WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Характеристика МСК. Оценку морфологических характеристик МСК проводили с помощью программы Sigma ScanPro 5 при анализе микрофотографий случайно выбранных полей зрения, полученных с использованием светового фазово-контрастного микроскопа (Axiovert 25, Zeiss, Германия) и сопряженной с ним видеокамеры.

Так же осуществляли подсчет клеток в поле зрения для определения прироста их количества в случайно выбранных фиксированных полях зрения, количества удвоений за определенное время, а также времени удвоения популяции как показателей пролиферативной активности клеток.

Жизнеспособность МСК оценивали по количеству апоптотических и некротических клеток методом проточной цитофлуориметрии (проточный цитофлуориметр Beckman Coulter, США) с помощью набора ANNEXIN V-FITC Kit (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя. Апоптотические клетки определялись за счет высокоаффинного связывания аннексина V, меченого FITC, с фосфолипидом фосфатидилсерином, который в норме находится во внутреннем слое фосфолипидного бислоя мембран клеток, а при апоптозе, когда клетка теряет способность поддерживать ассиметричность локализации мембранных фосфолипидов, перемещается во внешний монослой. Некротические клетки определялись за счет происходящего при повреждении целостности клеточных мембран связывания пропидия йодида с ДНК.

Иммунофенотип МСК оценивали по экспрессии ряда поверхностных маркеров с помощью моноклональных антител (BD Biosciences, США), меченых FITC (CD45, CD44, CD11b, CD29) и PE (CD90, CD54, CD106, CD73, CD62L, CD31), методом проточной цитофлуориметрии. В качестве контроля использовали пробы с добавлением неиммунных меченых FITC и PE моноклональных антител (BD Biosciences, США) того же изотипа, что и антитела против исследуемого маркера.

При оценке дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс исследовали их способность к остеогенной и адипогенной дифференцировке в ответ на определенные дифференцировочные стимулы (индуцированная дифференцировка) или без них (спонтанная дифференцировка). Для индукции дифференцировки клеток-предшественников их культивировали в среде с добавлением остеогенных (10-8 М дексаметазона, 10 мМ глицерол-2-фосфата (Sigma, США) и 0,2 мМ 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты (Fluka, Германия)) и адипогенных (0,5 мМ изобутилметилксантина, 1 М дексаметазона (Sigma, США), 10 г/мл инсулина (NovoNordisk, Дания)) дифференцировочных стимулов.

Начальные этапы остеогенной дифференцировки МСК анализировали с помощью набора Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США), оценивая гистохимическое выявление в клетках активности щелочной фосфатазы – раннего, но характерного маркера деятельности остеобластов. Клетки, в которых определялась активность этого фермента, рассматривали как вступившие на путь остеогенной дифференцировки (спонтанной или индуцированной). Поздние этапы остеогенной дифференцировки МСК оценивали по окрашиванию минерализованных компонентов матрикса красителем ализариновым красным (Sigma, США) c добавлением гидроксида аммония (ПО “Азот”, Россия) или нитратом серебра (Sigma, США) по методу Коса (Пирс Э., 1963).

Адипогенный дифференцировочный потенциал оценивали по появлению в культуре клеток, накапливающих в цитоплазме липидные капли, выявляемые с помощью красителя Oil Red (Sigma, США).

Статистическая обработка результатов. В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего, объем выборки. Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (для малых и средних выборок, n30) или критерия Стьюдента (для больших выборок, n>30) при выбранном уровне значимости p=0,01. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ “Excel” и “Statistica 7.0” для WinXP.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс. МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования характеризовались высокой степенью гетерогенности, которая выражалась в существовании в культуре разных клеточных типов, отличающихся по морфологии и скорости пролиферации. Используя в качестве критериев для классификации особенности организации цитоплазмы клеток, а также их форму и размер, в культурах МСК костного мозга крыс возможно было выделить три основных клеточных типа. Клетки первого типа обладали однородной по оптической плотности цитоплазмой, имели веретеновидную, треугольную или звездчатую форму, и небольшой размер. Клетки второго типа характеризовались неоднородной по оптической плотности цитоплазмой и различались по размеру и форме. Клетки третьего типа характеризовались негомогенной цитоплазмой с хорошо заметной исчерченностью, они имели полигональную, округлую или неправильную форму без отростков или с большим количеством отростков, часто располагающихся на противоположных полюсах клетки, а их размеры варьировали в очень широких пределах. МСК первого и второго типов активно пролиферировали, в то время как клетки третьего типа отличались сниженной пролиферативной активностью.

Длительные культуры МСК (К1, К2, К3) были получены от трех животных в ходе субкультивирования клеток в течение более чем 30 пассажей и, фактически, представляли собой отдельные клеточные линии со стабильными морфологическими и иммунофенотипическими характеристиками. Следует отметить, что каждая из полученных длительных культур стромальных клеток-предшественников после длительного культивирования состояла, в отличие от культур МСК на ранних пассажах, из морфологически однотипных клеток, однако сами культуры отличались друг от друга по доминирующему клеточному типу.

