WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Стимулирующий эффект гипоксии на МСК на ранних пассажах может объясняться снижением интенсивности окислительного стресса, в котором оказываются клетки в течение первых пассажей после выделения. Снижение концентрации кислорода до 5% обуславливает, с одной стороны, помещение клеток в среду, приближенную к естественным условиям in vivo, что обеспечивает меньшее напряжение антиоксидантных механизмов, и, с другой стороны, активацию ряда сигнальных путей. Таким образом, снижение in vitro концентрации кислорода в среде до 5%, по-видимому, не является “истинным” гипоксическим воздействием для культивируемых мезенхимальных стромальных клеток-предшественников, что говорит об актуальности исследования морфофункционального состояния культивируемых МСК при значительно более выраженном снижении парциального давления кислорода в среде.

Влияние аноксии на мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс. При оценке морфологических характеристик МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования при их экспозиции в нормо- и аноксии в течение 96 часов было обнаружено, что аноксия существенно не влияет на морфологическую картину культур МСК. Количество крупных распластанных клеток было примерно одинаковым как в нормоксичских культурах, так и в культурах МСК в условиях аноксии.

Оценка пролиферации МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования при их экспозиции в нормо- и аноксии в течение 96 часов, вопреки ожиданиям, показала, что в условиях аноксии не происходит ингибирования пролиферативной активности мезенхимальных стромальных клеток-предшественников (Рис.9).

Рис.9 Пролиферация МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования в нормоксии и аноксии. Представлено среднее значение прироста количества клеток (в разах) в рандомически выбранных фиксированных полях зрения в разных культуральных флаконах для различных культур и стандартная ошибка среднего, суммарные данные 7 экспериментов, различия недостоверны, р>0,01 по критерию Манна-Уитни для P2-P4 и по t-критерию для Р1.

Аноксия приводила либо к незначительной стимуляции пролиферативной активности МСК костного мозга крыс, либо не оказывала на нее никакого эффекта, в среднем, обуславливая в 1,2 раза большую пролиферативную активность по сравнению с нормоксическими условиями.

Оценка жизнеспособности МСК костного мозга крыс на 1 – 4 пассажах, культивируемых в нормо- и аноксии в течение 96 часов показала, что аноксия незначительно увеличивает суммарный процент поврежденных клеток в культурах, что происходит, главным образом, за счет активации процессов апоптоза (Рис.10).

В среднем, количество апоптотических клеток в культурах МСК костного мозга крыс статистически достоверно возрастало в два раза при их культивировании в условиях аноксии в течение 96 часов, в то время как доля некротических клеток в этих же условиях увеличивалась в 1,2 раза. Суммарный процент поврежденных как некротически, так и апоптотически клеток, в условиях аноксии был также в 1,2 раза выше по сравнению с нормоксией, что может говорить о значительной устойчивости клеток-предшественников костного мозга крыс к аноксическим условиям.

Рис.10 Жизнеспособность МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования после 96 часов экспозиции в нормоксии и аноксии. Представлено среднее количество апоптотических (AnnV+) некротических (PI+) клеток, суммарный процент поврежденных клеток для различных культур на 1-4 пассажах, а также стандартная ошибка среднего, суммарные данные 11-12 экспериментов, в каждом из которых анализировали 5-10 тыс. клеток.

Несмотря на относительную устойчивость мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс к 96-часовой аноксии, более длительная экспозиция клеток в аноксических условиях приводила к существенному снижению их жизнеспособности (Рис.11). Так, суммарный процент поврежденных клеток возрастал с 22% после первой недели культивирования до более чем 50% через неделю, а к концу третьей недели практически все клетки в культуре гибли, в то время как в нормоксических и гипоксических условиях суммарный процент поврежденных клеток оставался относительно стабильным и составлял в среднем 10%. Основным механизмом гибели клеток при длительной аноксии являлся некроз, хотя доля апоптотических клеток также возрастала значительно, что могло свидетельствовать о существенном вкладе вторичного постапоптотического некроза. Превалирование процессов некроза над процессами апоптоза в случае длительной экспозиции клеток в аноксии представляется естественным: запрограммированная клеточная гибель, в отличие от некроза, требует затрат энергии, поэтому вариант гибели обусловлен в том числе энергетическим состоянием клетки [Leist M. et al., 1997]. Таким образом, несмотря на отсутствие явно выраженного повреждающего характера аноксии при ее относительно недолговременном воздействии, увеличение времени пребывания клеток-предшественников в аноксических условиях приводило к потере их жизнеспособности. Напротив, цитопротекторное действие гипоксии, наблюдаемое при ее кратковременном воздействии, подтверждалось при увеличении времени экспозиции клеток в гипоксии. Механизмы регуляции численности клеток в условиях гипоксии, а также на начальных стадиях аноксии, видимо, связаны с апоптозом, в то время как массовая гибель клеток в более жестких аноксических условиях, главным образом, связана с некрозом.

