WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Результаты нашей работы

Ras-Raf-MEK-ERK

BRAF

NRAS

Мутация V600E

Мутация G13R

до 70%

20%

0, 20%

0

0

-

PI3K-AKT

PTEN

Делеции 10q23

20-40%

0-10%, 75%

0

CDKN2A-CDK4-RB

CDKN2A

RB1

Делеции

Метилирование

Делеции

Метилирование

до 60%

до10%

50-75%

40%

0-32%

0-7,5%, 34%

до 21%

-

2,8%

4,7%

0

0

p53-ARF

ARF

Мутации

Более 40%

0

-

Таким образом, основной спектр молекулярных нарушений, характерный для меланомы кожи, не играет важной роли в запуске патологических процессов в увеальной меланоме. Естественно, что в процессе канцерогенеза различных опухолей происходит повреждение одних и тех же сигнальных каскадов, однако к настоящему моменту можно предполагать, что ключевые моменты патогенеза для этих опухолей не идентичны. Предполагается, что различия в популяциях меланоцитов кожи и увеального тракта появляются еще в процессе эмбрионального развития в процессе миграции предшественников меланоцитов кожи в эпителий, а меланоцитов увеального тракта - глубоко в мезодермальные ткани (Belmar-Lopez et al., 2008). Возможно, изучение путей дифференцировки этих двух клеточных популяций поможет понять причины различий в патогенезе двух опухолей.

Разработка системы ДНК-маркеров для диагностики увеальной меланомы

Проблемы дифференциальной диагностики увеальной меланомы связаны с многообразием ее проявлений. С учетом полиморфности симптомов меланому приходится дифференцировать от большого количества заболеваний как опухолевой, так и неопухолевой природы. Однако полиморфизм клеток и их атипия усложняют морфологическую диагностику УМ. В этих случаях генетическое исследование может быть важным дополнением к используемым в настоящее время методам.

Для оценки состояния хромосомы 3 мы предлагаем использовать панель из десяти микросателлитных маркеров, локализованных на обоих плечах хромосомы 3, позволяющую выявить моносомию 3. При использовании метода для верификации диагноза УМ при выявлении потери гетерозиготности по всем информативным маркерам хромосомы 3 (моносомия 3) делают заключение о наличии специфического молекулярного нарушения, характерного для увеальной меланомы. Однако, при получении любых других результатов, диагноз УМ не может быть отвергнут.

Клиническая чувствительность метода составляет 45-55%, так как моносомия 3 присутствует, согласно данным нашего исследования, а также данным литературы при применении различных методов (микросателлитный анализ, анализ SNP, FISH, CGH, CISH, SKY) в 45-55% увеальных меланом. Клиническая специфичность метода чрезвычайно высока в связи с тем, что, в отличие от множества других опухолей, для которых характерна потеря только короткого плеча хромосомы 3 или структурные нарушения 3р, наиболее распространенным нарушением в увеальных меланомах считается потеря одной копии хромосомы 3 (моносомия 3). В связи с этим получение ложноположительных результатов маловероятно. В 10 исследованных образцах, где диагноз УМ был отвергнут при гистологическом анализе, моносомия 3 выявлена не была.

Аналитическая чувствительность системы (наличие как минимум одного информативного маркера на каждом плече хромосомы 3) составляет 99,5%. Аналитическая специфичность оценивалась при использовании образцов условно-нормальной хориоидеи, где ПГ выявлена не была.

Количественные и структурные нарушения хромосом 3 и 1р имеют статистически достоверную ассоциацию с неблагоприятными факторами прогноза; мы рекомендуем проведение молекулярно-генетического анализа для оценки агрессивности течения УМ в дополнение к проводимым в настоящее время морфологическим и иммуногистохимическим. Анализ аллельных делеций хромосом 3 и 1 позволит сориентировать врача в дифференциальном диагнозе и прогнозе заболевания и оценить риск возникновения осложнений и метастазирования увеальной меланомы.

В случае выявления моносомии 3 (определяется в 45-55% УМ) или делеций 1р делают вывод о высоком риске метастазирования первичной опухоли, что должно быть учтено при проведении скрининговых исследований. По данным литературы, ассоциация моносомии 3 с развитием метастазов УМ превышает таковую для любых других клинических или гистологических факторов (Tsai T and o’Brien M, 2008; Shields CL, 2008). При выявлении характерных структурных нарушений в хромосоме 3 (делеции в локусах 3р25, 3(p14.2-p13) и 3(q24-q26), 3-5% УМ) рекомендуется также предполагать агрессивный характер течения меланомы.

