WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

1

0,93

2,38

1

1,06

2,22

HD

31

28,97

26,08

26

27,66

25,35

HH

75

70,09

71,54

67

71,28

72,44

D

33

15,42

28

14,89

H

181

84,58

160

85,11

По частотам аллелей и генотипов мутации H63D различий между двумя группами обнаружено не было. Данный факт свидетельствует в пользу того, что именно мутация C282Y, а точнее гомозиготность по этой мутации, вносит наибольший вклад в повышение показателей ферритина и насыщения трансферрина у молодых лиц с признаками НГХ в канадской популяции.

Для того чтобы понять, с какого возраста целесообразнее начинать проводить генетическую диагностику НГХ 1-го типа у пациентов с повышенными показателями железа выборка канадских пациентов была подразделена на 3 группы: 0-10 лет, 11-20 лет, 21-30 лет. Соотношение лиц по возрастам между группой пациентов с повышенными и с нормальными показателями железа не отличалось друг от друга (p=0,16) (табл. 5). Последнее свидетельствует в пользу того, что повышение показателей ферритина и насыщения трансферрина не зависит от возраста.

Поскольку, группа лиц с повышенными показателями обмена железа «обогащена» гомозиготами по мутации C282Y, а повышение уровней ферритина и насыщения трансферрина не зависит от возраста, то исключать НГХ 1-го типа следовало бы среди пациентов всех возрастов. К сожалению, в нашей группе гомозиготных по C282Y пациентов младше 14 лет не оказалось. Поэтому определенно можно говорить лишь о возрастном уровне отсечки в 14 лет, т.е. подростковом возрасте (рис. 2).

Графики показывают, что после этого возраста практически у всех пациентов уровни ферритина и насыщения трансферрина уже повышены. При этом уровень ферритина у разных людей варьирует в больших пределах, тогда как уровень насыщения трансферрина у всех кроме двух пациентов оказался выше нормы. Для исключения влияния на показатели наличия мутаций в других генах, связанных с обменом железа в организме, 22 пациента этой группы были просеквенированы на наличие мутаций в генах гемоювелина (HJV) и гепсидина (HAMP). Ни у одного из них мутаций в указанных генах найдено не было.

Обнаруженная особенность проявления биохимических маркёров НГХ 1-го типа у молодых лиц, гомозиготных по мутации C282Y HFE, позволяет сделать вывод о целесообразности проведения молекулярно-генетического анализа на наличие мутаций в гене HFE детям и подросткам с признаками перегрузки организма железом. Это позволит своевременно, не дожидаясь манифестации клинических симптомов, начать эффективное лечение по выведению излишка железа из организма.

А

Б

Рис. 2. Уровни ферритина (А) и насыщения трансферрина (Б) у канадских пациентов, гомозиготных по мутации C282Y гена HFE, в зависимости от пола и возраста

2. Молекулярно-генетические причины гемохроматоза молодого возраста, не связанного с мутациями гена HFE

В качестве попытки обнаружения других причин гемохроматоза у молодых лиц группы риска канадского происхождения было проведено секвенирование кодирующих областей и экзон-интронных соединений генов HJV, HAMP и FPN1. Семья с мутацией в гене HJV

Пробанд J. в возрасте 13 лет обратился в больницу для обследования по поводу задержки полового развития. При обследовании гормонального статуса пациента было выявлено низкое содержание тестостерона. В возрасте 18 лет после обнаружения выраженной кардиомиопатии, требовавшей сердечной трансплантации, был заподозрен диагноз ювенильного гемохроматоза. Определение показателей обмена железа выявило значительное увеличение уровней ферритина (1328мкг/л) и насыщения трансферрина (100%). Сразу были назначены лечебные флеботомии, которые вскоре привели к значительному улучшению сердечной функции, в результате чего пациент больше не нуждался в трансплантации. Оказалось, что старший брат пробанда (D, 21 год) тоже обладал очень высокими показателями обмена железа (ферритин 2467мкг/л; насыщение трансферрина 96%). Интересен тот факт, что даже при таких высоких показателях у него не было диагностировано ни гипогонадизма, ни нарушения сердечной деятельности. Сестра-близнец пробанда не проявляла ни клинических, ни биохимических признаков гемохроматоза (рис. 3).

