WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

МАНОХИНА Ирина Константиновна

ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛЕКУЛЯРНОЙ ПАТОЛОГИИ В УВЕАЛЬНЫХ МЕЛАНОМАХ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва, 2009 год

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека НИИ Молекулярной медицины Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Залетаев Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Шахтарин Владимир Васильевич

доктор медицинских наук, профессор

Журков Вячеслав Серафимович

Ведущая организация: НИИ канцерогенеза ГУ Российский онкологический

научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

Защита состоится « » _________________ 2009 г. в ________ часов на заседании Диссертацитонного Совета Д.001.016.01 в ГУ МГНЦ РАМН по адресу: 115478, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан « »______________ 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.001.016.01,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Увеальная меланома (УМ) является наиболее частой первичной злокачественной внутриглазной опухолью у взрослых, заболеваемость увеальной меланомой составляет 7-8 человек на 1 млн. населения в год в России, США и странах Западной Европы. УМ возникает в результате злокачественной трансформации меланоцитов сосудистой оболочки глазного яблока. Современные методы диагностики и лечения УМ направлены на повышение выживаемости пациентов и сохранение глаза как косметического и функционального органа.

Метастазы развиваются у значительной части пациентов с УМ. В частности, смертность в связи с увеальной меланомой достигает 53% в течение пятилетнего периода именно вследствие метастатической болезни. Несмотря на использование новейших достижений в области диагностики и лечения, этот показатель остается по-прежнему чрезвычайно высоким. Выявлены некоторые характерные клинические и гистологические факторы, совокупность которых позволяет условно разделить увеальные меланомы на более «спокойные», с невысоким риском метастазирования, и «агрессивные», для которых риск развития метастазов считается повышенным. Однако необходимость создания диагностической системы маркеров увеальной меланомы очевидна. Поиск и характеристика молекулярных маркеров диагностики и прогноза является, на сегодняшний день, одной из важнейших задач онкологии. Создание эффективных диагностических протоколов позволит в дальнейшем оценить прогноз заболевания и предпринять адекватные меры для выявления и лечения метастатической болезни у пациентов с увеальной меланомой. Необходимым этапом создания системы молекулярных маркеров УМ является анализ наиболее характерных и часто встречающихся молекулярно-генетических нарушений в первичных увеальных меланомах.

Настоящая работа посвящена изучению структурных и функциональных генетических нарушений в увеальных меланомах, а также оценке диагностической значимости этих изменений как потенциальных маркеров УМ.

Актуальность работы определяется следующими факторами:

1) Увеальная меланома является наиболее частой первичной злокачественной внутриглазной опухолью, составляющей 12% от меланом всех локализаций, однако молекулярные механизмы ее патогенеза к настоящему моменту изучены недостаточно.

2) Эффективное лечение увеальной меланомы связано не только со своевременной диагностикой и лечением первичной опухоли, но также ранним выявлением и лечением метастатической болезни. Есть предположения, что ряд характерных молекулярных нарушений в увеальных меланомах может быть ассоциирован с опухолевой прогрессией и развитием метастазов.

3) Молекулярные методы диагностики увеальной меланомы в настоящее время в отечественной лабораторной практике не используются, хотя успешно применяются в медицинских центрах за рубежом.

Целью настоящей работы является анализ молекулярно-генетических изменений,  ассоциированных с развитием увеальной меланомы и изучение потенциала их использования в клинической практике для расширения возможностей диагностики, а также прогнозирования течения заболевания.

Задачи исследования:

  1. Исследовать аллельное состояние микросателлитных маркеров в локусах генов-супрессоров опухолевого роста и хромосомных районах, наиболее часто делетируемых в злокачественных опухолях.
  2. Определить статус метилирования промоторных районов ряда генов-супрессоров опухолевого роста.
  3. На образцах УМ провести анализ молекулярных нарушений в генах и хромосомных районах, наиболее часто повреждаемых при меланоме кожи.
  4. Определить ассоциации молекулярно-генетических нарушений с клинико-патологическими данными.
  5. Оценить возможность использования тонкоигольной аспирационной биопсии для скрининга молекулярных нарушений.

