WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |

На правах рукописи

УДК 575.224

Малиновская Елена Михайловна

ИЗМЕНЕНИЯ КОМПЛЕКСА РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА

В ПРОЦЕССЕ ЕСТЕСТВЕННОГО И РЕПЛИКАТИВНОГО

СТАРЕНИЯ

03.00.15 – Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2008

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ГУ Медико-генетического научного центра РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук,

Вейко Наталья Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Ревазова Юлия Анатольевна

кандидат биологических наук

Захарова Екатерина Юрьевна

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»)

Защита состоится 2 февраля 2009 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.016.01 в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН по адресу: 115478, город Москва, улица Москворечье, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Медико-генетического научного центра РАМН

Автореферат разослан ________________ 200 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, Зинченко Р.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Рибосомные гены (РГ), кодирующие рибосомные РНК (28S, 18S, 5.8S рРНК), имеют принципиальное значение для функционирования эукариотической клетки. Для обеспечения синтеза большого количества молекул рРНК, в геноме человека содержится от 250 до 700 копий РГ. В соматической клетке человека транскрибируется 30-50% копий РГ, которые называют активными копиями (АкРГ). К варьирующим признакам генома также относят количество метилированных копий РГ.

В литературе уже давно дискутируется вопрос о возможной связи характеристик комплекса РГ генома млекопитающих и старения. В нескольких работах сообщалось об уменьшение числа копий РГ при старении тканей человека и животных (Strehler B.L. et al., 1979; Johnson L.K. et al., 1975; Gaubatz J. et al., 1976). В более поздних работах было показано, что при старении клеток организма мышей (Ono T. et al., 1985; Peterson C.R. et al., 1984), крыс (Halle J.P. et al., 1997) и человека (Peterson C.R. et al., 1984) не происходит существенного изменения числа копий РГ в геноме. Столь же противоречивые данные получены при исследовании изменения метилирования РГ при старении. Сообщалось об увеличении метилирования при старении культивируемых фибробластов кожи человека (Machwe A. et al., 2000), клеток крысы (Oakes C.C. et al., 2003) и мыши (Swisshelm K. et al., 1990). По данным других авторов, при старении млекопитающих уровень метилирования РГ не изменяется или снижается (de Carvalho C.V. et al., 2000). Практически нет работ, в которых одновременно оценивали бы изменения нескольких характеристик РГ при старении, а также изучали бы взаимосвязь между свойствами РГ и уровнем окислительного стресса, который рассматриваются в настоящее время в качестве основной причины старения.

Цель и задачи исследования. Изучение изменений комплекса РГ человека в процессе старения и установление возможной связи между этим процессом и продолжительностью жизни, а также анализ изменения свойств комплекса РГ при старении культивируемых клеток человека (репликативное старение). Были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

  1. сравнить свойства комплекса РГ (число копий, количество АкРГ и уровень метилирования) в выборке людей 80 лет и старше и в выборке лиц молодого и среднего возраста;
  2. исследовать изменение свойств комплекса РГ при репликативном старении 5 штаммов фибробластов кожи доноров различного возраста, геномы которых значительно различаются по свойствам комплекса РГ;
  3. исследовать взаимосвязь свойств комплекса РГ и маркеров старения (содержание теломерного повтора, уровень апоптоза, максимальное число пассажей) для 5 штаммов фибробластов кожи человека;
  4. изучить влияние свойств комплекса РГ культивируемых фибробластов на устойчивость клеток к апоптозу, индуцируемому окислительным стрессом.


Научная новизна. Впервые показано, что количество АкРГ у людей, достигших 80-летнего возраста, варьирует в пределах достаточно узкой «адаптивной» нормы. Впервые найдено объяснение противоречивым результатам относительно снижения числа копий и изменения уровня метилирования РГ при старении: обнаружено, что при старении происходит потеря высокометилированных кластеров неактивных РГ, если таковые присутствовали в геноме. Впервые показано, что свойства комплекса РГ не влияют на нормальное репликативное старение культивируемых фибробластов, но влияют на устойчивость клеток к апоптозу, который индуцируется факторами внешней среды (в данном случае хроматом калия). Впервые обнаружено, что клетки с большим количеством АкРГ характеризуются значительно более высоким уровнем эндонуклеазной активности, чем в контроле.

