WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Общее число копий и относительное количество АкРГ в геномах ГС и СВ

Анализируемые

группы

Общее число копий РГ (К)

Кол-во АкРГ (А), усл.ед.

Интервал

значений

Среднее

SD

n

Интервал

значений

Среднее

SD

n

Группа ГС

205-699

431

112

336

15,5-22,6

19,2

1,7

219

Группа СВ

272-568

397

57

78

16,3-22,1

19,1

1,2

90

Средние значения АкРГ в лимфоцитах людей СВ и ГС не различаются, при этом, как и в случае общего числа копий, наблюдается уменьшение интервала варьирования и величины дисперсии для СВ в сравнении с ГС.

Оценка количества метилированных копий РГ в геномах людей старческого и среднего возраста

На наличие в геноме кластеров «молчащих» рибосомных генов (КМРГ) указывает величина отношения общего числа копий РГ (К) к числу активных копий РГ (А), К/А> 26±1 (Вейко Н.Н., 2001). КМРГ не транскрибируются и, как правило, высокометилированы. На рис. 2а приведены распределения величины К/А в геномах группы СВ и ГС. В отличие от ГС, в группе СВ редко встречаются индивиды, у которых в геноме есть небольшие КМРГ.

Поскольку КМРГ высокометилированы, их отсутствие в геноме должно коррелировать со сниженным уровнем метилирования РГ. Мы провели сравнительный анализ метилирования РГ в геномах ГС и СВ. Для этого определили показатель М, равный отношению гибридизационных сигналов НрaII- и Msp1- гидролизатов геномной ДНК (Вейко Н.Н., Ляпунова Н.А. и соавтр., 2008), полученных при гибридизации с зондом на рДНК. Последовательность РГ содержит много сайтов Msp1НрaII. Фрагменты, получающиеся при гидролизе неметилированных копий РГ, имеют малую длину, что препятствует их эффективной иммобилизации на нитроцеллюлозной мембране. Чем больше метилированных копий РГ в геноме, тем выше показатель М.

Мы выделили три группы, различающиеся по показателю М. Для доноров группы 1М значения М варьируют от 1,1 до 1,7, для группы 2М показатель метилирования изменяется от 1,7 до 2,5 и для группы 3М – от 2,5 до 3, 1. Более 80% анализируемых образцов ДНК группы СВ были отнесены к группе 1М (мало метилированных копий РГ). Таким образом, в геномах людей СВ снижено содержание КМРГ и это коррелирует со сниженным уровнем метилирования РГ.

Возникает вопрос: теряются ли КМРГ при старении организма или до старости доживают преимущественно те индивиды, у которых в геноме изначально нет копий КМРГ В последнем случае отсутствие КМРГ в геноме можно было бы рассматривать как прогностический маркер долголетия.

Поскольку мы не располагаем возможностью проследить изменение количества КМРГ в геноме на протяжении всей жизни одних и тех же индивидов, для ответа на поставленный вопрос мы обратились к модельной системе – репликативному старению культивируемых фибробластов кожи человека, которое многими авторами рассматривается как адекватная модель изучения механизмов старения млекопитающих.

Анализ влияния свойств комплекса РГ на скорость репликативного старения фибробластов кожи человека

Для отбора доноров кожи применили два критерия – возраст донора и количество АкРГ в геноме, определенных ранее в культивируемых лимфоцитах. Основные характеристики штаммов приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Характеристики анализируемых в работе штаммов фибробластов

Основные

характеристики

Порядковый номер штамма фибробластов кожи

2206

2207

2208

2211

2212

1

Возраст донора (год)

21

35

52

52

35

2

Максимальное число пассажей (МЧП)

60

66

62

56

47

3*

Число клеток в субконфлуентной культуре, млн

3,0 ± 0,3

2,7 ± 0,2

1,5 ± 0,1

1,7 ± 0,1

1,9 ± 0,1

4

Число клеток (40 пас.) в субконфлуентной культуре, млн

1,4 ± 0,2

2,3 ± 0,2

1,7 ± 0,2

1,0 ± 0,1

0,5 ± 0,1

5*

Содержание ТП, пг/нгДНК

0,59± 0,05

1,06± 0,04

0,74± 0,01

0,40± 0,03

0,35 ± 0,03

6*

Количество АкРГ, (усл.ед)

17,7 ± 0,1

17,1 ± 0,1

21,5 ± 0,1

16,7 ± 0,1

20,0 ± 0,2

7*

Число копий РП

590 ± 40

670 ± 70

470 ± 60

370 ± 20

470 ± 40

8*

Показатель К/А

35

39

22

21

22

9*

Степень метилирования РГ, показатель М

1,7 ± 0,2

1,9 ± 0,2

1,12± 0,03

-

-

10*

РНК, мкг/мкг ДНКклетки

1,6 ± 0,2

1,7 ± 0,2

3,3 ± 0,3

1,4 ± 0,1

2,4 ± 0,2

11*

вкДНК, (% от totДНК)

