WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

Мы охарактеризовали НА клеточных лизатов интактных клеток и показатель, отражающий степень фрагментации вкДНК (табл. 2). Основным ферментом, обуславливающим тестируемую в наших условиях Mg2+-зависимую эндонуклеазную активность, является ДНКаза1 (Campbell V.W., Jackson D.A., 1980). Экспрессия этого фермента увеличивается при гипоксии клеток (Kominato Y. et all., 2007). Известно, что ДНКаза 1 играет существенную роль в процессе элиминации фрагментов вкДНК из организма (среды культивирования).

Уровень НА в клетках при различных условиях культивирования

5 штаммов клеток 5-го пассажа мы разделили на две группы – с малым количеством АкРГ (2207, 2207 и 2211) и большим (2208 и 2212).

Рис. 13. Средние значения НА (А-Г) и показателя фрагментации (а-г) в группе клеток с относительно малыми (светлые столбики) и большими (темные) количествами АкРГ (усл.ед.) в геноме. Варианты: А,а стандартное культивирование; Б,б действие малых доз (приводятся средние значения для двух доз) K2CrO4; В,в и Г,г апоптоз, вызванный соответственно действием 4 мкМ или 6 мкМ K2CrO4 («поздний ответ»). (*) -отмечены значения, которые различаются с вероятность p < 0,05.

Для этих групп были определены средние значения показателя фрагментации и НА (рис. 13). При стандартных условиях культивирования значения НА (рис. 13А) и уровень фрагментации ДНК (рис. 13а) в клетках с большим количеством АкРГ примерно в 2 раза выше, чем в клетках с низким количеством АкРГ. «Ранний» ответ на действие хромата калия (4 часа, 4 или 6 мкМ) сопровождается значительным снижением НА клеток (рис. 13Б). Вероятно, окислительный стресс уменьшает возможности клеток эффективно деградировать вкДНК. Значения НА и степени фрагментации (рис. 13б), как и в случае спонтанного апоптоза клеток, зависят от количества АкРГ в геноме. Уровень НА клеток, в которых протекает процесс апоптоза («поздний» ответ), индуцированный 4мкМ (рис. 13В) или 6 мкМ (рис. 13Г) K2CrO4 также положительно коррелирует с количеством в геномах штаммов АкРГ. Таким образом, для трех состояний клеток (стандартное культивирование, «ранний» и «поздний» ответ на окислительный стресс) мы обнаружили одни и те же закономерности: уровень Mg2+-зависимой нуклеазной активности клеток в штаммах с высоким относительным количеством АкРГ значительно выше, чем в клетках с низким количеством АкРГ. В большинстве случаев это соответствует более высокой степени фрагментации вкДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В основе большинства теорий старения лежит предположение об определяющей роли окислительного стресса, который вызывается как эндогенными причинами (функционирование митохондрий), так и экзогенными (действие окружающей среды и образа жизни). Устойчивость организма (клетки) к действию свободных радикалов и, следовательно, скорость старения, ассоциированные со старением заболевания и продолжительность жизни – это производная функционирования большого числа генов, среди которых весьма трудно выделить определяющие процесс естественного старения. Свойства комплекса РГ индивида (клетки) – это фон, на котором развивается клеточный ответ на окислительный стресс. Для эффективного ответа на стресс клетке необходимо достаточное количество рибосом, которые обеспечат синтез нужного количества белков, участвующих в процессах детоксикации, репарации и апоптоза поврежденных клеток. Именно поэтому рибосомные гены давно привлекают внимание исследователей процесса старения.

Количество активных копий РГ в геноме – определяющая характеристика РГ, напрямую связанная с количеством клеточной РНК. Мы обнаружили, что для группы СВ по сравнению с ГС наблюдается сужение распределения по количеству АкРГ (рис. 14). Данные многолетних наблюдений сотрудников лаборатории Общей цитогенетики ГУ МГНЦ РАМН, а также данные литературных источников говорят о том, что относительное количество АкРГ (количество копий РГ в потенциально-активной фракции РГ (Conconi A., 1992)) в геноме клеток – врожденная характеристика организма, не изменяющаяся с возрастом.

Рис. 14. Сравнение распределений по количеству АкРГ для выборки СВ (белое поле), группы среднего возраста (светло-серый цвет), группы больных ревматоидным артритом ((Шубаева Н.О., 2003), темно-серый цвет) и больных шизофренией ((Вейко Н.Н., Еголина Н.А. и соавтр., 2003), черный цвет).