Научно-практическая значимость работы. Данные о количестве АкРГ в геномах людей старческого возраста могут быть полезным при составлении прогнозов длительности жизни и риска развития патологии, индуцируемой окислительным стрессом, у различных возрастных групп населения. Данные о влиянии количества АкРГ в геноме клетки на изменения уровня апоптоза при действии повреждающих факторов внешней среды могут оказаться полезными при разработке схем клеточной терапии. Описана схема анализа ряда маркеров, которые позволяют прогнозировать различия в длительности пролиферативного периода и в уровне спонтанного апоптоза в культурах клеток уже на ранних пассажах, что также может иметь значение для клеточных технологий.

Положения, выносимые на защиту.

  1. В выборке людей старческого возраста по сравнению с людьми среднего возраста значительно сужены интервалы варьирования общего числа копий РГ в геноме и количества активных копий РГ. Комплекс РГ старых людей практически не содержит высокометилированных кластеров «молчащих» рибосомных копий.
  2. При репликативном старении культивируемых фибробластов кожи человека геном теряет высокометилированные кластеры копий РГ. При репликативном старении происходит значительное повреждение первичной структуры рДНК, что проявляется в значительном занижении данных real-time ПЦР.
  3. Скорость репликативного старения фибробластов кожи и маркеры старения (содержание теломерного повтора и уровень спонтанного апоптоза) не зависят от свойств комплекса РГ и от возраста доноров кожи.
  4. При действии хромата калия, индуцирующего дополнительный окислительный стресс, относительные изменения в уровне апоптоза клеток отрицательно коррелируют с количеством активных копий РГ в геноме.
  5. Уровень эндонуклеазной активности в лизатах (и степень фрагментации внеклеточной ДНК) при нормальном культивировании и в условиях индуцированного окислительного стресса положительно коррелируют с количеством активных копий РГ в геноме клеток.

Личный вклад автора. Основные результаты исследования получены и оформлены лично автором в лаборатории молекулярной биологии ГУ МГНЦ РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК МОН РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка использованной литературы. Список литературы содержит 148 источников, из них 15 отечественных и 133 зарубежных авторов. Работа изложена на 116 страницах машинописи. Текст содержит 38 рисунков и 6 таблиц.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на семинаре ГУ Медико-генетического центра РАМН 15 октября 2008г. Результаты были представлены на 70-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2005); на международной конференции «Новые направления в радиобиологии» (Москва, 2007); на 6 европейском конгрессе «Healthy and active ageing for all Europeans» (Санкт-Петербург, 2007); на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Анализируемая выборка. Образцы периферической крови у людей старческого возраста (100 доноров в возрасте от 80 до 100 лет, средний возраст 83 ± 3, мужчины и женщины) собраны сотрудниками госпиталя №1 ветеранов войны (г. Москва, главврач Местергази Г.М.) и предоставлены нам сотрудниками лаборатории общей цитогенетики МГНЦ РАМН (рук.проф. Ляпунова Н.А.). Сбор образцов периферической крови у контрольной группы проводился сотрудниками Медико-генетического научного центра РАМН (г. Москва). Обследовано 336 доноров в возрасте от 19 до 70 лет (средний возраст 46 ± 15 лет). У пяти из этих доноров были получены биопаты кожи для исследования репликативного старения.

ДНК выделяли из 0,5 мл периферической крови, суспензии клеток или среды культивирования фибробластов методом экстракции органическими растворителями. Концентрацию ДНК определяли флуориметрически на спектрофлуориметре «LS 55» («PerkinElmer», Англия) c использованием красителя, малозависимого от длины ДНК (RiboGreen®, возб =487нм, флу=525нм) и зависимого (Hoechst 33528, возб =350 нм, флу=450 нм).

Концентрацию выделенной РНК определяли флуориметрически с использованием РНК-связывающегося красителя Quant-iTTM RiboGreen RNA reagent (MoBiTec), возб=487 нм, флу=524 нм.

Содержание повторяющихся последовательностей генома определяли с помощью метода количественной дот-гибридизации с фотобиотинированными зондами, который подробно описан ранее (Вейко Н.Н. и соавт., 2003). Для определения количества рДНК использовали зонд pHRGВВ-28S (порядковый номер нуклеотидов 9346-10783, HSU 13369, GeneBank), описанный ранее (Вейко Н.Н. и соавт., 1996).