3,3 ± 0,5

2,2 ± 0,3

2,9 ± 0,4

3,0 ± 0,5

7,4 ± 1,1

12*

Фрагментация вкДНК

2,7 ± 0,4

2,1 ± 0,2

5,2 ± 0,4

2,1 ± 0,7

3,0 ± 0,9

13*

Активность каспазы 3,ед.фл./ 1мкг ДНК

33 ± 2

26 ± 3

29 ± 2

35 ± 3

45 ± 5

14*

Активность нуклеаз,

ед.фл./ 1мкг ДНК

42 ± 4

40 ± 4

58 ± 3

48 ± 4

90 ± 4

*) характеристики определены для субконфлуентных клеток на 5-м пассаже

Свойства комплекса РГ. Число копий РГ в геномах клеток 5-го пассажа варьировало от 370 до 670, относительное количество АкРГ – от 16,7 до 21,5 усл.ед. Для клеток штаммов 2206 и 2207 значения показателя К/А оказались выше порогового значения 26, что позволяет предположить присутствие в геноме КМРГ. Для остальных штаммов величины К/А находились в интервале значений, характерных для геномов, в которых КМРГ отсутствуют. Для трех штаммов с разными значениями отношения К/А (2206, 2207 и 2208) был определен показатель метилирования. Сравнение значений К/А и М выявило высокую положительную корреляцию между этими параметрами (k = 0,997; р = 0,05; N = 3), что подтверждает предположение о наличии в геномах штаммов 2207 и 2206 высокометилированных кластеров РГ, которые составляют соответственно примерно 33 % и 26 % всех копий РГ. Количество РНК, определенное в расчете на 1 мкг клеточной ДНК (табл.2, строка 9), отражает, прежде всего, количество рРНК, т.к. рРНК составляет от 80 до 90% клеточной РНК. Мы наблюдали положительную зависимость количества РНК от количества АкРГ в геноме клеток (рис. 3).

Маркеры репликативного старения

(1) Максимальное число пассажей (МЧП). Скорость репликативного старения характеризуется величиной МЧП клеток культуры (строка 2, табл. 2). Показатель МЧП изменялся от 47 (штамм 2212) до 66 (штамм 2207). Для определения МЧП необходимы длительные эксперименты по культивированию клеток. Мы определили, что можно прогнозировать скорость старения, определяя некоторые параметры культуры, коррелирующие с МЧП, задолго до того, как клетки перестанут делиться.

(2) Число клеток на фиксированной площади на 40-м пассаже (строка 4) коррелирует с МЧП (показатели линейной регрессии, k = 0,99; p < 0,01; n = 5) и также отражает старение культуры – «старые», неделящиеся клетки занимают большую площадь, чем «молодые» и пролиферирующие.

(3) Содержание теломерного повтора в клетках 5-го пассажа. В последние годы получены доказательства того, что уменьшение содержания в геноме ТП – это следствие (маркер), но не причина старения (Оловников А.М., 2003). Содержание ТП в геномах клеток 5-го пассажа (строка 5, табл.2) коррелирует с МЧП (k = 0,99; p < 0,01; n = 5) и может рассматриваться как прогностический маркер старения. Содержание ТП на 5-м пассаже и число клеток на 40-м пассаже также связаны линейной зависимостью (k = 0,97; p = 0,005; n = 5).

Уровень спонтанного апоптоза в клетках 5-го пассажа оценивали по двум показателям: активность в клеточных лизатах одного из ключевых ферментов апоптоза – каспазы 3 (табл. 2, строка 13) и количество внеклеточной ДНК (вкДНК) по отношению к общему количеству ДНК в лунке планшета (строка 11). Значения этих маркеров апоптоза (рис. 4) отрицательно коррелируют с МЧП (и с содержанием ТП).

Рис. 4. Зависимость активности каспазы 3 (а) и количества вкДНК (б) в культуре клеток 5-го пассажа от МЧП.

Таким образом, культуры клеток с относительно низкой скоростью репликативного старения на ранних пассажах характеризуются высоким содержанием в геноме ТП и низким уровнем спонтанного апоптоза

Сопоставление свойств комплекса РГ и маркеров старения. Методом линейной регрессии мы проанализировали зависимость свойств комплекса РГ клеток 5-го пассажа (число копий, количество АкРГ, показатели К/А и М) от маркеров старения (МЧП, содержание ТП, спонтанный апоптоз). Характеристики комплекса РГ клеток практически не влияли на скорость пролиферативного старения. К моменту начала культивирования вне организма клетки находятся в определенном состоянии, которое характеризуется уровнем спонтанного апоптоза и содержанием ТП и не зависит от свойств комплекса РГ. Это состояние определяет длительность пролиферативного периода клеток в условиях нормального культивирования при отсутствии внешних воздействий, которые могут индуцировать дополнительный окислительный стресс.

Изменения некоторых свойств генома при репликативном старении

Изменение содержания контрольной последовательности (ТП). На рис. 5 показано содержание ТП в геномной ДНК, выделенной из клеток различных пассажей.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»