WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

ИВАНОВА Ольга Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА ЛЕЙЦИНБОГАТОЙ КИНАЗЫ 2 (LRRK2) У ЛИЦ С БОЛЕЗНЬЮ ПАРКИНСОНА

03.00.15 – генетика

14.00.13 – нервные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2008

Работа выполнена в отделе молекулярно-генетических технологий НИЦ Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова.

Научные руководители:

кандидат биологических наук,

Пчелина Софья Николаевна

доктор медицинских наук, профессор

Якимовский Андрей Федорович

Официальные оппоненты:

кандидат медицинских наук,

Воскобоева Елена Юрьевна

доктор медицинских наук, профессор

Иванова-Смоленская Ирина Анатольевна

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН,

Санкт-Петербург

Защита состоится « » ______________ 2008 г. в ____ часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.016.01 в ГУ МГНЦ РАМН по адресу: 115478, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан « » _____________ 2008 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 001.016.01,

доктор медицинских наук Зинченко Р.А

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Болезнь Паркинсона (БП) – одно из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний среднего и пожилого возраста, впервые была описана Джеймсом Паркинсоном в 1817 году как дрожательный паралич. БП является хронической неуклонно прогрессирующей болезнью, которая встречается во всех популяциях мира. Частота встречаемости данного заболевания среди лиц старше 65 лет составляет 1-3% (Mata I.F. et al., 2005; Zhu X. et al., 2006). Основным в клинике БП является следующий симптомокомплекс: повышенный тонус скелетной мускулатуры по экстрапирамидному типу, пониженная двигательная активность (брадикинезия), низкочастотный тремор покоя конечностей и других частей тела, постуральная неустойчивость. Диагноз БП может быть поставлен только при наличии не менее двух из указанных симптомов. Однако, клинический диагноз, даже при развернутой картине заболевания не всегда находит нейрогистопатологическое подтверждение (Bennet D.A. et al., 1996; Bower J.H. et al., 2002).

Морфологическая картина при БП включает прогрессирующую гибель дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции (ЧС), что приводит к резкому снижению концентрации дофамина в полосатом теле, а также наличие внутриклеточных эозинофильных включений в сохраненных нейронах, получивших названия телец Леви.

Необходимо также отметить, что симптомокомплекс БП проявляется при гибели 80% дофаминергических нейронов ЧС мозга человека. Процесс нейродегенерации начинается задолго до дебюта заболевания, а когда оно становиться явным, патогенетическая терапия может быть уже не эффективной. В арсенале медицины существует метод диагностики, который позволяет поставить диагноз БП до появления клинических симптомов - позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ). ПЭТ позволяет прижизненно изучать структурно-функциональное состояние церебральных нейротрансмиттерных структур. Широкое применение данного метода в клинической практике ограничено, так как ПЭТ относиться к дорогостоящим методам и в ряде случаев является не точным (Savitt J.M. et al., 2006). Таким образом, поиск маркеров БП, позволяющих проводить раннюю диагностику заболевания, а также при необходимости дифференциальную диагностику БП с другими неврологическими заболеваниями со сходными клиническими проявлениями - остается крайне актуальным.

Достижения молекулярной генетики последних лет позволили по-новому взглянуть на проблемы этиопатогенеза, нозологической принадлежности и диагностики БП. Хотя в большинстве случаев БП носит мультифакториальный характер, около 15% больных БП имеют семейную форму БП, когда заболевание имело место у нескольких родственников из одного или разных поколений (Gasser T., 2007). Описаны семьи, где наследование заболевания происходит как по аутосомно-рецессивному, так и по аутосомно-доминантному типу.

За последние 11 лет описано одиннадцать генетических локусов, ответственных за развитие моногенных форм БП (Dawson T.M., 2007). В шести случаях удалось идентифицировать конкретные гены и провести детекцию мутаций у больных. Мутации в генах паркина (PARK2), PTEN-индуцированной киназы 1(PINK1) и DJ-1 выявлены при аутосомно-рецессивной форме БП, и мутации в генах альфа-синуклеина (SNCA), убиквитин-С-концевой гидролазы L1 (UCH-L1), лейцинбогатой киназы 2 (LRRK2) при аутосомно-доминантной форме заболевания (Gasser T., 2007). ДНК-анализ в семьях с известной молекулярной природой БП может использоваться для доклинической диагностики данного заболевания, что позволит проводить у пациентов активное профилактическое лечение, своевременно начать адекватную симптоматическую терапию.

