WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Обработка экспериментальных данных. Анализ частоты и амплитуды спонтанных и миниатюрных постсинаптических потенциалов (сПСП и мПСП), а также компьютерный анализ параметров мПСП осуществлялся с помощью компьютерной программы Pick 6. Данная программа является модифицированной программой предложенной Анкри и соавторами (Ankri et al., 1994) для автоматического анализа спонтанных синаптических реакций в нейронах ЦНС. Программа Pick 6 дополнена блоком селекции потенциалов по заданным амплитудным и временным интервалам. Она автоматически осуществляет селекцию сПСП и мПСП в заданных диапазонах временных характеристик (время нарастания (RT) от 10 % до 90 %, время спада (DT) от 90% до 10 %, полуширина (HW)) и амплитуды (A) исследуемых спонтанных синаптических ответов. Это позволяет сортировать наложенные и неналоженные мПСП. Визуальный отбор миниатюрных тормозных постсинаптических потенциалов (мТПСП) и анализ их параметров (амплитуда и временное течение) проводился с помощью компьютерных программ POTENTL пакета Pclamp 6.2 и программы Clampfit 8.2 пакета Pclamp 8.2, Axon instruments. Статистический анализ полученных результатов и графические построения выполнялись с помощью программ SigmaPlot версии 2.0 и 11.0 и программы Microsoft Exel для WINDOWS. Для оценки достоверности различий использовались парный критерий Стьюдента (t-test), а также критерий Вилкоксона в программе SigmaPlot версии 11.0.

Фармакологический анализ. Спонтанная синаптическая активность, наблюдаемая в мотонейронах, отводилась в нормальном физиологическом растворе в условиях отсутствия раздражения синаптических входов, а ее миниатюрная фракция (мПСП) – после добавления в перфузирующий раствор 1.0 мкМ тетродотоксина (ТТХ), блокирующего проведение нервного импульса по афферентному волокну (блокада потенциал зависимых Na+ каналов). Для последующего анализа тормозной фракции мПСП в перфузирующий раствор добавляли препараты D-AP5 (50 мкМ) – блокатор глутаматных ионотропных NMDA-рецепторов, и CNQX (25 мкМ) – блокатор AMPA- и каинатных рецепторов, таким образом исключая возбуждающую синаптическую активность, опосредованную глутаматом. Фармакологически изолированные тормозные постсинаптические потенциалы (мТПСП) подвергались дальнейшему исследованию с использованием селективных антагонистов ионотропных ГАМКА рецепторов – бикукуллина (20 мкМ) или габазина (25 мкМ), и глициновых рецепторов – стрихнина (1мкМ). Для исследования модуляции глицинергической передачи в перфузирующий раствор добавляли лиганды метаботропных ГАМКБ рецепторов: агонист ГАМКБ рецепторов – баклофен (50 – 200 мкМ), или антагонист – CGP 35348 (300 мкМ).

Перечисленные выше фармакологические вещества получены от фирмы «Tocris» (Англия) и от фирмы «Sigma» (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование спонтанной и миниатюрной синаптической активности.

В 11 мотонейронах была исследована фоновая синаптическая активность в условиях суперфузии изолированных препаратов спинного мозга нормальным физиологическим раствором и отсутствия раздражения синаптических входов. Спонтанная активность включает в себя как эффекты синаптической бомбардировки исследуемых мотонейронов импульсацией интернейронов, генерирующих ПД, так и эффекты спонтанного выделения медиаторов из пресинаптических терминалей на мембране данного мотонейрона. Мы будем рассматривать такую синаптическую активность в целом как спонтанную (спонтанные постсинаптические потенциалы - сПСП), а ее составляющую, обусловленную спонтанным выделением медиаторов (миниатюрные постсинаптические потенциалы - мПСП), - как миниатюрный компонент спонтанной синаптической активности.

Частота спонтанной активности широко варьировала в индивидуальных мотонейронах от 3.38 с-1 до 72.00 с-1 и составила в среднем 33.3 ± 18.9 с-1 (m ± SD) (n=11), средняя амплитуда сПСП – от 101 мкВ до 593 мкВ и в среднем составила 199 ± 135 мкВ (m ± SD). В клетках с относительно высокой частотой спонтанной активности амплитуда отдельных сПСП достигала 1.5 мВ. Высокая частота и амплитуда сПСП обусловлены приходом в пресинаптические окончания спонтанных импульсов.

