WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Далее был проведен анализ влияния стрихнина и бикукуллина на временные параметры мТПСП, в частности, на время спада потенциалов. С помощью компьютерной программы осуществляли визуальный отбор мТПСП в контроле (общая тормозная фракция миниатюрных постсинаптических потенциалов) и после воздействия антагонистов глициновых и ГАМКА рецепторов. После воздействия бикукуллина уменьшалось среднее время спада мТПСП (в контроле среднее время спада мТПСП составило 11 ± 0.7 мс (m ± SEM), n=291; после воздействия бикукуллина – 6.01 ± 0.33 мс (m ± SEM), n=252), за счет блокирования ГАМКергических потенциалов, имеющих более длительное время спада. При этом количество мТПСП, имеющих небольшое время спада, увеличивалось. В случае воздействия стрихнина происходит увеличение среднего времени спада потенциалов по отношению к контролю (в контроле среднее время спада мТПСП составило 10.44 ± 0.31 мс (m ± SEM), n=806; после воздействия бикукуллина – 14.61 ± 0.6 мс (m ± SEM), n=514). Данный факт свидетельствует о том, что после воздействия антагониста глициновых рецепторов преобладают мТПСП с более длительным временным течением (ГАМКергические мТПСП). Изменения статистически достоверны и в том и другом случае p < 0.001, t-test.

Рисунок 4. Влияние бикукуллина и стрихнина на частоту возникновения мТПСП трех типов в мотонейронах лягушки.

А, В – распределение частоты возникновения (%) трех типов мТПСП в контроле (светлые столбики) и при воздействии (темные столбики) бикукуллина (А) и стрихнина (В) в двух мотонейронах. Б, Г – изменения частот трех типов мТПСП по отношению к контролю (штриховая линия) при воздействии бикукуллина (Б) и стрихнина (Г). Усреднение по 8 мотонейронам в каждом тесте (m ± SD, p < 0.001, t-test)

На следующем этапе анализировалось влияние бикукуллина и стрихнина на три класса потенциалов. С помощью визуального отбора из общей миниатюрной тормозной фракции потенциалов отбирались потенциалы по полуширине: узкие (быстрые) мТПСП, имеющие полуширину от 0 до 8 мс, широкие (медленные), имеющие полуширину свыше 12 мс и мТПСП с двухкомпонентными спадами (с полушириной от 8 до 12 мс). На рисунке 4 (А, В) приведены примеры влияния антагонистов тормозных рецепторов на частоту возникновения трех типов мТПСП для двух мотонейронов. В первом мотонейроне (МП= -70 мВ) (рис. 4А) в контроле (общая тормозная фракция мПСП) фракция широких мТПСП составила 26 %, узких мТПСП – 67 %, двухкомпонентных – 7 %. После воздействия бикукуллина (20 мкМ) количество широких мТПСП составило 3 %, количество узких составило 97 %, двухкомпонентные мТПСП исчезали. Во втором мотонейроне (МП= -68 мВ) исследовалось влияние стрихнина на частоту возникновения трех типов мТПСП (рис. 4В). В контроле фракция широких потенциалов составила 16 %, узких – 78 %, двухкомпонентных мТПСП – 6 %, после воздействия стрихнина (1 мкМ) количество широких увеличилось и составило 55 %, количество узких составило 45 %, двухкомпонентные мТПСП исчезали.

Обобщенные данные по двум выборкам из 8 мотонейронов в каждом тесте представлены на рисунке 4 Б и Г Частота возникновения широких (медленных) мТПСП снижалась после воздействия бикукуллина и составила 8.4 ± 2.1 % (m ± SD, n=8; p < 0.001, t-test) от контроля, а частота узких (быстрых) увеличивалась и составила 132.1 ± 10.9 % (m ± SD, n=8; p < 0.001, t-test) (рис. 4Б). Аналогично частота возникновения узких (быстрых) мТПСП снижалась после добавления стрихнина и составила в среднем 25.5 ± 7.3 % (m ± SD, n=8; p < 0.001, t-test) от контроля, а частота воникновения широких (медленных) возрастала – 134.9 ± 11.5 % (m ± SD, n=8; p < 0.001, t-test) по отношению к контролю (рис. 4Г). В условиях блокирования глицинергической или ГАМКергической фракции общей миниатюрной тормозной активности из нее полностью исключались двухкомпонентные мТПСП, обусловленные совместным выделением глицина и ГАМК, а сохранившиеся компоненты смешанных мТПСП дополняют или глицин-, или ГАМК-опосредованную фракцию тормозных потенциалов (рис. 4А, В).