Рис.11 Жизнеспособность МСК на начальных этапах культивирования в нормоксии, гипоксии и аноксии в течение 21 суток. Представлен средний процент поврежденных клеток в культурах и стандартное отклонение в нормоксии, гипоксии и аноксии после 1,2 и 3 недель культивирования.

Как и в случае гипоксии, мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс сохраняли свой иммунофенотип при экспозиции в аноксии в течение 96 часов (CD90+, CD45-, CD54+, CD44+, CD73+, CD106+, CD11b-, CD29+).

При исследовании остеогенного дифференцировочного потенциала МСК костного мозга крыс было показано, что аноксия подавляла, по крайней мере, начальные этапы как спонтанной, так и направленной остеогенной дифференцировки клеток-предшественников. Тем не менее, следует отметить, что в культурах МСК при их экспозиции в аноксии определенная доля клеток, в которых выявлялась активность ЩФ, все же детектировалась, что, вероятно, говорит об отсутствии полной блокады внутриклеточных механизмов, ответственных за дифференцировку клеток-предшественников в остеобласты. Полагают, что одним из таких механизмов является экспрессия ключевого для процессов остеогенной дифференцировки транскрипционного фактора Runx2, ингибирование которого в случае аноксии, но не гипоксии было показано в одной из работ [Salim A. et al., 2004]. Учитывая, что более длительное культивирование МСК в условиях аноксии приводило к нарушению их жизнеспособности, дальнейшая дифференцировка этих клеток в остеогенном направлении становилась невозможной.

Анализ адипогенного дифференцировочного потенциала МСК костного мозга крыс показал, что на начальных этапах культивирования МСК в аноксии часть клеток вступала на путь дифференцировки в адипоциты: в цитоплазме дифференцирующихся клеток начинали накапливаться липидные капли, клетки приобретали более сферическую форму и формировали кластеры. Однако при дальнейшей экспозиции в условиях аноксии происходила гибель дифференцирующихся клеток. Видимо, в условиях аноксии основным лимитирующим дифференцировку фактором являлось нарушение клеточной жизнеспособности, а не блокирование процессов дифференцировки.

Таким образом, в условиях 96-часовой аноксии в культурах МСК костного мозга крыс не происходило изменения морфологии и иммунофенотипа клеток, ингибирования их пролиферации, значительного увеличения количества поврежденных клеток, а также сохранялась возможность начальных этапов их остеогенной и адипогенной дифференцировки. Жизнеспособность клеток-предшественников при аноксии определялась временем их пребывания в этих условиях, а основным повреждающим механизмом МСК на начальных этапах аноксии являлся апоптоз, а при более длительном воздействии – некроз.

Суммируя полученные данные, следует повторить, что 96-часовая экспозиция гетерогенной на начальных этапах культивирования популяции мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в условиях снижения концентрации кислорода in vitro до 5%, то есть до значений, не являющихся гипоксическими in vivo, приводило к стимулирующему эффекту, заключающемуся в модуляции ряда морфофункциональных характеристик клеток-предшественников. Этого эффекта не наблюдалось при выраженном понижении содержания кислорода в среде, которое, тем не менее, не приводило и к значительному повреждению клеток, наблюдаемому в случае более длительной экспозиции, что расширяет представления об устойчивости клеток-предшественников взрослого организма, в частности, к недостатку кислорода в среде.