Приготовление препаратов метафазных хромосом, окраску ядрышка лимфоцитов серебром, определение количества АкРГ и анализ активных РГ в интерфазных ядрах лимфоцитов проводили сотрудники лаборатории Общей цитогенетики ГУ МГНЦ РАМН Косяковой Н.В., Мандрон И.А., Еголиной Н.А., Мхитаровой Е.В., Цветковой Т.Г. (рук. проф. Н.А.Ляпунова), применяя вариант метода Ag - окраски, разработанный в лаборатории (Ляпунова Н.А. и соавтр., 2001). Для анализа мы использовали микроскоп Axioplan и цифровую камеру RETIGA 2000R («IMAGING», Канада). Изображения анализировали с использованием компьютерной программы анализа изображений («ИнтерЭВМ», Москва). Для оценки изменения активности ядрышка определяли число гранул серебра и их суммарную площадь не менее чем в 150 интерфазных ядрах.

Культивируемые линии фибробластов были получены из образцов кожи доноров сотрудниками лаборатории Молекулярной биологии ГУ МГНЦ РАМН Т.Д. Смирновой и Л.А. Каменевой. Клетки культивировали в среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 370С в условиях насыщающей влажности в атмосфере 3-5% СО2. Клетки (1/3 от общего количества) пересевали примерно 1 раз в три дня, далее культивировали до субконфлуентного состояния и вновь пересевали.

Схема эксперимента по исследованию действия хромата калия. В лунки 24-луночного планшета («Nunc») вносили 30-50 тыс. клеток, культивировали 3 суток до образования монослоя (100-200 тыс. клеток). Добавляли в среду 4 или 6 мкМ K2CrO4 и инкубировали 4 часа («ранний» ответ на стресс) и 24 часа. Заменяли среду и культивировали клетки в течение 72 часов («поздний» ответ). Для каждой концентрации K2CrO4 и в контрольных вариантах через определенные интервалы времени анализировали клетки с трех-шести лунок планшета.

Ферментативную активность каспазы 3 определяли в белковых лизатах клеток с использованием субстрата QAc-DEVD-AFC, возб=400 нм, флу=490 нм. Реакцию проводили при 33оС в течение 1 часа. Активность каспазы 3 выражали в расчете на единицу ДНК.

Нуклеазную активность определяли методом, разработанным в лаборатории Молекулярной биологии ГУ МГНЦ РАМН, с использованием модельного субстрата – комплекса однонитевой ДНК с 30-звенным олигонуклеотидом, содержащим на 5-конце флуоресцентную группу, а на 3-конце тушитель флуоресценции. При гидролизе эндонуклеазами целостность молекулы олигонуклеотида нарушается, что приводит к разгоранию флуоресценции R6G (возб=524 нм, флу=558 нм). Для калибровки использовали стандартный раствор ДНКазы 1.

Для количественной оценки содержания гена 18S рРНК в геномной ДНК применили метод ПЦР по принципу «TaqMan». Использовали модифицированные олигонуклеотиды («Синтол», Москва), которые на 5-конце содержали карбоксиметилфлуоресцеин (R6G) или флуоресцеин (FAM), на 3-конце – тушитель флуоресценции BQH1. Реакцию ПЦР проводили в приборе Rotor Gene 300 (Сorbett, Австралия).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Statgraphics, Statistica 6.0 и StatPlus. Распределения анализировали по методу Колмогорова-Смирнова. Средние значения величин сравнивали с использованием t-критерия. На всех графиках, если не оговорено особо, приводится стандартная ошибка (SE).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Число копий РГ и относительное количество АкРГ в геномах людей старческого возраста (СВ) и группы сравнения (ГС)

В табл. 1 и на рис. 1 приведены данные об общем числе копий РГ и об относительном количестве АкРГ в геномах людей СВ и ГС. Наблюдается значительное сужение распределения числа копий РГ в группе СВ по сравнению с ГС: уменьшается интервал варьирования и снижается величина дисперсии. По критерию Фишера дисперсии для выборок СВ и ГС различаются.

Рис. 1. Частотное распределения общего числа копий РГ (а) и относительного количества АкРГ (б) в геномах людей СВ и ГС.

Таблица 1.

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»