По результатам анализа падения частоты возникновения потенциалов, характеризующихся малым (полуширина менее 8 мс) и большим (полуширина свыше 12 мс) временем существования, можно заключить, что возникновению мТПСП с малой полушириной соответствует высвобождение квантов глицина, возникновению мТПСП с большой полушириной соответствует высвобождение квантов ГАМК, а двухкомпонентные мТПСП опосредованы совместным высвобождением глицина и ГАМК из одного пресинаптического бутона.

Проанализировав формы мТПСП, их различную чувствительность к специфическим антагонистам ГАМКА и глициновых рецепторов, мы выявили три типа тормозных потенциалов в мотонейронах спинного мозга лягушки Rana ridibunda. Двухкомпонентные мТПСП составляли 9 % от всех селектированных реакций, быстрые мТПСП– 64%, медленные мТПСП – 27 % (n=16). Результаты исследования подтверждают наше предположение о наличие на поясничных мотонейронах не только чисто ГАМКергических и глицинергических синапсов, но и синапсов, содержащих как ГАМК, так и глицин, о чем свидетельствует наличие двухкомпонентных мТПСП в тормозной фракции миниатюрных постсинаптических потенциалов. Полученные нами данные согласуются с данными исследований миниатюрной тормозной активности, выполненных на различных отделах ЦНС млекопитающих (Jonas et al., 1998; Chery and De Koninck, 1999; Doumoulin et al., 2001; Wu et al., 2002; Awatramani et al., 2005).

2. Исследование модуляции тормозной синаптической активности метаботропными ГАМК Б рецепторами.

Совместное высвобождение глицина и ГАМК из одного пресинаптического бутона и даже одной везикулы (Jonas et al., 1998, O`Brien and Berger, 1999) ставит вопрос о функциональном значении этого явления. Возможным функциональным механизмом, связанным с совместным действием двух тормозных медиаторов может быть модуляция (регуляция) одним из них эффекта, вызываемого другим медиатором. Глицинергическая передача является доминирующей тормозной передачей в спинном мозгу лягушки и логично предположить, что ГАМКергический механизм может быть использован для ее модуляции. В первую очередь такая модуляция может быть связана с метаботропными ГАМКБ рецепторами. Поскольку ГАМКБ рецепторы могут иметь пресинаптическую и постсинаптическую локализацию (Margeta-Mitrovic et al., 1999; Towers et al., 2000; Charles et al., 2001), действие их лигандов может проявляться в изменениях частоты мТПСП, опосредованных регуляцией процесса выделения медиатора, а также в изменениях их амплитуды, опосредованных постсинаптическими механизмами (Katz, 1962; Николс, 2003).

Влияние баклофена на общую тормозную фракцию мПСП. Для того, чтобы проверить возможность модуляции тормозной синаптической передачи ГАМКБ рецепторами исследовано влияние специфического агониста ГАМКБ рецепторов баклофена (100 и 200мкМ) на частоту и амплитуду мПСП общей тормозной фракции. Эффект баклофена зависел от концентрации апплицируемого агониста ГАМКБ рецепторов. При воздействии баклофена в концентрации 100 мкМ снижение частоты мТПСП составило 33.5 % (частота общей тормозной фракции мПСП в контроле составила 52.5 с-1, после воздействия баклофена – 34.9 с-1). Снижение средней амплитуды мТПСП после воздействия агониста ГАМКБ рецепторов составило 22.8 % (в контроле – 136 ± 123 мкВ (m ± SD)), после воздействия баклофена – 105 ± 71 мкВ (m ± SD)). МП мотонейрона = -70 мВ. В случае высокой концентрации баклофена (200 мкМ) снижение частоты мТПСП составило 75.3 % (в контроле – 17.8 с-1, после воздействия агониста ГАМКБ рецепторов – 4.4 с-1). Снижение средней амплитуды мТПСП составило 28.3 % (в контроле – 127 ± 86 мкВ (m ± SD), после влияния баклофена – 91 ± 48 мкВ (m ± SD)). МП мотонейрона = -72 мВ.