Пробанд и его родственники первой степени родства были протестированы на наличие мутаций в генах HJV, HAMP и FPN1. Также они были обследованы на наличие частых мутаций C282Y и H63D гена HFE. В генах HAMP и FPN1 никаких мутаций обнаружено не было. В 4-м экзоне гена HJV зарегистрирована наиболее часто встречаемая среди пациентов с признаками ювенильного гемохроматоза мутация G320V. На основании гаплотипирования, проведенного в содружественной лаборатории, оказалось, что отец пробанда является гетерозиготным носителем делеции в гене HJV, а пробанд и его брат - компаундными гетерозиготами G320V/del. Здоровая сестра пробанда оказалась гетерозиготной носительницей делеции, унаследованной от отца, второй нормальный аллель она унаследовала от гетерозиготной по мутации G320V матери. Все сибсы обследованной канадской семьи западноевропейского происхождения так же были гетерозиготными носителями мутации C282Y гена HFE.

Рис. 3. Родословная семейного случая ювенильного гемохроматоза 2А типа

Известно, что мутация G320V гена HJV сопровождается уменьшением уровня гепсидина в моче (Papanikolaou G., 2004). Гепсидин, являясь ключевым регулятором гомеостаза обмена железа в организме, осуществляет контроль за абсорбцией элемента в кишечнике. При нарушении его влияния на этот процесс в организме начинает накапливаться чрезмерное количество железа.

Таким образом, диагноз ювенильного гемохроматоза 2А типа в описанной семье был подтвержден молекулярно-генетически. На примере описанной семьи видно, что при одинаковом патологическом генотипе даже у родственников (пробанд и его брат) проявления заболевания могут сильно варьировать. Безусловно, существует целый ряд как генетических, так и средовых модифицирующих факторов, влияющих на степень выраженности признаков патологического состояния. К сожалению, на сегодняшний день большинство из них пока не известно.

Семья с заменами ДНК в генах HAMP и FPN1

Пробанд 23-х лет обладал повышенными уровнями ферритина 336мкг/л и насыщения трансферрина 94% и жаловался на чувство чрезмерной утомляемости, впервые появившееся в возрасте 21 год (рис. 4). Генотипирование на наличие мутации С282Y в гене HFE определило нормальный генотип. Секвенирование генов HJV, HAMP и FPN1 выявило несколько изменений: гомозиготное состояние по неизвестной замене во 2-м интроне гена HAMP (IVS2+12A>C) и гетерозиготное носительство замены IVS4+20C>T в 4-м интроне гена FPN1.

Рис. 4. Родословная пациента с признаками ювенильного гемохроматоза

Для более четкого понимания значимости обнаруженных изменений в развитии признаков гемохроматоза было решено проанализировать остальных членов семьи пробанда (брат, отец и мать). Все родственники пробанда 1-ой степени родства имели нормальные показатели обмена железа. При секвенировании брата и матери было выявлено гетерозиготное носительство по обеим нуклеотидным заменам. Отец пробанда оказался гетерозиготой по замене IVS2+12A>C в гене HAMP, но не был носителем второй замены в гене FPN1. Из характера распределения биохимических показателей обмена железа и генотипа родственников 1-ой степени родства складывается впечатление о большей значимости замены HAMP. К тому же обнаруженная замена гена HAMP (IVS2+12A>C), находилась значительно ближе к экзон-интронному сочленению (12-е положение). Известно, что по мере удаления от экзон-интронного сочленения вероятность влияния изменения ДНК на функционирование гена уменьшается. В то же время, в пользу значимости этой замены свидетельствует тот факт, что она была обнаружена в гомозиготном состоянии лишь у пробанда с ярковыраженными клиническими и биохимическими признаками НГХ. Гетерозиготное носительство замены гена HAMP даже у людей в значительно более позднем возрасте (мать, 51 год и отец, 53 года) не приводило ни к каким проявлениям. Безусловно, для однозначного ответа на вопрос, является ли замена IVS2+12A>C гена HAMP значимой для развития заболевания, необходимо более детальное её изучение.

Большая семья с новой мутацией в гене FPN1

В клинику обратилась женщина с 4-мя детьми. Самой женщине 42 лет, родом из канадской семьи скандинавского происхождения, на основании жалоб на боли в суставах и животе, а также высоких показателей ферритина сыворотки крови 2248 мкг/л (N 10-200 мкг/л) и насыщения трансферрина 65% (N < 45%) ранее был поставлен диагноз гемохроматоза. У всех детей женщины (15-20 лет) отмечены высокие уровни ферритина (274-977мкг/л) на фоне нормальных показателей насыщения трансферрина (25-46%). Незадолго до этого на основании клинических проявлений артралгии и гиперпигментации кожи, а также уровня ферритина 8000 мкг/л и насыщения трансферрина 92%, сестре отца пробанда (III.3) был так же поставлен диагноз гемохроматоза (рис. 5).