ВЫВОДЫ

  1. Мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс на начальных этапах культивирования характеризуются высокой степенью гетерогенности, которая выражается в наличии в культуре нескольких типов клеток с различными морфофункциональными характеристиками. При длительном культивировании происходит снижение гетерогенности культур клеток-предшественников и стабилизация их пролиферативной активности, что, по-видимому, объясняется субселекцией клеточной популяции, адаптированной к условиям культивирования, в том числе, к высокому, по сравнению с условиями in vivo, содержанию кислорода в среде.
  2. 96-часовое воздействие гипоксии (5% О2) оказывает стимулирующее влияние на мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс на начальных этапах культивирования (1 – 4 пассажи), что выражается в снижении степени гетерогенности культур клеток, cтимуляции их пролиферации, цитопротективном действии, сохранении характерного для клеток-предшественников фенотипа.
  3. Культивирование мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в течение 96 часов в условиях гипоксии (5% О2) приводит к снижению в культуре доли клеток, в которых гистохимически выявляется спонтанная и индуцированная активность щелочной фосфатазы, что может свидетельствовать о подавлении начальных этапов спонтанной и индуцированной остеогенной дифференцировки клеток-предшественников.
  4. Культивирование мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в течение 96 часов в условиях гипоксии (5% О2) не оказывает существенного влияния на их адипогенную дифференцировку.
  5. Эффекты гипоксии на морфологию, пролиферацию и жизнеспособность длительно культивируемых (более 20 пассажей) мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс варьируют, однако в любом случае гипоксия не приводит к стимуляции их пролиферативной активности и изменению характерного для клеток-предшественников иммунофенотипа.
  6. 96-часовое воздействие аноксии на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс не приводит к изменению их морфологии и иммунофенотипа, к ингибированию их пролиферативной активности, к значительному увеличению доли поврежденных клеток, а также не отменяет начальных этапов дифференцировки клеток-предшественников.
  7. Снижение жизнеспособности культивируемых мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в условиях аноксии определяется продолжительностью аноксического воздействия. На начальных этапах воздействия аноксия активирует в клетках-предшественниках процессы апоптоза, а основным повреждающим механизмом при дальнейшем их пребывании в условиях аноксии является некроз.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Методические аспекты получения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга крысы и высокая гетерогенность их популяции // Сборник материалов IV конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященной Дню космонавтики. – 2005. – С. 5.
  2. Влияние гипоксии на пролиферативную активность мезенхимальных стволовых клеток крыс // Сборник материалов 4-й Всероссийской конференции с международным участием “Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция”. – 2005. – С. 17 – 18 (Соавтор: Буравкова Л.Б.)
  3. Гетерогенность и фенотипическая характеристика мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга крыс // Сборник материалов VI Международной конференции “Молекулярная генетика соматических клеток”. – 2005. – C. 86. (Соавторы: Буравкова Л.Б., Григорьева О.В.)
  4. Влияние гипоксии на гетерогенность, жизнеспособность и пролиферативную активность стромальных клеток-предшественников из костного мозга крыс // Сборник материалов V конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященной Дню космонавтики. – 2006. – С. 5.
  5. The effect of hypoxia on rat bone marrow stroma-derived progenitor cells // Abstracts of the 2-nd International Conference “Strategies in tissue engineering”, Cytotherapy. – 2006. – Vol. 8. – N. 2. – P. 37. (Coauthor: Buravkova L.B.)
  6. Susceptibility of rat bone marrow stroma-derived progenitor cells to hypoxia // Abstracts of the VIII World Congress of International Society for Adaptive medicine (ISAM). – 2006. – P. 90. (Coauthor: Buravkova L.B.)
  7. Пролиферация, жизнеспособность и фенотип культивируемых мезенхимальных клеток-предшественников при гипоксии // Сборник метериалов Всероссийского симпозиума “Биология клетки в культуре”, Цитология. – 2006. – T. 48. – № 9. – C. 748 (Соавторы: Буравкова Л.Б., Жамбалова А.П., Гринаковская О.С.)
  8. Влияние гипоксии на длительно культивируемые стромальные клетки-предшественники, выделенные из костного мозга крыс // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2006. – Т. 4. – C. 26 – 28. (Соавторы: Буравкова Л.Б., Воложин А.И., Григорьева О.В.)
  9. Влияние гипоксии на стромальные клетки-предшественники из костного мозга крыс на ранних этапах культивирования // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – T.143. – № 4. – C. 386 – 389. (Соавтор: Буравкова Л.Б.)
  10. Гетерогенность стромальных клеток-предшественников, выделенных из костного мозга крыс // Цитология. – 2007. – T. 49. – №1. – C.
    Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»