на клетки сетчатки глаза.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Модель ишемии сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретинальных сосудов.
  2. Введение нитритов в условиях гипоксии приводит к быстрому расширению сосудов, защищает сетчатку от ишемии и вызванной ею апоптотической гибели клеток.
  3. Ингибирование NO-синтазы предотвращает развитие апоптоза при ишемии и глутаматной интоксикации сетчатки глаза.

Диссертационная работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН в соответствии с планами научно-исследовательских работ Института в рамках программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки – медицине».

Научно-практическая значимость. Результаты проведенных исследований имеют важное теоретическое и практическое значение для понимания роли оксида азота при развитии нейродегенеративного процесса, вызванного ишемией. Данные об участии оксида азота в развитии патологических заболеваний сетчатки глаза ставят вопрос о новых стратегиях лечения таких ишемических заболеваний сетчатки глаза, как глаукома, диабетическая ретинопатия и др. Нами разработана модель, позволяющая отличить патологическое действие гипоксии от патологического действия повышения внутриглазного давления, вызывающего дегенерацию нервных клеток. На этой модели показано, что оксид азота является необходимым элементом в развития апоптоза, вызванного исключительно ишемическим повреждением. Это принципиально важно для разработки лекарственных средств и понимания механизмов возникновения ряда зрительных патологий. Обнаруженный нами защитный эффект нитритов при развитии ишемии вследствие гипоксии имеет важное значение для разработки антиишемических средств лечения глазных патологий.

Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследований – от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.

Апробация диссертации и публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 8 печатных работах, из них 3 - статьи в отечественных журналах и 5 тезисов докладов. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах: «Фундаментальные науки – медицине», Москва. Международная молодежная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика», Москва. «Актуальные вопросы нейроофтальмологии», Москва.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 90 стр., включая 21 рисунок, 1 таблицу и список литературы. Диссертация состоит из введения, описания объектов, материалов и методов исследования, глав «Обзор литературы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов исследования», выводов, списка аббревиатур и библиографического указателя (102 источника).

Содержание диссертации

1. Объекты, материалы и методы исследования

Основным предметом исследования являлись NO-синтаза, оксид азота, сетчатка глаза, ишемия сетчатки глаз экспериментальных животных.

Биофизические и гистохимические методы.

Для гистологического исследования сетчатки крыс глаза фиксировали в 10% нейтральном формалине 12 часов и использовали для приготовления парафиновых срезов согласно стандартному протоколу (Sennlaub F. et al., 2002). Срезы толщиной 5 мкм приклеивали на стёкла с адгезивным покрытием (Silane-Prep Slides, Sigma) и после депарафинирования окрашивали гематоксилином и эозином.

Для иммуногистохимического исследования депарафинированные срезы обрабатывали методом TUNEL (Terminal desoxynucleotidyl transferase – mediated desoxyuridine triphosphate (UTP) – nick end – labeling) для выявления апоптотичесих клеток (набор реактивов «Apoptag» («Chemicon», США)). Метод основан на выявлении свободных 3’-ОН концевых групп ДНК путем их химического мечения модифицированными нуклеотидами, которые выявляются иммунопероксидазным методом. В качестве субстрата для пероксидазы использовали диаминобензидин (DAB). После реакции для дополнительной прокраски ядер срезы обрабатывали 0,5% метиловым зеленым.

Электроретинограмму (ЭРГ) регистрировали с помощью установки EYE Handheld ERG Unit Mjolner (Ephios, Швеция). Выполняли регистрацию ганцфельд ЭРГ в ответ на одиночную стимуляцию и ритмическую (РЭРГ), стимуляцию с частотой 12 и 32 Гц стандартными вспышками.

Принцип метода заключается в регистрации потенциалов клеток сетчатки в ответ на освещение. Оценку электрической активности сетчатки проводили по амплитуде а- и b- волн ЭРГ. a-волна – негативная волна, отражающая функциональную активность фоторецепторов, b-волна – позитивная волна, отражающая электрическую активность биполяров и мюллеровских клеток с возможным вкладом горизонтальных и амакриновых клеток.

Работа с животными. В работе использовали кроликов породы Шиншилла и крыс линии Wistar, содержавшихся в виварии при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище.

Крыс наркотизировали хлоралгидратом (250 мг/кг).

Ишемию создавали путём лазерной коагуляции сосудов сетчатки глаз крыс, для этого использовали лазер Visuals Kombi II фотокоагуляционного типа (аргоновый лазер), позволяющий создавать обтурацию сосудов под офтальмоскопическим контролем. Параметры воздействия составляли: средняя мощность излучения 200-300 мВт, диаметр пятна 100-200 мкм, длительность импульса 0,1 – 0,2 сек. Проводилась коагуляция сосудов I порядка на всем их протяжении в зоне диаметром 1/2 размера диска зрительного нерва.

Для создания ишемии сетчатки глаза кроликов проводилась лазерная коагуляция сосудов первого и второго порядка с окружающей сетчаткой. Энергия воздействия 0,4-1 Вт.

Нитрит натрия вводили внутрибрюшинно в физиологическом растворе (20 мг/кг массы) крысам и кроликам за 15 минут до лазерного воздействия на сосуды сетчатки или через 15 мин сразу после него.

L-NAME (N--nitro-L-arginine methyl ester) вводили внутрибрюшинно в натрий-фосфатном буфере (20 мг/кг) за 15 минут до лазерной коагуляции сетчатки глаза крыс.

NMDA (N-methyl-D-aspartate) (200 нмоль/глаз) и L-NAME (0,1 мг/глаз) в натрий-фосфатном буфере вводили в стекловидное тело глаза крысы (интравитреально) раздельно или в комбинации.

ДНК-Ж (динитрозильный комплекс железа) в натрий-фосфатном буфере вводили в стекловидное тело глаза крысы (10-7-10-4моль/глаз).

Контролем при интравитреальных инъекциях служили парные глаза, в которые вводили натрий-фосфатный буфер.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и Origin Pro 6.1 методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при P0,05. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеквадратичные отклонения.

2. Исследование действия нитритов в сетчатке на модели ишемии сетчатки глаза кроликов

Лазерная коагуляция ретинальных сосудов приводит к ишемии сетчатки глаза (Zhang Y. et al., 2005).

При офтальмоскопическом исследовании глазного дна интактного кролика сосуды сетчатки в области диска зрительного нерва не извиты и соответствуют средней норме (рис. 1а).

Лазерная коагуляция ретинальных сосудов приводит к значительным изменениям в кровенаполнении сосудов. При офтальмоскопическом исследовании того же глазного дна сразу после лазерного воздействия видно, что сосуды запустели и резко уменьшились в диаметре (рис. 1б).

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»