После блокады проведения нервного импульса по волокну тетродотоксином ТТХ (1 мкМ) (регистрация миниатюрной активности) частота спонтанной синаптической активности значительно уменьшилась в большинстве исследованных мотонейронов (максимальное снижение по сравнению с сПСП до 88 %) и в среднем составила 13.3 ± 10.2 с-1 (от 2.49 с-1 до 30.61 с-1). Средняя амплитуда мПСП также была вариабельной (от 84 мкВ до 220 мкВ) и в среднем составила 131 ± 43 мкВ (n = 11). В мотонейронах с умеренной спонтанной синаптической активностью и амплитудой индивидуальных сПСП в основном порядка 0.2 – 0.3 мВ (изредка до 1.5 мВ), ТТХ не вызывал резких изменений частоты и амплитуды постсинаптических потенциалов. В мотонейроне (МП= -72 мВ), где частота сПСП была относительно низкой (3.38 с-1) снижение частоты после воздействия ТТХ составило 26 % (2.49 с-1), средней амплитуды – 14 % (от 141 мкВ до 121 мкВ). Следовательно, в таких мотонейронах генерация большинства потенциалов связана со спонтанным выделением медиатора, а не с приходом спонтанных импульсов в пресинаптические окончания, что согласуется с данными, полученными ранее на мотонейронах амфибий (Katz and Miledi, 1963; Colomo and Erulkar, 1968; Курчавый, 1984). Анализ амплитуд сПСП и мПСП показал, что большинство сПСП и мПСП попадает в диапазон 50 – 100 мкВ. Следует отметить, что даже после воздействия ТТХ сохранялись редкие высокоамплитудные потенциалы (0.5 – 1.5 мВ). В основе высокой вариабельности амплитуд сПСП и мПСП могут лежать, во-первых, пространственные факторы, зависящие от кабельных свойств дендритов (электротоническое распространение вдоль дендритов), во-вторых, вариабельность интенсивности и длительности действия нейротрансмиттеров (Katz and Miledi, 1963)

2. Исследование совместного высвобождения ГАМК и глицина.

В 16 исследованных мотонейронах в присутствии TTX и блокаторов ионотропных возбуждающих глутаматных рецепторов производилась запись мТПСП (рис. 1). Инверсия мТПСП объясняется диффузией ионов Cl- из микроэлектрода, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации этих ионов и изменению их равновесного потенциала, который у лягушки близок значению МП (Shapovalov, 1980).

При анализе фармакологически изолированной тормозной фракции миниатюрных постсинаптических потенциалов (мТПСП) были выявлены три основных типа мТПСП (рис. 1). Первый тип – потенциалы с малым временем нарастания и быстрым временем спада (быстрые мТПСП). Второй тип – потенциалы, имеющие несколько большее время нарастания, длительное время спада и меньшую амплитуду (медленные мТПСП). Третий тип – мТПСП, спад которых имеет быстро и медленно затухающие компоненты (двухкомпонентные мТПСП).

Для более точной оценки временных характеристик и амплитуды каждого типа мТПСП, а также их сравнения был осуществлен визуальный отбор и усреднение потенциалов (таблица 1). Из записей были выбраны неналоженные мТПСП, т.е. мТПСП не имеющие изгибов на фазе нарастания (Isaacson and Walmsley, 1995), которые можно было однозначно классифицировать как принадлежащие к какому-либо из указанных выше типов потенциалов. Основными критериями отбора потенциалов являлись их временные характеристики: время нарастания (rise time – RT) и время спада (decay time – DT), отражающие длительность мТПСП. Следует отметить, что

Рисунок 1. Регистрация трех типов мТПСП в мотонейроне спинного мозга лягушки после воздействия 1 мкМ TTX, 50 мкМ D-AP5, 25 мкМ CNQX. 1 – мТПСП с быстрым временем нарастания и быстрым временем спада (быстрые); 2 – мТПСП с большим временем нарастания, большим временем спада и меньшей амплитудой (медленные); 3 – двухкомпонентные мТПСП.

амплитуда мТПСП определенного типа, в отличие от его временных параметров, является вариабельной характеристикой, зависящей от вариаций количества высвобождаемого медиатора из индивидуальных синаптических везикул, вариаций плотности рецепторов на постсинаптической мембране, удаленности места регистрации ПСП от синаптического контакта (Katz and Miledi, 1963; Walmsley et al., 1998; Lim et al., 1999; Edwards, 2007).