Таким образом, сужение распределения по количеству АкРГ в группе СВ говорит о том, что до 80 лет не дожили индивиды с минимальными и с максимальными количествами АкРГ в геноме. Мы предположили, что индивиды с малым количеством АкРГ (менее 16,5 усл.ед.) не доживают до старческого возраста, в том числе и потому, что их клетки обладают сниженной устойчивостью к окислительному стрессу. Относительно небольшие повреждения клеток сопровождаются индукцией апоптоза, что приводит к более раннему старению органов и тканей. Это предположение подтвердилось при исследовании действия окислительного стресса, вызываемого малыми дозами хромата калия, на 5 линий фибробластов кожи доноров с различным количеством АкРГ в геноме. Относительные изменения в уровне показателей апоптоза при действии на клетки с низкими количествами АкРГ были в несколько раз больше, чем в клетках с большими количествами АкРГ. Аналогичные данные были получены ранее для фибробластов кожи больных ревматоидным артритом (РА) (Шубаева Н.О., 2003). В этой связи интересно отметить, что у большей части больных РА, который является социально значимым заболеванием, сокращающим продолжительность жизни на 10-15 лет, ранее наблюдали более низкие, чем у возрастной нормы, количества АкРГ в геноме (см. рис. 14). Больные РА составляют подгруппу людей с низкими количествами АкРГ среди людей среднего и молодого возраста, которые, при прочих равных условиях, имеют вероятность не дожить до 80 лет.

Индивиды с большим количеством АкРГ (более 22 усл.ед.) также не представлены в выборке СВ. Мы объясняем это двумя причинами. Как показали данные модельного исследования действия K2CrO4 на культивируемые фибробласты, клетки с большим количеством АкРГ повышенно устойчивы к апоптозу, индуцируемому генотоксическим агентом. Благодаря более высокой активности синтеза белка (большего количества рРНК, а значит и рибосом) клетки с поврежденной ДНК могут выжить и не подвергнуться апоптозу. Но при этом возрастет вероятность мутаций в ДНК, что может привести к возникновению опухоли или других заболеваний, сокращающих продолжительность жизни.

Вторая возможная причина – это наличие в популяции генетической патологии, для которой характерно увеличение количества АкРГ и не высокая продолжительность жизни. Из литературы известно пока только одно заболевание (исключая синдром Дауна с трисомией по 21 хромосоме), при котором было обнаружено для части больных значительное увеличение количества АкРГ в геноме – это шизофрения (Вейко Н.Н., Еголина Н.А. и соавтр., 2003) (рис. 14). Авторами этих работ высказано предположение, что увеличение активности РГ связано с наличием врожденной генетической патологии, для компенсации которой необходим интенсивный синтез белка и, следовательно, большое количество АкРГ в геноме.

Общее число копий РГ зависит от количества АкРГ в геноме и от количества метилированных КМРГ. Результаты, полученные в нашем исследовании, позволяют сделать вывод, что при старении геном, с большой вероятностью, теряет высокометилированные КМРГ. Эти данные могут отчасти объяснить противоречивость полученных ранее разными авторами результатов об изменении количества и метилирования РГ при старении клеток и тканей животных. В зависимости от наличия или отсутствия КМРГ в геноме исследуемых клеток можно обнаружить или не обнаружить статистически значимое снижение содержания РГ в геноме. КМРГ не транскрибируются, являясь своеобразным «балластом» генома. Потеря этих последовательностей при старении не должна сказываться на количестве синтезируемой РНК- полимеразой 1 рРНК. Также важен обнаруженный нами факт, что в состарившихся клетках, имеет место повреждение цепи рДНК в значительном числе копий рДНК. Эти нарушения могут приводить как к блокированию клеточного цикла, так и к низкой устойчивости к стрессу. Оба этих события сопутствуют старению и смерти организма.

Наши данные показали, что распределение по числу копий РГ в геноме для людей старше 80 лет значительно сужено по сравнению с выборкой здоровых людей среднего возраста (см. рис. 15). По-видимому, значительное уменьшение доли высокопийных по рДНК геномов в группе СВ происходит вследствие трех причин: (1) потеря в течение жизни КМРГ, которые встречаются только в геномах с большим числом копий (Вейко Н.Н., 2001), (2) снижение числа людей с большим количеством АкРГ, которым соответствуют большое число копий РГ и (3) наличие в популяции генетической патологии, для которой характерно увеличение общего числа копий РГ и не высокая продолжительность жизни. Увеличение общего числа копий РГ, также как и количества АкРГ, ранее наблюдали для геномов больных шизофренией (см. рис. 15). Небольшое уменьшение доли низкокопийных по рДНК геномов в выборке СВ связано, по-видимому, с уменьшением в выборке СВ людей с низкими количествами АкРГ, геномы которых содержат мало КМРГ.