Для оценки состояния локусов 1р36 также рекомендована система маркеров, использованная в работе (D1S243, D1S2145, D1S1635, D1S407, D1S3669).

Аналитическая чувствительность системы маркеров 1р36 составляет 99,9%. Аналитическая специфичность также оценивалась при использовании образцов условно-нормальной хориоидеи, где ПГ выявлена не была. Высокая клиническая чувствительность и специфичность определяется наличием статистически достоверных ассоциаций с агрессивными характеристиками опухоли (напр. склеральная инвазия).

Диагностика молекулярных маркеров УМ в биоптатах

Из шести УМ методом тонкоигольгой биопсии было получено 17 препаратов, в которых с помощью цитологического анализа были выявлены атипичные клетки. Этот материал был затем собран со стекол и использован для получения ДНК. Из 17 образцов биопсии, количество материала оказалось достаточным для анализа не менее чем 15 микросателлитных маркеров в 14 случаях (78,5%).

Благодаря высокой чувствительности и надежности описанных методов возможно проведение молекулярных исследований образцов опухоли и ТИАБ, что может быть особенно важным в случаях неоднозначных результатов цитологического и биохимического исследования. В одном из образцов опухоли с дифференциальным диагнозом метастаз (локализация первичной опухоли неизвестна) / первичная УМ (эпителиоидноклеточный тип) была выявлена ПГ по всем информативным маркерам хромосомы 3, 1р36 и 8р22, что дало больше оснований для диагноза УМ.

В одной из опухолей была выявлена гетерогенность по состоянию микросателлитных маркеров хромосомы 3. В 4 из 6 биопсийных образцов эпителиоидноклеточной УМ наблюдалась потеря гетерозиготности по маркерам D1S1038, 3q23.1_16xTG и D3S2398 при сохранении гетерозиготности по остальными информативным маркерам, а в двух образцах аллельных потерь выявлено не было. Этот факт свидетельствует о том, что отсутствие структурных нарушений в материале из биопсийного образца не всегда можно рассматривать как признак отсутствия структурных изменений во всей опухоли, однако большее количество материала может дать более ясную картину.

Так как метод радиотерапии применяется в настоящее время чаще, чем энуклеация, ТИАБ представляет собой эффективный способ проведения генетического анализа для всех пациентов с увеальной меланомой. Для пациентов, которым была впоследствии проведена энуклеация, возможно проведение повторного генетического анализа, для сбора дальнейшей информации о гетерогенности опухоли и чувствительности теста. В целом, результаты работы свидетельствуют об адекватности и оправданности применения ТИАБ для генетического анализа.

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ потери гетерозиготности хромосомных районов 1p36, 1р31.3, 3p25.3, 3p21.3, 3p14.2, 3q12, 3q26.3, 3q28, 8p22, 9p21.2-p21.3, 10q23.2-q23.3, 13q14. Наиболее частым специфическим изменением, выявленным в клетках увеальной меланомы, является ПГ по всем информативным маркерам хромосомы 3, определенная как моносомия 3 (45%). Выявлено наличие аллельных потерь в хромосомных локусах 1р36 (29,9%) и 8р22 (35,9%).

2. Проведен анализ метилирования генов CDKN2A, RB1, RASSF1A, MLH1, FHIT и VHL. Показано, что метилирование промоторной области RASSF1A определяется в 24,3% образцов УМ, а в условно нормальной хориоидее тех же пациентов метилирование отсутствует.

3. Показано, что для увеальной меланомы не характерны основные молекулярные нарушения, свойственные меланоме кожи, в том числе мутация T1796A гена BRAF, аллельные делеции в локусе PTEN, а также ПГ и гиперметилирование промоторных районов генов пути регуляции CDKN2A RB1.

4. Обнаружены статистически достоверные ассоциации моносомии 3 с агрессивными характеристиками опухоли, такими как эпителиоидный клеточный тип (р<0,0001), цилиарная локализация (р=0,001) и пигментация (р=0,018). Определена достоверная ассоциация аллельных делеций 1р36 с экстрасклеральной инвазией опухоли (р=0,012), снижающей выживаемость пациентов, а также с увеличенным размером опухоли (р=0,024). Также определена ассоциация метилирования гена RASSF1A с отсутствием аллельных потерь по маркерам RASSF1A в хромосоме 3.

5. Разработана система диагностических маркеров увеальной меланомы, основанная на анализе молекулярно-генетических нарушений в образцах опухоли. Подтверждено, что ТИАБ представляет собой эффективный способ получения материала для генетического анализа пациентов с увеальной меланомой, позволяющий провести микросателлитный анализ не менее чем по 15 маркерам.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В настоящей работе получены данные о характерных генетических и эпигенетических нарушениях при УМ, выявлены ассоциации структурных и численных хромосомных нарушений с прогрессией первичной опухоли. Комплексный анализ полученных данных и сопоставление их с данными литературы позволили предложить практические рекомендации по использованию результатов настоящей диссертационной работы в клинической практике.

