WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

2. Группа больных со спорадической формой БП (189 человек).

Контрольная группа состояла из 161 индивидуумов старше 85 лет, состоящих на учёте в Санкт-Петербургском Городском Гериатрическом Центре. Все члены контрольной группы проходили обследование у невролога с целью исключения диагноза БП и других нейродегенеративных заболеваний. Данная выборка является спорадической и принадлежит к тому же географическому региону, что и включенная в анализ группа лиц с БП.

Во всех обследованных группах был осуществлен забор крови для последующего молекулярно-генетического анализа. Данная работа одобрена этическим комитетом СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, протокол №79 от 20 февраля 2007 года.

Экспериментальные методы.

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис Т. и др., 1984). Лизис клеток проводили по методу Канкеля (Lahiri D. K. et al., 1992). ПЦР проводили на автоматическом термоциклере Терцик (ДНК-Технология, Москва).

Идентификация мажорных мутаций (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, I2012T) в гене LRRK2 осуществлялась методом ПЦР и рестрикционного анализа. Нормальный и мутантный аллели различали по длине рестрикционных фрагментов, используя электрофорез в 8% ПААГ с окраской раствором бромистого этидия.

Для идентификации мутаций G2019S в экзоне 41 гена LRRK2 был разработан метод ПЦР с введением сайта рестрикции для эндонуклеазы BsuRI в амплифицируемый фрагмент и последующего рестрикционного анализа ПЦР-продуктов с использованием данной эндонуклеазы. Для идентификации мутаций R1441C/G/H в экзоне 31 гена LRRK2 был также разработан оригинальный метод на основе ПЦР фрагмента гена LRRK2, содержащего мутации R1441C/G/H, и последующего рестрикционного анализа ПЦР-продуктов с использованием эндонуклеазы Bsh 1236I. Для поиска мутаций I2012T, I2020T в экзоне 41 гена LRRK2 разработан метод на основе ПЦР и последующего рестрикционного анализа ПЦР-продуктов с использованием эндонуклеазы Bse MI. Все выявленные мутации были подтверждены методом прямого секвенирования на приборе ABI 377.

Для секвенирования 51 экзона гена LRRK2 у больных с аутосомно-доминантной формой БП (83 пациента) были выбраны праймеры, фланкирующие 51 экзон и экзон-интронные стыки. ПЦР фрагментов, включающих экзоны гена LRRK2, проводилась на приборе ICycler (BIO-RAD, США) c использованием смеси для ПЦР Roche PCR Mix, при добавлении соответствующих праймеров. Реакция терминирования проводилась с использованием кита Big Dye Terminator (version 3,1) Cycle Sequencing Ready Reaction DNA Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) на приборе ICycler (BIO-RAD США). Образцы анализировались на приборе ABI PRISM 3100 Genetic Analyzers (Applied Biosystems, Foster City, CA). Анализ результатов секвенирования проводился с использованием программного обеспечения Sequencher™ 4.14.(Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).

Для скрининга выявленной мутации V1613A в экзоне 34 гена LRRK2 был также разработан оригинальный метод на основе ПЦР и последующего рестрикционного анализа ПЦР-продуктов с использованием эндонуклеазы Bsh1236I. Нормальный и мутантный аллели различали по длине рестрикционных фрагментов, используя электрофорез в 12% ПААГ с окраской раствором бромистого этидия.

Статистический анализ был проведен с использованием программы Statistica версия 6.0 для Windows XP. Для сравнения клинической характеристики между групп больных использовался критерий, при малочисленных группах с поправкой Йетца. Сравнение среднего возраста пациентов проводилось с помощью критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при P < 0,05.

Результаты и обсуждение

Сопоставление клинического течения заболевания у пациентов с БП в зависимости от выбранных параметров.

Для сопоставления клинического течения БП было отобрано 160 пациентов, страдающих БП, пять и более лет. Эта подгруппа больных была создана исходя из того, что данное заболевание имеет прогрессирующий характер и с течением времени у пациентов, страдающих БП, в клинической картине к дебютным проявлениям добавляются новые дополнительные симптомы заболевания, что может привести к изменению клинической формы болезни. Сопоставление клинической картины БП в подгруппах проводилось по следующим параметрам: пол, наличие у больного определенной формы заболевания: треморной, акинетико-треморной, акинетико-ригидно-треморной, акинетико-ригидной, ригидно-треморной; средний возраст пациентов, средний возраст начала заболевания, наличие положительного эффекта и побочных явлений при лечении Л-ДОФА-содержащими препаратами. Последние два параметра оценивалась только у той части больных, которая получала препараты содержащие Л-ДОФА.

