WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Пациентов делили на группы по клиническим критериям и сравнивали в этих группах частоты аллельных потерь по каждому локусу с помощью точного критерия Фишера и критерия - квадрат. Сравнение средних величин внутри каждой из групп, разделенных по наличию определенных хромосомных аберраций, проводили при помощи критерия Манна-Уитни. Двусторонний p<0.05 рассматривали как статистически достоверный.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В представленную работу вошли результаты молекулярно-генетического обследования пациентов с первичной увеальной меланомой. Во всех случаях заболевание носило спорадический характер. Диагноз увеальная меланома был подтвержден гистологически в отделении патологической анатомии и гистологии глаза НИИ глазных болезней  имени Гельмгольца. Работу выполняли на образцах периферической крови и операционном материале (УМ + условно-нормальная хориоидея) 107 пациентов и на образцах периферической крови и биопсийных образцах (цитологические препараты) шести пациентов.

Анализ потери гетерозиготности в УМ

Хромосома 3. Расположение микросателлитных маркеров вдоль хромосомы 3 представлено на рисунке 1. Системы из двух полиморфных микросателлитных маркеров показали высокую информативность. Если гетерозиготность отдельных маркеров составляла 39-82%, то система из двух маркеров имела информативность 80-94%.

Рисунок 1. Расположение микросателлитных маркеров вдоль хромосомы 3. Линиями обозначены наименьшие области перекрывания делеций (SRO) по результатам исследований различных авторов. (Tschentscher et al., 2001, Parella et al., 2003, Cross et al., 2006).

Потеря гетерозиготности по маркерам хромосомы 3 определена в 51 (47,6%) из 107 исследованных меланом, из них 48 (45%) имели ПГ по всем информативным локусам хромосомы 3, что, в свете информации о характерных молекулярных нарушениях УМ, рассматривалось как «функциональная моносомия 3» (потеря одной из копий хромосомы 3 или изодисомия).

Свидетельство наличия структурных нарушений в хромосоме 3, определявшихся как потеря гетерозиготности по одному или нескольким маркерам при сохранении гетерозиготности по остальным, было выявлено только в трех опухолях. В одном случае потеря гетерозиготности определялась по всем микросателлитным маркерам, расположенным в 3р, а в двух других случаях потеря гетерозиготности имела место только для маркеров, расположенных в локусе FHIT (D3S1234 и D3S1300). Оба маркера, использованных в нашей работе, локализовались внутригенно по отношению к FHIT, супрессорная активность которого была подтверждена в исследованиях in vivo и in vitro (Pekarsky et al., 2002).

Выявленный участок потери гетерозиготности локализуется в области перекрывания делеций 3р13-3р14.2, описанной в одной из работ (Tschentscher et al., 2001). В этом локусе расположены также несколько транскрипционных факторов, включая MITF, который принимает участие в дифференцировке меланоцитов нервного гребня и клеток пигментного эпителия сетчатки и может, наряду с FHIT, рассматриваться как ген-кандидат в патогенезе УМ.

Короткое плечо хромосомы 1. Расположение микросателлитных маркеров вдоль 1р представлено на рисунке 2. Информативность маркеров составила соответственно D1S438 - 57%, D1S3669 – 73,1%, D1S407 – 76,9%, D1S1635 – 60%, D1S2145 – 77,8%, D1S243 – 81,7%. Потеря гетерозиготности по маркерам, локализованным на коротком плече хромосомы 1, определена в 32 (29,9%) образцах.

В 25 (23,4%) образцах ПГ была определена для всех информативных маркеров 1р36. Для этих образцов маркер D1S438 также выявил ПГ в 11/25 случаев (в 1/25 случаев маркер был гетерозиготен и в 13/25 был не информативен), то есть, скорее всего, большинство выявленных нарушений представляют собой крупные хромосомные потери, захватывающие бльшую часть 1р.

Рисунок 2. Расположение микросателлитных маркеров короткого плеча хромосомы 1. Линиями обозначены SRO по результатам исследований различных авторов. (Hausler et al., 2005, Kilic et al., 2005).

Наибольшие частоты аллельных потерь определены для маркеров, расположенных в наиболее дистальных из изучаемых локусов (D1S2145 (1р36.31) и D1S243 (1р36.33)). В области 1(p36.22-p36.31) локализуются некоторые гены-супрессоры опухолевого роста, например TNFR2 (tumor necrosis factor receptor 2) и APITD1 (apoptosis-inducing, TAF9-like domain 1), а в локусах 1(p36.31-pter) –CDC2L1 (cell division cycle 2-like 1) и TP73 (tumor protein p73). К настоящему моменту нет достоверных данных, которые подтверждали или опровергали бы возможность участия большинства из этих генов в патогенезе увеальных меланом.

В двух образцах меланом ПГ определена только по маркеру D1S438, расположенному в локусе 1p31.3, наиболее центромерно по отношению к другим маркерам.

Рисунок 3. Пример микросателлитного анализа для образцов увеальной меланомы с использованием нескольких микросателлитных маркеров.

ПГ – потеря гетерозиготности по указанному маркеру, гет. – маркер гетерозиготен (потери гетерозиготности нет), гом. – маркер гомозиготен (не информативен).