По существующим данным наиболее частым молекулярным дефектом, ответственным за развитие наследственной формы БП, являются мутации в гене лейцинбогатой киназы 2 (LRRK2, локус PARK8), кодирующем белок, названный дардарином (Gasser T., 2007). Исследование мутаций гена LRRK2 и их изучение стало возможным после картирования хромосомного локуса PARK8 в 2002 году (Funayama M. et al., 2002). В 2004 году впервые обнаружена сегрегация мутаций в гене LRRK2 c БП в семьях (Paisan-Ruis C. et al., 2004; Zimpritch A. et al., 2004). В настоящее время у больных с аутосомно-доминантной формой БП, выявлен ряд аминокислотных замен в кодирующей области гена. В гене имеются мажорные мутации (G2019S, R1441C/G, Y1699C, I2020T), обнаруживаемые у больных БП в различных популяциях (Giasson B.I., Van Deerlin V.M., 2008). Наиболее распространенной из всех описанных в гене LRRK2 мутаций среди больных БП является мутация G2019S, которая встречается в европейских популяциях в 5-7% случаев семейной БП, но также была обнаружена в 0.6-1.6% спорадических случаев (Di Fonso A. et al., 2005; Gilks W. et al., 2005). В некоторых изолированных популяциях, например, среди арабов северной Африки и евреев-ашкенази, частота данной мутации среди семейных форм БП достигает 30-40% (Lesage S. et al., 2005; Ozelius L.J. et al., 2006). В то же время мутация G2019S не обнаружена в некоторых азиатских популяциях (Tan E.K. et al., 2005; Fung H.C. et al., 2006). Остальные мутации оказались менее распространенными, однако в ряде случаев их частота показывала сильные межпопуляционные различия. Так, неожиданно высокая частота мутации R1441G (16.4% и 4% среди семейных и спорадических форм БП, соответственно) была обнаружена среди популяции басков в Испании (Simn-Snchez J. et al., 2006).

Кодирующая область гена LRRK2 содержит 51 экзон (2527 аминокислот). Несмотря на большую протяженность гена, в ряде популяций был определен полный спектр мутаций среди больных БП (Mata I.F. et al., 2005; Di Fonzo A. et al., 2006; Paisan-Ruiz C. et al., 2008). Определение популяционной специфичности мутаций является необходимым условием для проведения молекулярной диагностики заболевания и внедрения методов ДНК-диагностики в клиническую практику. Разработка молекулярных методов диагностики БП остается особенно актуальной в силу отсутствия широкодоступных диагностических маркеров, позволяющих осуществлять диагностику заболевания на ранних стадиях БП. До настоящего времени в России спектр мутаций в гене LRRK2 среди больных БП остается неизвестным.

Изложенные выше данные явились основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования.

Выявление мутаций в гене лейцинбогатой киназы 2 (LRRK2) у лиц с БП и сопоставление клинического течения заболевания у больных БП, имеющих мутации в гене LRRK2, и пациентов с БП отличной этиологии.

Задачи исследования.

  1. Сопоставление клинического течения БП в зависимости от пола пациентов, возраста начала заболевания и наличия у них семейного анамнеза.
  2. Разработка молекулярно-генетических методов идентификации мажорных мутаций (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, I2012T) в гене LRRK2 и их скрининг в группе пациентов с БП и в контрольной группе.
  3. Поиск мутаций в кодирующей области гена LRRK2 у пациентов с семейной формой БП.
  4. Разработка методов идентификации выявленных мутации на основе метода ПЦР с последующим рестрикционным анализом и их скрининг в группе пациентов со спорадической формой БП и в контрольной группе.
  5. Молекулярно-генетическое и неврологическое обследование семей пробандов с выявленными мутациями в гене LRRK2, а также сопоставление клинического течения БП, обусловленной известным молекулярным дефектом в гене LRRK2 и БП отличной этиологии.