Таблица 1

Амплитудно-временные характеристики усредненных трех типов мТПСП

Параметры

Тип

мТПСП

Амплитуда,

мВ

RT (от 10 % до 90 %), мс

HW, мс

DT (от 90 % до 10%), мс

Быстрый (глицинергический) (n=88)

0.150±0.047

1.52 ± 0.50

5.46 ± 1.35

6.50 ± 2.16

Медленный (ГАМКергический) (n=88)

0.104 ± 0.047

3.61 ± 1.12

21.63 ± 5.33

25.19 ± 4.59

Двухкомпонентный

(ГАМК/глицин опосредованный) (n=47)

0.142 ± 0.043

2.29 ± 0.95

8.07 ± 1.42

18.07 ± 5.54

Исследования вызванных элементарных и миниатюрных спонтанных тормозных токов и потенциалов показали, что глицинопосредованным реакциям свойственна быстрая кинетика, а ГАМК-опосредованные реакции имеют более медленное время нарастания и длительное время спада (Jonas et al., 1998; O`Brien and Berger, 1999; Wu et al., 2002; Кожанов и др., 2004). Это позволило нам предположить, что мТПСП первого типа опосредованы высвобождением глицина, второго – ГАМК, а мТПСП с двухкомпонентными спадами опосредованы совместным высвобождением двух тормозных медиаторов из одного пресинаптического окончания, причем быстрозатухающая компонента – глицином, а медленно затухающая – ГАМК.

Для подтверждения этого предположения производился анализ влияния селективных антагонистов ГАМКА и глициновых рецепторов бикукуллина (20 мкМ) и стрихнина (1 мкМ), соответственно, на частоту и амплитуду мТПСП. В присутствии антагонистов происходило снижение частоты мТПСП. При воздействии стрихнина падение частоты в большинстве клеток было более значительным, чем в присутствии бикукуллина. Частота глицинергических мТПСП (после блокады ГАМК(А) рецепторов бикукуллином) составила 75.3 ± 17.7 % (m ± SD) (n=8) от частоты общей миниатюрной тормозной активности, а частота ГАМКергических мТПСП (после блокады глициновых рецепторов стрихнином) – 45.4 ± 12.5 % (m ± SD) (n=8). Это объясняется тем, что глицинопосредованная передача в спинном мозгу является доминирующей у позвоночных (Шаповалов и Ширяев, 1987).

Рисунок 2. Влияние бикукуллина (20 мкМ) на амплитуду мТПСП мотонейрона. А – Распределение вероятностей встречаемости различных амплитуд мТПСП показывает умеренное увеличение количества потенциалов с высокой амплитудой после воздействия бикукуллина. 1- контроль; 2 – после воздействия бикукуллина. Б – эффект бикукуллина. Стрелками показаны глицинергические мТПСП, оставшиеся после блокады ГАМКА рецепторов.

На рисунке 2 приведен пример влияния бикукуллина (20 мкМ) на мТПСП мотонейрона (МП= -70 мВ). Средняя амплитуда мТПСП увеличивалась на 8 %: в контроле – 107 ± 52 мкВ (m ± SD), после воздействия антагониста ГАМКА рецепторов 116 ± 69 мкВ. Умеренное увеличение средней амплитуды мТПСП можно объяснить выпадением низкоамплитудных ГАМКергических мТПСП (по сравнению с высокоамплитудными глицинергическими реакциями).

Рисунок 3. Влияние стрихнина (1 мкМ) на амплитуду мТПСП мотонейрона. А – Распределение вероятностей встречаемости различных амплитуд мТПСП показывает снижение количества потенциалов с высокой амплитудой под влиянием стрихнина. 1- контроль; 2 – после воздействия бикукуллина. Б – эффект стрихнина. Стрелками показаны ГАМКергические мТПСП, оставшиеся после блокады глициновых рецепторов.

Рисунок 3 иллюстрирует пример влияния стрихнина в концентрации 1 мкМ на среднюю амплитуду мТПСП. В данном мотонейроне (МП мотонейрона = -65 мВ) средняя амплитуда мТПСП после воздействия стрихнина снизилась на 16 % (в контроле – 154.8 ± 54.4 мкВ, после воздействия стрихнина – 129.4 ± 42.8 мкВ). График накопленной вероятности для амплитуд мТПСП (рис. 3А) демонстрирует уменьшение количества высокоамплитудных мТПСП, что соответствует выпадению (после воздействия стрихнина) значительной фракции относительно высокоамплитудных мТПСП, обусловленных глицинергической передачей.

Средняя амплитуда мТПСП незначительно растет после воздействия бикукуллина (20 мкМ) и существенно снижается под влиянием стрихнина (1 мкМ), что отражает более высокую амплитуду и значительный вклад в общую тормозную фракцию глицинергических мТПСП.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»