Научная новизна. Настоящая работа является первым широкомасштабным молекулярно-генетическим исследованием увеальных меланом на территории Российской Федерации и направлена на поиск молекулярных маркеров увеальных меланом с перспективой создания комплексной системы диагностических и прогностических маркеров, позволяющих врачу сделать правильный выбор в отношении тактики лечения и дальнейшего наблюдения пациентов.

Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование, включающее определение не только ранее описанных молекулярных нарушений, но и изучение состояния генов и сигнальных каскадов, связанных с регуляцией клеточного цикла, клеточной прогрессией и дифференцировкой.

Выявлено наличие характерных для увеальной меланомы генетических и эпигенетических нарушений (потеря одной копии хромосомы 3 (моносомия 3), делеции 1р, 8р, метилирование RASSF1A). В исследовании обнаружены ассоциации моносомии 3 с характеристиками агрессивного течения меланомы, такими как эпителиоидный клеточный тип, цилиарная локализация и пигментация опухоли. Аллельные делеции 1р не могут рассматриваться как патогномоничное нарушение в увеальных меланомах, однако определена их достоверная ассоциация с экстрасклеральной инвазией опухоли, снижающей выживаемость пациентов. Метилирование гена RASSF1A является неслучайным изменением, обнаруженным в увеальных меланомах: его отсутствие определено в условно-нормальной хориоидее тех же пациентов, а также определена ассоциация с отсутствием аллельных потерь по маркерам RASSF1A в хромосоме 3.

Установлено, что основной спектр молекулярных нарушений, характерный для меланомы кожи, не играет важной роли в запуске патологических процессов в увеальной меланоме.

Практическая значимость. Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование 107 пациентов с диагнозом первичная увеальная меланома. Обнаружение моносомии 3 способствует дифференциальной диагностике УМ, так как это нарушение является специфическим, не характерным для другой онкопатологии. Определена ассоциация структурных и количественных нарушений в хромосоме 3 и 1р36 с клинико-морфологическими характеристиками и факторами прогрессии опухоли, что позволит использовать анализ этих нарушений в качестве маркеров прогрессии на различных стадиях УМ. Подтверждено, что тонкоигольная аспирационная биопсия (ТИАБ) представляет собой эффективный способ получения материала для генетического анализа для пациентов с увеальной меланомой Результаты, полученные в представленной работе, легли в основу разработки системы молекулярных маркеров УМ в дополнение к применяемым диагностическим методам – гистологическому и биохимическому. Внедрение таких систем расширяет возможности диагностики и дифференциальной диагностики, позволяет определить риск метастазирования опухоли и выбрать тактику терапии.

Положения, выносимые на защиту

  1. Моносомия 3 является специфическим хромосомным нарушением, выявляемым не менее чем в 45% увеальных меланом и определяющим агрессивное течение заболевания. Для УМ также характерны аллельные делеции в локусах 1р36 и 8р22.
  2. Метилирование RASSF1A определяется преимущественно в меланомах, не имеющих моносомии 3 и не характерно для условно-нормальной хориоидеи.
  3. Молекулярный патогенез УМ и меланомы кожи различен. Для увеальной меланомы не характерны основные молекулярные нарушения, свойственные меланоме кожи, в том числе мутация Т1796А гена BRAF, аллельные делеции в локусе PTEN, а также потеря гетерозиготности и гиперметилирование промоторов генов пути регуляции CDKN2A RB1.
  4. Разработаны системы ДНК-маркеров для выявления молекулярных нарушений в образцах увеальной меланомы, полученных в результате резекции опухоли и тонкоигольной биопсии.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Все исследования проведены лично автором. В ходе работы был проведен сбор материала для исследования, разработаны модификации методов выявления аллельных делеций, протоколов проведения анализа эпигенетических нарушений промоторных областей генов-супрессоров; проведен поиск мутаций, молекулярно-генетическое исследование потери гетерозиготности и статуса метилирования исследуемых генов в образцах опухолей и нормальных тканей.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на ежегодных Европейских конференциях по генетике человека в 2007 г. (Ницца, Франция) и 2008 г. (Барселона, Испания), конгрессе Международного общества онкоофтальмологов в 2007 г. (Сиена, Италия), Всероссийской научно-практической конференции «Современные технологии в дифференциальной диагностике и лечении внутриглазных опухолей» в 2007 г. (Москва), конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» в 2008 году (Москва).

Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику. На основании результатов проведенной работы разработаны новые медицинские ДНК-технологии «Молекулярно-генетическая методика выявления специфических молекулярных маркеров увеальной меланомы» и «Молекулярно-генетическая методика оценки прогрессии первичной опухоли при увеальной меланоме» (Поданы заявки на регистрацию новых медицинских технологий). Методические подходы, разработанные в диссертационной работе, используются в МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 104 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 153 ссылки. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа была проведена на образцах крови и операционном материале (парные образцы) 107 пациентов с диагнозом перичная увеальная меланома, предоставленных МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца. Для всех пациентов фиксировались следующие клинико-патологические параметры: возраст и пол пациента, вовлеченность отделов увеального тракта, диаметр основания опухоли, ее толщина, клеточный тип, склеральная инвазия, степень пигментации. Также были получены 17 образцов биопсии (6 опухолей) с соответствующими образцами периферической крови.

При хирургическом удалении поврежденного опухолью глаза (операция энуклеации) биопсийный материал опухоли и относительно неповрежденной хориоидеи, а также образцы периферической крови (консервант: 0.5М раствор ЭДТА) сохраняли при –20оС. Для исследования образцов ТИАБ материал собирали с цитологических препаратов.

Геномную ДНК из образцов опухолей, условно нормальной хориоидеи и периферической крови выделяли с помощью протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией. При выделении ДНК из цитологических препаратов собранный со стекла материал обрабатывали лизирующим буфером, содержащим протеиназу К и полученный лизат использовали в качестве матрицы для постановки ПЦР.

Потерю гетерозиготности (ПГ) в хромосомных районах 1p36, 1р31.3, 3p25.3, 3p21.3, 3p14.2, 3q12, 3q26.3, 3q28, 8p22, 9p21.2-p21.3, 10q23.2-q23.3, 13q14 идентифицировали с использованием высокополиморфных маркеров D1S243, D1S2145, D1S1635, D1S407, D1S3669, D1S438, D3S1038, D3S1317, D3S1568, D3S966, D3S1300, D3S1234, D3S2459, 16xTG_3q26.31, D3S3520, D3S2398, D8S1731, D9S942, D9S2136, D9S169, D10S1765, RB2int, RB20int. Контролем служила ДНК лейкоцитов периферической крови.

Для выявления стандартной мутации Т1796А (V600E) гена BRAF использован метод специфической амплификации мутантного аллеля ARMS (Amplification Refractory Mutation System) и выбрана схема полугнездной ПЦР, в которой два праймера (BRAF15F и BRAF15R) отжигаются на интронных последовательностях, фланкирующих 15 экзон BRAF, а третий (внутренний, BRAF15m) соответствует мутантному варианту T1796A.

Для определения метилирования СpG-островков промоторных областей генов применяли метод метил-чувствительной полимеразной цепной реакции. В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК из клеток УМ, предварительно гидролизованную рестриктазами HpaII (для генов CDKN2A, RASSF1A, RB1, MLH1) или HhaI (для генов FHIT и VHL).

Программное обеспечение: выявление микросателлитных районов, подбор маркеров, определение генов, расположенных в делетированных регионах проводили с использованием баз данных UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu), Ensembl Genome Databases (http://www.ensembl.org), BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), NCBI UniSTS (http://ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezdb=unists); конструирование олигонуклеотид-ных праймеров и подбор условий для ПЦР проводили с использованием программы Primer3 Input 0.4.0 (http://frodo.wi.mit.edu).

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»