Влияние баклофена на глицинергическую фракцию мТПСП. Глицинергическая фракция мТПСП фармакологически изолировалась антагонистами ГАМКА рецепторов бикукуллином (20 мкМ) или габазином (SR 95531) (25 мкМ). Исследовано 11 мотонейронов 9 и 10 поясничных сегментов спинного мозга. Частота глицинопосредованных мТПСП значительно варьировала в индивидуальных мотонейронах (от 1.57 с-1 до 94.9 с-1) и в среднем составила 16.49 ± 8.09 с-1 (m ± SEM). В двух мотонейронах активация ГАМКБ рецепторов вызывалась баклофеном в концентрации 50 мкМ. В первом мотонейроне снижение частоты составило 9 % (в контроле – 5.9 с-1, после воздействия баклофена – 5.4 с-1), в другом мотонейроне падение частоты глицинергических мТПСП составило 23 % (частота мТПСП в контроле – 8.1 с-1, после воздействия баклофена – 6.2 с-1).

Активация ГАМКБ рецепторов баклофеном в концентрации 200 мкМ приводила к снижению частоты глицинергических событий в 8 из 9 исследованных мотонейронов. В восьми мотонейронах средняя частота глицинергической активности в контрольных условиях (после воздействия антагонистов ГАМКА рецепторов на общую тормозную фракцию мТПСП) составила 20.47 ± 10.96 с-1 (m ± SEM), а после воздействия 200 мкМ баклофена снизилась до 13.5 ± 6.97 с-1 (m ± SEM) (рис.5А). Таким образом, агонист метаботропных ГАМКБ рецепторов баклофен при достаточно высокой концентрации (200 мкМ) оказывал существенное влияние на частоту мТПСП в данной выборке мотонейронов, которое составило 42.01 ± 19.45 % (m ± SD) от контроля. Изменения средней частоты мТПСП достоверны (p < 0.05), достоверность различий высчитана по критерию Вилкоксона (Wilcoxon Singned Rank test).

Рисунок 5. Снижение частоты (А) и амплитуды (Б) глицинергических мТПСП при активации ГАМКБ рецепторов баклофеном (200 мкМ).

Влияние агониста ГАМКБ рецепторов баклофена в концентрации 50 мкМ на амплитуду глицинергических мТПСП показан в одном из в двух мотонейронов. Средняя амплитуда глицинергических мТПСП уменьшилась на 18.8 % (в контроле – 138 ± 93 мкВ (m ± SD)), после воздействия баклофена – 112 ± 60 мкВ (m ± SD)). Во втором мотонейроне эффекта на среднюю амплитуду не выявлено

Снижение амплитуды глицинергических мТПСП под влиянием баклофена в концентрации 200 мкМ был выявлен в 7 из 9 мотонейронов. Средняя амплитуда мТПСП, опосредованных глицином, в контроле составила 162.7 ± 44.8 мкВ (m ± SD), после воздействия баклофена (200 мкМ) – 135.1 ± 49.3 мкВ (m ± SD) (рис. 5Б). Уменьшение средней амплитуды мТПСП по отношению к контролю в данной выборке мотонейронов после аппликации баклофена варьировало в индивидуальных мотонейронах от 6 % до 31 % и в среднем составило 18 ± 4.6 % (m ± SEM). Эффект статистически достоверен p = 0.007 (парный критерий Стьюдента).