  1. Определение потери гетерозиготности по маркерам хромосомы 3 и 1р36 в материале первичной опухоли целесообразно проводить наряду с патоморфологическим исследованием для дифференциальной диагностики и оценки прогноза УМ.
  2. Материал, полученный с помощью ТИАБ, может быть использован для комплексного исследования, включающего не только морфологический, но и молекулярно-генетический анализ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Манохина, И.К. Статус метилирования промоторных областей некоторых генов-супрессоров онкогенеза в увеальных меланомах / И.К. Манохина, Н.В. Склярова, С.В. Саакян, Д.В. Залетаев // Молекулярная медицина. – 2009. - №2, - С. 27-31
  2. Манохина, И.К. Aнализ аллельных потерь в увеальных меланомах / И.К. Манохина, Н.В. Склярова, С.В. Саакян, Д.В. Залетаев // Медицинская генетика. – 2008. –Том 7, №6 (72). - С.19-23
  3. Залетаев, Д.В. Эпигенетические маркеры в диагностике онкозаболеваний / Д.В. Залетаев, М.В. Немцова, В.В. Стрельников, О.В. Бабенко, Е.М. Пальцева, В.В. Землякова, Е.Б. Кузнецова, Т.В. Кекеева, Д.С. Михайленко, И.К. Манохина // Молекулярная медицина. – 2008. - №4. – С.46-51
  4. Системы ДНК-маркеров в диагностике онкозаболеваний / под. ред. М.А. Пальцева. М.: МЕДИЦИНА, 2009. - в печати
  5. Manokhina, I.K. Status of some tumor-suppressor loci in uveal melanoma / I.K. Manokhina, N.V. Sklyarova, S.V. Saakyan, D.V. Zaletaev // European Journal of Human Genetics. – 2009. - Vol. 17. – Suppl. 2. - в печати
  6. Manokhina, I.K. Analysis of the molecular genetic changes in uveal melanoma / I.K. Manokhina, N.V. Sklyarova, S.V. Saakyan, D.V. Zaletaev // European Journal of Human Genetics. – 2008. - Vol. 16. – Suppl. 2. - p.237
  7. Манохина, И.К. Aнализ молекулярно-генетических нарушений в увеальных меланомах / И.К. Манохина, Н.В. Склярова, С.В. Саакян, Д.В. Залетаев // Сбрник тезисов к V Конференции молодых ученых России "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины." – 2008. – С. 266
  8. Манохина, И.К. Генетические аспекты увеальной меланомы: хромосомные нарушения и идентификация генов, вовлеченных в канцерогенез / И.К. Манохина, Н.В. Склярова, С.В. Саакян, Д.В. Залетаев // Современные технологии в дифференциальной диагностике и лечении внутриглазных новообразований: сб. науч. тр. – Москва, 2007. - С. 93-97
  9. Manokhina, I.K. Identification of tumor-suppressor loci that may contribute to the pathogenesis of uveal melanoma / I.K. Manokhina, N.V. Sklyarova, S.V. Saakyan, D.V. Zaletaev // European Journal of Human Genetics.- 2007. - Vol. 15. - Suppl. 1, p.173
  10. Manokhina, I.K. Status Of Some Tumor-Suppressor Genes In Uveal Melanoma / I.K. Manokhina, N.V. Sklyarova, S.V. Saakyan, D.V. Zaletaev // Abstracts for International Society of Ocular Oncology Meeting. - 2007, - р.314
  11. Saakyan, S.V. Correlation Between Clinical-Morphological And Genetic Parameters In Uveal Melanoma / S.V. Saakyan, N.V. Skliarova, G.V. Zaharova, I.K. Manokhina, D.V. Zaletayev // Abstracts for International Society of Ocular Oncology Meeting. - 2007, - р. 210.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И АББРЕВИАТУРЫ ГЕНОВ

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

п.н. – пар нуклеотидов

ПГ – потеря гетерозиготности

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ТИАБ – тонкоигольная аспирационная биопсия

УМ – увеальная меланома

SRO – наименьшие области перекрывания делеций

RASSF1A - Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1

VHL - von Hippel-Lindau tumor suppressor

FHIT - fragile histidine triad gene

MLH1 - mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2

CDKN2A - cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4)

RB1 - retinoblastoma 1

BRAF - v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»