При сопоставлении клинического течения заболевания у пациентов с длительностью БП пять лет и более в нашем исследовании было обнаружены следующие закономерности: треморная форма БП преобладает у женщин по сравнению с мужчинами (p=0,007), а также при семейной БП по сравнению со спорадической (р=0,009); акинетико-ригидно-треморная форма преобладает у мужчин (р=0,003); ригидно-треморная форма достоверно чаще встречается в спорадических случаях с началом заболевания после 50 лет по сравнению с семейной формой БП (р=0,04).

В литературе ранее описано превалирование треморной формы БП у женщин по сравнению с мужчинами (Haaxma C.A. et al., 2007), что согласуется с полученными нами данными. Однако необходимо отметить, что существуют исследования, в которых не было выявлено каких-либо клинических особенностей БП в зависимости от пола (Scott B. et al., 2000).

Ранее проводилось сопоставление клинического течения БП у пациентов с семейной формой заболевания и у больных со спорадической формой БП (Carr J. et al., 2003). При этом анализировались следующие параметры: пол, возраст начала заболевания, наличие тремора в клинической картине болезни, побочных эффектов при приеме Л-ДОФА-содержащих препаратов. Было показано, что течение заболевания по данным параметрам у пациентов с семейной формой БП и со спорадической формой заболевания не отличается (Carr et al., 2003). В нашем случае выявлено преобладание треморной формы заболевания при семейной БП по сравнению со спорадической, а ригидно-треморной формы - в спорадических случаях с началом заболевания после 50 лет по сравнению с семейной формой БП.

Скрининг мажорных мутаций в гене LRRK2 у больных БП.

Идентификация мутаций (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, I2012T) осуществлялась у 278 пациентов с БП разработанными нами методами на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом. Было обнаружено:

  1. в 41 экзоне гена LRRK2 нуклеотидная замена гуанина на аденин в положении 6055 в гетерозиготном состоянии, приводящая к замене глицина на серин в положении 2019 (G2019S) у пяти пробандов с семейной формой БП (5/85, 5,9%) и у одного пациента со спорадической формой БП (1/189, 0,5%).
  2. в 31 экзоне гена LRRK2 нуклеотидная замена C4321T в гетерозиготном состоянии, приводящая к замене аргинина в 1441 положении на цистеин (мутации R1441C), у одного пациента со спорадической формой БП (1/189, 0,5%).

Мутация G2019S.

Родословные пяти семей с БП, обусловленной мутацией G2019S представлены на рис. 1. Молекулярно-генетический анализ был проведен у кровных родственников пробандов. В одной семье PD1 выявлено два носителя мутации, оба пациента страдают БП. В семье PD2 мутация G2019S обнаружена у двух человек: больного БП и его сына, у которого на момент осмотра данных за неврологическую патологию нет. У всех пробандов мутация выявлена в гетерозиготном состоянии. Анализ всех пяти родословных позволяет говорить о аутосомно-доминантном наследовании БП в этих семьях.

Мутация G2019S расположена в киназном домене дардарина и приводит к увеличению его киназной активности, что соответствует доминантному наследованию с предположительным “gain off function” механизмом (Giasson B.I. et all., 2006; West A.B. et all., 2007; Giasson B.I., Van Deerlin V.M., 2008).

По литературным данным, мутация G2019S является наиболее распространенной из всех описанных в гене LRRK2 мутаций среди больных БП. В данном исследовании мутация G2019S была обнаружена в 5,9% случаев среди пациентов с семейной формой БП и не обнаружена в контрольной группе больных. Интересно отметить, что все выявленные носители мутации G2019S сообщали о происхождении, связанном с евреями-ашкенази, что не удивительно, принимая во внимание высокую частоту этой мутации среди данной популяции (Lesage S. et all., 2005; Ozelius L.J. et all., 2006). Анализ гаплотипов показал, что есть эффект основателя для мутации G2019S в пределах популяций, но европейский эффект основателя отличается от редкого японского G2019S гаплотипа. Это наводит на мысль, что данная мутация происходит, по крайней мере, дважды, но становиться широко рассеянной среди популяций (Dawson T.M., 2007).

Таким образом, частота встречаемости мутации G2019S среди больных с семейной формой БП в северо-западном регионе России соответствует данным, полученным для европейских популяций.

Рис. 1. Родословные пяти семей (PD1-PD5) с мутацией G2019S в гене LRRK2.

Закрашенные элементы показывают членов семей с БП. Внизу элементов обозначены: генотип (m – гетерозиготное носительство мутации G2019S; n – отсутствие мутации), возраст на момент исследования и возраст начала заболевания (указан в скобках).