Пробанд и его ближайшие родственники были проанализированы на наличие мутаций C282Y и H63D в гене HFE. Диагноз гемохроматоза 1-го типа не подтвердился. Поскольку у детей пробанда (15-20 лет) отмечены высокие уровни ферритина на фоне нормальных показателей насыщения трансферрина, что было описано для гемохроматоза 4-го типа, было решено провести секвенирование ДНК пробанда и её ближайших родственников на наличие мутаций в гене ферропортина (FPN1; SLC40A1).

В результате секвенирования гена ферропортина было обнаружено гетерозиготное носительство неизвестной ранее мутации N185D (c.553A>G) пробандом и всеми детьми, в то время как муж имел генотип дикого типа. После обнаружения мутации ещё 21 член 4-х поколений семьи со стороны отца пробанда был протестирован на наличие N185D с помощью методики рестрикционного анализа. Наличие мутации N185D в гетерозиготной форме ассоциировалось с клиническим и биохимическим диагнозом гемохроматоза (p<<0,001; X2=13,4) (рис. 5).

Одиночная замена нуклеотида c.553A>G находится в 6-м экзоне гена и ведёт к замене аспарагиновой кислоты на аспарагин в позиции 185-ой аминокислоты белка ферропортина (N185D). Согласно последней предположительной модели строения белка ферропотина, мутация N185D вызывает изменение структуры аминокислотной последовательности на границе внутриклеточного и трансмембранного доменов (Liu X-B. et al., 2005). Использование специальных браузеров (UCSC genome browser (http://genome.ucsc.edu/)) не определило данную замену нуклеотидов как полиморфизм. Более того, скрининг ДНК 50-ти контрольных образцов не обнаружил этой мутации. Данная нуклеотидная замена находится в последовательности 28 аминокислот (173 – 200), консервативной для различных видов животных. Это указывает на важную роль этого участка для обеспечения правильного строения и адекватного функционирования протеина.

Рис. 5. Родословная семейного случая гемохроматоза 4-го типа

Женщины обозначены круглыми знаками, мужчины - квадратными. Закрашенные знаки – носители мутации N185D гена FPN1 с клиническими и/или биохимическими проявлениями, заштрихованный знак – пресимптоматический носитель мутации. Пронумерованные лица, за исключением III.7, протестированы на наличие N185D.

Пробанд слабо реагировала на лечение терапевтическими флеботомиями, вскоре после начала которых у неё развилась анемия. Врачами был разработан индивидуальный режим кровопусканий данной больной. Трое из четверых детей V.5, V.6, V.7 и V.8 двух сестёр, носительниц мутации, с установленным диагнозом гемохроматоза, находящихся на лечении флеботомиями, тоже оказались носителями N185D. В силу слишком юного возраста пациенты не проявляли клинических симптомов заболевания. Однако биохимическое исследование показателей железа двоих из носителей N185D мутации 6-ти летних мальчиков-близнецов (V.6; V.7) выявило высокие показатели ферритина сыворотки крови (109; 220 мкг/л) (N 13-66 мкг/л). Анализ биохимического фенотипа носителей N185D мутации выявляет повышенные уровни ферритина крови во всех случаях, для которых информация об этом показателе была доступна. Важно отметить, что наблюдается тенденция к росту показателей железа в зависимости от возраста (рис. 6).

Все мутации гена FPN1 подразделяются на 2 основных типа: потери функции и усиления функции. Обнаруженная нами мутация N185D, по всей видимости, относится к группе потери функции, т.к. биохимические характеристики её носителей очень похожи на аналогичные при носительстве описанной ранее и отнесенной к этой группе мутации A77D (рис. 6). Последняя ведёт к потере функции ферропортина, обусловливая неспособность ретикулоэндотелиальных клеток выводить железо из их внутриклеточной среды. В такой форме Fe не доступно для эритропоэза, что, в свою очередь, усиливает абсорбцию элемента в тонком кишечнике.

А

Б

Рис. 6. Концентрация ферритина (А) и уровень насыщения трансферрина (Б) в зависимости от возраста (на момент постановки диагноза) у носителей мутации N185D в сравнении с носителями описанной ранее мутации A77D гена FPN1

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»