WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Таким образом, полученные культуры МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования характеризовались экспрессией свойственных для клеток-предшественников поверхностных антигенов; возможностью реализации свойственных для МСК костного мозга дифференцировочных потенций; морфологической гетерогенностью, выражающейся в существовании в культуре различных типов клеток; высокой пролиферативной активностью и последующим ее спадом, происходившем, в среднем, к четвертому пассажу и сопровождающимся доминированием в культурах крупных распластанных медленно пролиферирующих клеток. При дальнейшем субкультивировании МСК костного мозга крыс, наряду с сохранением характерного для клеток-предшественников иммунофенотипа, их пролиферативная активность восстанавливалась, увеличивалась и стабилизировалась, что сопровождалось снижением степени гетерогенности культур МСК и формированием гомогенной клеточной популяции с определенными морфологическими характеристиками. Это, вероятно, объясняется субселекцией обладающей индивидуальными (в том числе, вероятно, в отношении сохранения дифференцировочного потенциала) морфофункциональными характеристиками популяции клеток, устойчивой к условиям культивирования, в том числе высокому, по сравнению с условиями in vivo, содержанию кислорода в среде.

Влияние гипоксии на мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс. При оценке морфологических характеристик МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования при их экспозиции в нормо- и гипоксии было обнаружено, что в условиях 5% О2 в культурах МСК снижалось количество варьирующих по размеру и разнородных по морфологическим особенностям крупных, распластанных, медленно делящихся клеток. В культивируемых в гипоксических условиях популяциях МСК увеличивалась доля формирующих островки однотипных клеток небольшого размера с однородной по оптической плотности цитоплазмой. Таким образом, гипоксия снижала степень гетерогенности культур МСК (Рис.2).

а.

б.

Рис.2 Морфологическая гетерогенность МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования в нормоксии и гипоксии. Представлены двухпараметрические гистограммы распределения клеток по размеру (ось ординат) и гранулярности (ось абсцисс) для клеток 4 пассажа, а также микрофотографии (х200) для клеток 2 пассажа после инкубации в течение 96 часов в нормоксии (а) и гипоксии (б).

В ряде исследований крупные распластанные клетки рассматривались как зрелые МСК, которые теряют часть своего дифференцировочного потенциала [Prockop D.J. et al., 2001; Sekiya I. et al., 2002]. С другой стороны, снижение доли крупных распластанных медленно делящихся клеток в условиях пониженного содержания кислорода позволяет предположить, что именно концентрация кислорода является фактором, регулирующим количество таких клеток в популяции МСК. Допуская, что особенности морфологии и подавление пролиферативной активности in vitro клеток третьего типа отражают степень их повреждения в условиях повышенного, по сравнению со средой in vivo, содержания кислорода, можно предположить, что приближение газового состава среды культивирования к таковому in vivo обеспечивает снижение степени окислительного стресса и уменьшение количества поврежденных таким образом клеток.

В случае длительно культивируемых МСК после гипоксического воздействия в течение четырех суток в К1 (линии, потерявшей способность к остеогенной дифференцировке) наблюдалось преобладание клеток, образующих длинные тонкие отростки. В случае К2 и К3 (линий, сохраняющих способность к остеогенной дифференцировке) модифицирующего влияния гипоксии на морфологические характеристики клеток отмечено не было.

При оценке пролиферативной активности МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования при их экспозиции в нормо- и гипоксии в течение 96 часов было показано, что пониженное содержание кислорода стимулирует пролиферацию клеток (Рис.3). Усиление пролиферативной активности МСК в условиях пониженного содержания кислорода наблюдалось в каждом эксперименте как в случае первичных культур, так и в субкультурах в течение первых четырех исследованных пассажей. В среднем, пролиферация клеток в условиях гипоксии была в 2,5 раза активнее по сравнению с нормоксией.

Рис.3 Пролиферация МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования в нормоксии и гипоксии (5% О2). Представлено среднее значение прироста количества клеток (в разах) в рандомически выбранных фиксированных полях зрения в разных культуральных флаконах для различных культур в зависимости от пассажа и стандартная ошибка среднего, суммарные данные 11 экспериментов, различия достоверны для р<0,01 по критерию Манна-Уитни для Р1, P2 и Р3 и по t-критерию для Р2.

Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, демонстрирующих возможность стимуляции пролиферации недифференцированных клеток в условиях пониженного содержания кислорода [Lennon D.P. et al., 2001; Ren H. et al., 2006; Bosch P. et al., 2006; Grayson W.L. et al., 2006].

Изменение пролиферативного ответа клеток в условиях гипоксии, очевидно, может быть связано с регуляторным влиянием активирующихся при гипоксии определенных сигнальных путей, а также транскрипционного фактора HIF-1 на механизмы, контролирующие клеточный цикл. Активация транскрипционного фактора HIF-1 является универсальным ответом клеток на гипоксию и была описана в различных типах клеток [Kaelin W.G., 2002; Semenza G.L., 2001, 2004; Wenger R.H., 2000, 2001, 2002; Bruick R.K., 2003]. С другой стороны, в ряде экспериментов было показано, что высокое содержание HIF-1 может коррелировать со сверхэкспрессией белков-маркеров пролиферации фаз S-G2 клеточного цикла, таких как циклин А и Ki-67, и с активацией клеточной пролиферации [Bos R. et al., 2004; Gardner L.B. et al., 2003]. Другой механизм активации пролиферации МСК при гипоксии может быть связан с индукцией SAP-киназных каскадов (JNK и р38), активируемых обычно в ответ на стрессовые факторы и приводящих к стимуляции пролиферативной активности клеток. Так, в ряде экспериментов доказывается участие этих сигнальных путей в активации клеточной пролиферации [Scott P.H. et al., 1998; Das M. et al., 2001]. С другой стороны, индукция стресс-активируемых протеинкиназ была продемонстрирована на многих клетках при помещении их в гипоксические условия [Tobiume K. et al., 2000; Alfranca A. et al., 2002]. Следует отметить, что факторы, обуславливающие степень стимуляции пролиферативной активности клеток-предшественников, остаются невыясненными. Возможно, что степень стимуляции МСК гипоксией может в какой-то мере определяться коммитированностью клеток в составе популяции МСК. В этой связи интересно, что, например, подвергавшиеся гипоксическому воздействию гематопоэтические стволовые клетки демонстрировали неодинаковый пролиферативный ответ в зависимости от степени дифференцированности [Gardner L.B. et al., 2003].

Стимуляция пролиферативной активности в условиях пониженного содержания кислорода не наблюдалась в случае длительно культивируемых МСК костного мозга крыс (Рис.4). Гипоксия подавляла пролиферацию клеток в К1 (линии, потерявшей способность к остеогенной дифференцировке) и не оказывала существенного влияния на пролиферативную активность клеток линий К2 и К3 (линии, сохраняющие способность к остеогенной дифференцировке).

Рис.4 Пролиферация длительно культивируемых МСК костного мозга крыс в нормоксии и гипоксии (5% О2). Представлено среднее значение прироста количества клеток (в разах) в рандомически выбранных фиксированных полях зрения в разных культуральных флаконах для культур К1, К2, К3 и стандартная ошибка среднего, суммарные данные 8 экспериментов, различия достоверны для р<0,01 по критерию Манна-Уитни для К1.

Оценка жизнеспособности МСК костного мозга крыс на 1 – 4 пассажах, культивируемых в нормо- и гипоксии в течение 96 часов показала, что для МСК в условиях пониженного содержания кислорода характерно снижение количества поврежденных клеток, главным образом, за счет подавления процессов апоптоза (Рис.5). В некоторых культурах суммарное число поврежденных клеток в условиях гипоксии было в 2,5 раза меньше по сравнению с нормоксией, а в среднем, этот показатель составил 1,5 раза.

Антиапоптотическое действие гипоксии на клетки согласуется с активацией в гипоксических условиях PI3-киназы [Alvarez-Tejado M. et al., 2002], что, в свою очередь, ведет к отмене ингибирования функций антиапоптотического белка Bcl-xL проапоптотическим белком Bad, а также к индукции транскрипционного фактора NF-B, который обеспечивает усиление активности ряда антиапоптотических белков (Bcl-2, Bcl-xL и IAP2), наряду с подавлением функции проапоптотического белка Bax, и индукция которого также может быть достигнута через другие сигнальные пути, активируемые при гипоксии [Greijer A.E. et al., 2004].