Рис. 15. Сравнение распределений по числу копий РГ для выборки СВ (белое поле), группы среднего возраста (светло серый цвет), группы больных ревматоидным артритом ((Вейко Н.Н., Шубаева Н.О. и соавтр., 2006), темно-серый цвет) и больных шизофренией ((Вейко Н.Н., Еголина Н.А. и соавтр., 2003), черный цвет).

Исследование репликативного старения показало, что длительность пролиферативного периода культур с количеством АкРГ в геномах от 16,7 до 21,5 усл.ед. не зависит от свойств комплекса РГ и диктуется определенным состоянием клетки к началу культивирования вне организма. Это состояние может быть охарактеризовано не зависящими от свойств комплекса РГ, но коррелирующими между собой параметрами – содержанием теломерного повтора в геноме, показателями спонтанного апоптоза клеток (активность каспазы 3 и количество вкДНК). Штаммы с максимальными содержаниями ТП в геноме имеют минимальные показатели уровня апоптоза на раннем пассаже и переживают максимальное число пассажей. Однако интенсивность ответа клеток ранних пассажей на экзогенное повреждающее воздействие напрямую зависит от количества АкРГ: чем больше АкРГ в геноме, тем меньше относительное увеличение активности каспазы 3 и количества вкДНК в культуре.

При изучении репликативного старения и ответа клеток на окислительный стресс обнаружен новый факт, имеющий принципиальное значение для развития дальнейших исследований роли РГ в процессах старения. Оказалось, что от количества АкРГ в геноме фибробластов напрямую зависит эндонуклеазная активность клеток, которую мы тестировали в клеточных лизатах. Положительную корреляцию между НА и количеством АкРГ в геноме мы обнаружили в интактной субконфлуентной культуре клеток, при действии на клетки малых доз хромата калия и при индукции апоптоза клеток. Повышенную НА в клетках с большим количеством АкРГ нельзя объяснить увеличением общего уровня синтеза белка в клетках с более активным синтезом рРНК. При действии малых доз хромата калия в одном из штаммов с большим количеством АкРГ наблюдалось снижение количества клеточной РНК, но уровень НА оставался высоким. Для клеток с большим количеством АкРГ и соответственно более высоким уровнем НА, мы наблюдали, как правило, значительно более сильную фрагментацию внеклеточной ДНК.

В работе мы высказали предположение, что повышенная НА клеток с большим количеством АкРГ в геноме – это возможная компенсаторная реакция клетки на более высокие концентрации CpG-богатых фрагментов РГ в внеклеточной среде, которые могут нанести вред, индуцируя дополнительный окислительный стресс путем взаимодействия с рецепторами TLR9. Очевидно, для окончательного вывода о роли высоких значений НА в функционировании клеток с большим количеством АкРГ требуются дальнейшие исследования.

ВЫВОДЫ

  1. В выборке людей старческого возраста по сравнению с людьми среднего возраста значительно сужены интервалы варьирования общего числа копий РГ в геноме и количества активных копий РГ.
  2. У людей старческого возраста снижено содержание в геноме высокометилированных кластеров молчащих рибосомных генов. При репликативном старении геном человека теряет высокометилированные кластеры неактивных копий РГ.
  3. При репликативном старении культивируемых фибробластов кожи человека происходит значительное повреждение первичной структуры рДНК, что проявляется в значительном занижении показателей real-time ПЦР.
  4. Скорость репликативного старения фибробластов кожи и маркеры старения не зависят от геномной дозы РГ и от возраста доноров кожи.
  5. При действии хромата калия, индуцирующего дополнительный окислительный стресс, относительные изменения в уровне апоптоза клеток отрицательно коррелируют с количеством активных копий РГ в геноме клетки: минимальные изменения в уровне апоптоза демонстрируют штаммы с большим количеством РГ.
  6. Уровень эндонуклеазной активности фибробластов (и степень фрагментации внеклеточной ДНК) при нормальном культивировании и в условиях окислительного стресса положительно коррелирует с количеством активных копий РГ в геноме штамма.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»