В мотонейроне (МП= -68 мВ), где эффект баклофена (200 мкМ) на амплитуду глицинергических мТПСП был выраженным и снижение средней амплитуды мТПСП составило 30 % (от 139 мкВ до 98 мкВ), произведена визуальная селекция глицинергических событий (на основании ранее определенных амплитудных и временных характеристик глицинергических мТПСП) и их усреднение в контроле (после воздействия TTX, D-AP5, CNQX и бикукуллина) и под влиянием баклофена (рис.6). В контроле количество усредненных мТПСП составило 90, после 15 минут воздействия баклофена – 90 потенциалов и после 20 минут – 50 потенциалов.

Рисунок 6. Снижение амплитуды глицинергических мТПСП под влиянием баклофена (200мкМ).

По оси ординат – амплитуда мТПСП в милливольтах (мВ), по оси абсцисс – длительность мТПСП в миллисекундах (мс).

Влияние селективного антагониста ГАМК(Б) рецепторов CGP 35348 на глицинергическую передачу. На следующем этапе работы наблюдали эффект воздействия селективного антагониста ГАМКБ рецепторов CGP 35348 (300 мкМ) на частоту и амплитуду фармакологически изолированных глицинергических мТПСП (в присутствии блокатора ГАМКА рецепторов SR 95531 (25 мкМ)). Исследовано 6 мотонейронов.

Частота глицинергических мТПСП значительно варьировала в индивидуальных клетках от 2.5 с-1 до 53.3 с-1 и в среднем составила 16.3 ± 7.8 с-1 (m ± SEM). В 4 из 6 мотонейронов CGP 35348 (300 мкМ) увеличивал частоту глицинопосредованных мТПСП от 9 до 176 % (частота мТПСП в контроле – 19.2 ± 11.6 с-1, после воздействия антагониста ГАМКБ рецепторов – 27.3 ± 12.4 с-1 (m ± SEM)). В двух мотонейронах эффекта не наблюдалось. Рисунок 7А иллюстрирует пример увеличения частоты глицинергических мТПСП после блокады ГАМКБ рецепторов CGP 35348 (300 мкМ). В данном мотонейроне (МП = -72 мВ) увеличение частоты мТПСП составило 28% (в контроле – 7.4 с-1, под влиянием CGP 35348 – 10.3 с-1). Для мотонейрона (МП = -70 мВ), где частота мТПСП увеличилась на 176 % на рисунке 7Б представлены графики накопленной вероятности для интервалов между мТПСП до и после аппликации CGP 35348. В данном мотонейроне частота глицинергических мТПСП в контроле составила 13.2 с-1, под влиянием антагониста ГАМКБ рецепторов частота увеличилась до 36.5 с-1.

Рисунок 7. Увеличение частоты (А и Б) и амплитуды (В) глицинергических мТПСП под влиянием CGP 35348 (300 мкМ)). На графиках накопленной вероятности представлено распределение вариантов встречаемости различных интервалов между глицинергическими мТПСП (Б) и их амплитуд (В) в контроле (1) и после воздействия CGP 35348 (2)

В трех мотонейронах из 6 отмечалось увеличение средней амплитуды глицинергических событий от 12.4 % до 30 % (средняя амплитуда в контроле составила 145 ± 37.3 мкВ, после воздействия CGP 35348 – 178 ± 57.9 мкВ (m ± SD)). Рисунок 7В иллюстрирует увеличение амплитуд мТПСП после аппликации 300 мкМ CGP 35348 в одном из мотонейронов (МП= -70 мВ). Увеличение средней амплитуды глицинопосредованных мТПСП в данном случае составило 12.4 % (в контроле – 121 ± 38 мкВ, под влиянием антагониста ГАМКБ рецепторов – 136 ± 44 мкВ). В другом мотонейроне (МП= -72 мВ) средняя амплитуда глицинопосредованных мТПСП увеличивалась на 30 % (от 188 до 244 мкВ). С помощью компьютерной программы были отобраны неналоженные глицинергические мТПСП в контроле (n=191) и после аппликации антагониста ГАМКБ рецепторов (n=222). Результат представлен в виде сравнения гистограмм амплитудного распределения на рисунке 8.

© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»