В европейских популяциях мутация G2019S обнаруживается в 0.6-1.6% спорадических случаев (Di Fonzo A.D. et al., 2005; Gilks W. et.al., 2005). В данном исследовании мутация G2019S найдена в 0,5 % случае. Таким образом, частота мутации G2019S в Северо-Западном регионе России соответствует полученным данным в европейской популяции.

Кроме того, наши данные по частоте встречаемости мутации G2019S соответствуют данным, полученным по распространению данной мутации среди больных БП со спорадической формой БП для г. Москвы: мутация G2019S обнаружена в 0,7% спорадических случаев БП (Шадрина М. И. и др., 2007).

Мутация R1441C.

В нашей выборке больных с БП у одного больного выявлена мутация R1441C. Кроме того, у одного пациента со спорадической формой БП мы выявили ранее неописанную нуклеотидную замену С4323Т (R1441R). На сегодня в положении 1441 описано три аминокислотные замены (R1441C/G/H). Все вышеуказанные нуклеотидные замены в кодоне (R1441) локализуются в области СpGCpG-островков. Цитозин в районе СpGCpG-островков обычно метилирован, что может объяснять повышенную частоту транзиций СТ в данной области (Горбунова В.Н., Баранов В.С., 1997).

Считается, что мутация R1441C является второй из наиболее часто встречающихся изменений в гене LRRK2. Необходимо подчеркнуть, что в нашем исследовании в отличие от лиц, носителей мутации G2019S, пациент с БП, обусловленной мутацией R1441C имел славянские корни. Анализ гаплотипов показал, что для мутации R1441C эффект основателя может быть выявлен для четырех независимых популяций (Haugarvoll K. et al., 2008).

Поиск мутаций в кодирующей области гена LRRK2. Мутация V1613A.

В группе больных с семейной формой БП был осуществлен поиск мутаций в кодирующей области гена LRRK2 с использованием метода прямого секвенирования. В исследование были включены лица, у которых не было выявлено мутаций в гене LRRK2 методом ПЦР и рестрикционного анализа (83 пациента). В результате в 34 экзоне нами впервые была выявлена нуклеотидная замена тимина на цитозин в положении 4838, приводящая к замене валина на аланин в положении 1613 (V1613A) у одного пробанда (1/85, 1,2%). В группе больных со спорадической формой БП поиск данной мутации осуществлялся разработанными нами методами ПЦР и рестрикционного анализа. В данной группе пациентов, а также в контрольной группе данной мутации не обнаружено. Кроме этой мутации в различных экзонах гена LRRK2 обнаружено 15 ранее описанных однонуклеотидных полиморфизмов.

Родословная семьи с БП, обусловленной мутацией V1613A представлена на рис 2а. Наследование БП в данной семье происходит по аутосомно-доминантному типу. Мутация V1613A обнаружена в гетерозиготном состоянии у брата и сестры. Все члены семьи являются этническими славянами.

Выявленная мутация располагается в функционально значимом домене гена LRRK2 - COR домене. Кроме того, выявленная мутация приводила к замене консервативного аминокислотного остатка в эволюционном ряду (рис 2b). Эти результаты дают возможность предположить патогенетическую роль данной аминокислотной замены. Интересно, что в вышеописанном домене гена LRRK2 ранее была описана мутация Y1699C (Zimprich A., et al., 2004). Ее патогенетическая значимость подтверждена в ряде исследований, кроме того показано, что клиническое течение у больных с мутацией Y1699C отличается от типичной БП (Giasson B.I., Van Deerlin V.M., 2008; Khan N.L. et al.,2005; Giasson B.I. et al., 2006; Zhu X. et al., 2006).

Рис. 2. Мутация V1613A в гене LRRK2:

a) Родословная семьи PD6 с мутацией V1613A в гене LRRK2. Внизу элементов обозначены: генотип (m – гетерозиготное носительство мутации V1613A), возраст на момент исследования и возраст начала заболевания (указан в скобках).

b) Аминокислотная последовательность области LRRK2 белка, содержащей мутацию V1613A человека, а также шимпанзе, мыши и быка.

c) Хроматограмма, показывающая 4838TC замену (V1613A): 1 – генотип дикого типа; 2 – гетерозиготное носительство. Приведён сиквенс антисмысловой цепи.

Клиническое течение БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2.

Клинические проявления заболевания у лиц с БП представлены в таблице 1.

Таблица 1. Клиническая характеристика обследованных больных с БП, обусловленной выявленными мутациями гена LRRK2.

Пациент

Мутации

Семья

Пол

Возраст

Возраст начала заболевания

Симптомы БП на момент начала заболевания

Симптомы заболевания на момент осмотра

Эффективность терапии Л-ДОФА

Побочные эффекты терапии Л-ДОФА

Т

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»