8p22. Частота аллельных делеций в локусе 8р22 составила 35,9%. Использованный в нашей работе микросателлитный маркер D8S1731 локализуется на 160 т.п.н. дистальнее гена-супрессора TUSC3 (N33). Гетерозиготность маркера составила 0,673. Hughes et al. (2005) заявляли о наличии делеций в локусе 8р23.3-р11.23 в меланомах с моносомией 3. Onken et al. (2008) указывают на минимальный делетируемый участок 8p12-р22, и ген-супрессор LZTS1 (8p21), делеции которого ассоциируются с повышенными инвазивными свойствами и миграцией клеток увеальной меланомы.

Сигнальный каскад CDKN2A RB1. В нашей работе аллельных потерь в локусе 13q14 (RB1) не обнаружено. Микросателлитные маркеры, использованные в работе (RBint2, RBint20), локализовались внутри гена RB1, информативность системы маркеров RBint2, RBint20 составила 100%.

Микросателлитные маркеры 9p21 (D9S2136, D9S942) располагались во фланкирующих участках гена CDKN2A, а также в одном из соседних с CDKN2A локусов (D9S169). Информативность системы маркеров D9S2136, D9S942 составила 95,3%, маркер D9S169 был информативен в 77,5% случаев. ПГ по всем маркерам 9р21.2-р21.3 была выявлена в двух образцах. В одном образце ПГ была выявлена только по маркеру D9S942 (D9S2136 гомозиготен, D9S169 гетерозиготен). ПГ в локусе 9p21.2, при сохранении гетерозиготности маркеров D9S942 и D9S2136, фланкирующих ген CDKN2A была выявлена в двух образцах. На основании полученных результатов мы можем предположить, что аллельные делеции в генах пути регуляции CDKN2A RB1 не являются основным механизмом в патогенезе увеальной меланомы.

PTEN является геном-супрессором канцерогенеза с широким спектром регуляторной активности. Район 10q23 является вторым по частоте локусом, подверженным перестройкам в меланомах кожи, а также часто повреждается в ряде других злокачественных опухолей. Информативность маркера D10S1765 составила 63,5%, аллельных потерь в локусе PTEN выявлено не было (0/68).

Анализ метилирования в УМ

Хромосома 3. Метилирование промоторной области RASSF1A было определено в 26 (24,3%) образцов (рис. 4). Метилирование RASSF1A не обнаружено в ткани условно нормальной хориоидеи. RASSF1A располагается в локусе p21.3 хромосомы 3, наиболее часто повреждаемой в клетках увеальной меланомы, спектр его супрессорного действия чрезвычайно широк и включает регуляцию клеточного цикла в фазе G1/S (Song et al., 2004).

Рисунок 4. Анализ метилирования методом метил-чувствительной полимеразной цепной реакции. (a) Наличие ПЦР-продукта с длиной 347 п.н. свидетельствует о метилировании промоторной области гена RASSF1A в образце, (б) внутренний контроль ПЦР, «+», положительный контроль – продукт ПЦР с негидролизованной ДНК, «–», отрицательный контроль – отсутствие ДНК, pUC/MspI-маркер молекулярной массы.

(a)

(б)

Анализ метилирования не выявил изменений для генов FHIT, VHL и MLH1, также локализованных в хромосоме 3.

Сигнальный каскад CDKN2ARB1. В качестве причины инактивации CDKN2A кроме ПГ рассматривалась возможность гиперметилирования его промоторной области. В нашем исследовании метилирование CDKN2A выявлено только в 5 образцах (4,7%) и не было обнаружено ни одного случая гиперметилирования промоторной области RB1.

Поиск мутаций

Поиск активирующей мутации гена BRAF проводился с помощью аллель-специфичной ПЦР и не выявил искомую мутацию ни в одном случае (0/60). В одной из работ отмечалось, что мутация может присутствовать в отдельных клетках УМ наряду с неповрежденным геном в 20-40% опухолей (Janssen et al., 2008). Вследствие этого можно предположить, что мутация BRAF все же не является важным элементом патогенеза УМ, а возникает на поздних этапах канцерогенеза в отдельных клонах опухолевых клеток.

Профиль молекулярной патологии в исследованных образцах УМ

Молекулярные нарушения, выявленные в выборке из 107 увеальных меланом, представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Хро-мо-сома

Локус

Микроса-

теллитные

маркеры

Аллельные потери

Ген-кандидат

Метилиро-

вание про-моторной обл. гена

ПГ по всем инф. маркерам

ПГ в отдельных локусах

1

1p36.33

1p36.31

1p36.22

1p36.21

1p36.12

D3S243,

D1S2145

D1S1635,

D1S407,

D1S3669

25/107

(23,4%)

5/102*

-


1p31.3

D1S438

2/61*

3

3p25.3

D3S1038, D3S1317

48/107

(45%)

1/107

VHL

0/107

3p21.3

D3S1568,

D3S966

RASSF1A

26/107

(24,3%)

3p14.2

D3S1300, D3S1234

2/100*

FHIT

0/107

3q12

D3S2459

-

3q26.3

D3S3520

3q26_16хTG

TNFSF10

3q28

D3S2398

8

8р22

D8S1731

23/64* (35,9%)

-

9

9p21.3

9p21.2

D9S942,

D9S2136,

D9S169

2/107

1/102*

CDKN2A

5/106

(4,7%)

2/83*

10

10q23.2-q23.3

D10S1765

0/68*

PTEN

-

13

13q14

RB1int20,

RB1int2

0/107

RB1

0/107

* Только информативные маркеры или системы из двух маркеров в указанном локусе

Для изучения ассоциации между различными молекулярными нарушениями в увеальной меланоме был использован точный критерий Фишера.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»