Научная новизна.

Впервые в России проведено определение спектра мутаций в гене LRRK2 у больных с БП. У больных с семейной формой БП выявлены мутации G2019S и V1613A. Мутация V1613A в гене LRRK2 описана впервые в мире. У больных со спорадической формой БП впервые в России выявлены мутации G2019S и R1441С. Впервые в России проведено сопоставление течения заболевания у больных с выявленными мутациями в гене LRRK2 с больными БП отличной этиологии. Впервые в мире среди больных с БП, обусловленной мутацией G2019S, отмечено преобладание побочных эффектов от терапии Л-ДОФА-содержащими препаратами. Разработаны простые методы идентификации мутаций (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, I2012T, V1613A) в гене LRRK2 на основе ПЦР и рестрикционного анализа.

Практическая значимость работы.

В данной работе охарактеризован спектр мутаций в гене LRRK2 среди больных БП Северо-Западного региона России. Разработанные нами методы экспресс-тестирования мутаций в гене LRRK2 могут быть использованы в клинической практике при выявлении наследственных форм БП, обусловленных мутациями в гене LRRK2. Это позволит проводить ДНК-диагностику членов семей больных БП, обусловленной мутациями в этом гене, и осуществлять постановку на учет к невропатологу носителей мутаций до начала проявления клинических симптомов заболевания. Такой подход может способствовать повышению эффективности лечения БП.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. В клинической картине БП выявлено преобладание определенных симптомов заболевания у пациентов в зависимости от пола, возраста начала заболевания и наличия семейного анамнеза.
  2. Среди больных семейной формой БП Санкт-Петербурга выявлено пять семей, в которых развитие БП обусловлено ранее описанной мутацией G2019S в гене LRRK2. В трех случаях из пяти клиническое течение БП в этих семьях не отличалось от классической БП.
  3. Впервые обнаружена новая мутация V1613A, приводящая к развитию семейной формы БП с преобладающим тремором.
  4. У больных со спорадической формой БП выявлены ранее известные мутации в гене LRRK2: G2019S и R1441С.
  5. В группе больных с БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2, наблюдается повышенная частота побочных эффектов при применении Л-ДОФА-содержащих препаратов.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации.

Неврологический осмотр пациентов с БП и забор венозной крови выполнены автором лично. Разработка методов ПЦР и рестрикционного анализа, скрининг мутаций в группе пациентов с БП и в контрольной группе проведены автором лично. Автор провел статистический анализ всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно.

Апробация работы.

Предложенные к защите результаты были доложены на II международном молодежном медицинском конгрессе “Санкт-Петербургские научные чтения”, Санкт-Петербург, СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова (2007), научно-практической конференции молодых ученых “Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины”, СПбМАПО (2007), конференции “Фундаментальные науки-медицине”, РАН, Москва (2006), 11 международной пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология наука ХХI века”, Москва (2007), I национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения, Москва (2008).

Публикации.

Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе опубликовано 5 статей, 3 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику.

Методы ДНК-диагностики, разработанные на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом, внедрены в работе СПбГМУ имени акад. И.П. Павлова для диагностики семейных форм БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы (96 наименования). Работа изложена на 101 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами, 17 рисунками и фотографиями.

Материалы и методы исследования

Общая характеристика групп.

Обследовано 278 пациентов с различными формами БП (274 пробанда и 4 родственника с БП), проходивших обследование на базе консультативно-диагностического центра СПбГМУ имени академика И.П.Павлова. Критериями отбора служило сочетание хотя бы двух фенотипических проявлений, характерных для БП, и исключение других нейродегенеративных заболеваний (по данным клинического осмотра и дополнительных методов исследования). Все обследованные нами пациенты были разделены две группы:

1. Группа больных с семейной формой БП с аутосомно-доминантный характером наследования (85 пробанда и четыре родственника). Характер наследования определялся при проведении клинико-генеалогического исследования.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»