Рис.5 Жизнеспособность МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования после 96 часов экспозиции в нормоксии и гипоксии (5% О2). Представлено среднее количество апоптотических (AnnV+) и некротических (PI+) клеток, суммарный процент поврежденных клеток для различных культур на 1-4 пассажах, а также стандартная ошибка среднего, суммарные данные 5-6 экспериментов, в каждом из которых анализировали 5-10 тыс. клеток.

а.

б.

в.

Рис.6 Жизнеспособность длительно культивируемых МСК костного мозга крыс после 96 часов экспозиции в нормоксии и гипоксии (5% О2). Представлено среднее количество апоптотических (AnnV+), некротических (PI+) клеток, суммарный процент поврежденных клеток для культур К1 (а), К2 (б), К3 (в), а также стандартная ошибка среднего, суммарные данные 8 экспериментов, в каждом из которых анализировали 5-10 тыс. клеток.

Пониженное содержание кислорода оказывало различные эффекты на длительно культивируемые МСК: только в одной из культур – наименее подверженной влиянию гипоксии и наиболее длительно поддерживающей остеогенный дифференцировочный потенциал – наблюдалось протективное действие гипоксии на клетки, в то время как доля поврежденных клеток возрастала при воздействии гипоксии в двух других культурах (Рис.6).

Таким образом, эффекты снижения парциального давления кислорода на длительно культивируемые МСК отличались от таковых для клеток на ранних пассажах и зависели от полученной линии клеток. Такая вариабельность согласуется с представлениями о том, что при длительном культивировании клеток происходит субселекция популяции, устойчивой и приспособленной к повышенному, по сравнению с условиями in vivo, содержанию кислорода в среде, которое, на определенных этапах культивирования может действовать как фактор отбора. Случайность такой субселекции определяет индивидуальные особенности клеточной популяции, в том числе, в отношении ее чувствительности к гипоксии.

При исследовании влияния гипоксии на иммунофенотип МСК костного мозга крыс, было показано, что в условиях пониженного содержания кислорода, поддерживаемого в течение 96 часов, сохраняется экспрессия характерных для клеток-предшественников поверхностных маркеров (CD90+, CD45-, CD54+, CD44+, CD73+, CD106+, CD11b-, CD29+). Эта тенденция была характерна как для клеток на начальных этапах культивирования, так и для длительно культивируемых МСК.

При оценке влияния гипоксии на остеогенный дифференцировочный потенциал МСК костного мозга крыс было показано, что в условиях пониженного содержания кислорода число недифференцированных клеток было больше по сравнению с нормоксией как в среде без остеогенных стимулов, так и в среде, содержащей остеогенные дифференцировочные стимулы (Рис.7). Таким образом, гипоксия, вероятно, подавляла, по крайней мере, начальные этапы как спонтанной, так и направленной остеогенной дифференцировки клеток-предшественников.

При анализе адипогенного дифференцировочного потенциала МСК костного мозга крыс было отмечено, что дифференцирующиеся клетки обнаруживались только в случае инкубирования МСК в среде, содержащей адипогенные дифференцировочные стимулы как в нормоксии, так и в гипоксии. При этом количество формирующихся кластеров адипоцитов было одинаково в обоих случаях. Более того, количество формирующихся адипоцитов в пределах одного кластера также не зависело от содержания кислорода в среде (Рис.8). Таким образом, гипоксия не оказывала существенного влияния на адипогенную дифференцировку МСК костного мозга крыс.

Рис.7 Остеогенная дифференцировка МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования. Представлена средняя доля негативных по ЩФ клеток после 96 часов экспозиции МСК в нормоксии и гипоксии (5% О2) и стандартная ошибка среднего. СД, ИД – спонтанная и индуцированная дифференцировка. Данные репрезентативного эксперимента для клеток третьего пассажа.

Рис.8 Адипогенная дифференцировка МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования. Представлено среднее количество адипоцитов в кластере после 14 суток инкубирования с адипогенными стимулами в нормоксии и гипоксии (5% О2) и стандартная ошибка среднего. Данные репрезентативного эксперимента для клеток первого пассажа.

Таким образом, 96-часовое воздействие гипоксии (5% О2) оказывало стимулирующее влияние на мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс на начальных этапах культивирования, что выражалось в снижении степени гетерогенности культур МСК, стимуляции их пролиферации, цитопротективном действии, сохранении характерного для МСК фенотипа, а также торможении, по крайней мере, начальных этапов процессов дифференцировки в остеогенном направлении, что может рассматриваться как сохранение их менее коммитированного состояния.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»