Несмотря на нормированные условия культивирования (состав среды культивирования, количество сыворотки в среде, используемый культуральный пластик, начальная плотность посадки), получаемые клеточные популяции различались по пролиферативной активности. Однако общей тенденцией было поддержание более высокой скорости пролиферации клеток в течение первых пассажей и ее значительное снижение, в среднем, к 4 пассажу. Среднее для различных культур число удвоений популяции за 96 часов культивирования составляло 1,9 для первого пассажа, 1,7 – для второго, 1,3 – для третьего и 0,7 для четвертого, а среднее время удвоения популяции насчитывало 64 и 66 часа на первом и втором пассажах, увеличиваясь до 150 часов уже на третьем пассаже. Следует отметить, что на ранних этапах культивирования преобладали клетки первого и второго типов, в то время как доля клеток третьего типа не была превалирующей, а спад пролиферативной активности сопровождался доминированием в культурах медленно делящихся распластанных клеток третьего типа. При дальнейшем субкультивировании это, так называемое, “пролиферативное торможение” сменялось подъемом пролиферативной активности, сопровождающимся появлением и последующим доминированием в культурах однородных по морфологии клеток. Пролиферативная активность МСК при дальнейшем культивировании не только стабилизировалась, но и увеличивалась по сравнению с первичными культурами и культурами на ранних пассажах. Этот факт, вероятно, мог быть обусловлен, с одной стороны, большей гомогенностью культур, а с другой стороны, адаптацией клеток к условиям культивирования. Время удвоения популяций во всех трех длительно поддерживаемых культурах возрастало по сравнению со временем удвоения популяций, характерным для первичных культур и культур на ранних пассажах, было стабильным и составляло, в среднем, 21 час.

Для исследуемых клеток была характерна экспрессия участвующих в процессах адгезии, миграции, рециркуляции, организации внеклеточного матрикса поверхностных молекул, выявляемых на мезенхимальных стромальных клетках-предшественниках и указывающих на их функциональную вовлеченность в межклеточные взаимодействия и взаимодействия с внеклеточным матриксом. Так, на начальных этапах культивирования от 98,0 до 99,9 % клеток в различных культурах экспрессировали маркер CD90 (Thy-1). Такая же высокая степень экспрессии была характерна и для поверхностного антигена CD29 – 1 интегриновой цепи. Для 92,3 – 99,5 % клеток и для 96,9 – 99,7 % клеток была характерна экспрессия маркеров CD54 (рецептор 2 интегринов) и CD44 (рецептор гиалуроновой кислоты и других лигандов, играющих важную роль в организации внеклеточного матрикса) соответственно. Маркер CD73 (мембраносвязанная экто-5’-нуклеотидаза) экспрессировали от 61,9 до 94,6 % клеток. Количество клеток, положительных по маркеру CD106 (рецептор 1 интегринов) варьировало в широких пределах и составляло от 3,3 до 47,1 %. В полученных популяциях МСК костного мозга крыс незначительная доля клеток на ранних пассажах несла на своей поверхности общий лейкоцитарный антиген CD45 и характерный для моноцитов и макрофагов маркер CD11b, экспрессия которых не определялась при дальнейшем культивировании. Описанный иммунофенотип сохранялся и в случае длительного культивирования МСК в течение достаточно долгого времени после преодоления пролиферативного торможения. Изменения в экспрессии некоторых маркеров в двух из трех длительно поддерживаемых культурах МСК наблюдались только после более чем 200 удвоений популяций.

При оценке дифференцировочного потенциала клеток-предшественников было показано, что во всех культурах МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования количество клеток, в которых определялась активность ЩФ, увеличивалось в ответ на остеогенные стимулы по сравнению с контролем, где доля положительных на ЩФ клеток также выявлялась, но была ниже (Рис.1а,б). Следует отметить, что доля положительных на ЩФ клеток в культурах МСК без воздействия остеогенных стимулов возрастала с увеличением времени культивирования клеток на протяжении одного пассажа, то есть при увеличении количества клеток за счет деления, а значит, увеличения их плотности и числа контактов между ними. Таким образом, вероятно, в культурах МСК имела место спонтанная инициация дифференцировки в остеогенном направлении или, по крайней мере, ее начальных этапов. Интересно, что клетки, в которых выявлялась спонтанная или индуцированная активность ЩФ, в культурах МСК были морфологически гетерогенны. Однако, четкой корреляции между морфологическим типом клеток и степенью окрашивания на щелочную фосфатазу отмечено не было.

а.

в.

д.

б.

г.

е.

Рис.1 Дифференцировочные потенции МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования. Представлено гистохимическое выявление активности щелочной фосфатазы в клетках 3 пассажа, х100 (а,б), окрашивание минерализованных компонентов матрикса клеток 6 пассажа, х100 (в,г) и приобретение адипоцитарного фенотипа клетками 1 пассажа, х400 (д,е) в отсутствие (спонтанная дифференцировка) (а,в,д) и при воздействии (индуцированная дифференцировка) (б,г,е) дифференцировочных стимулов.

Для МСК на начальных этапах культивирования была показана способность к минерализации матрикса в ответ на остеогенные стимулы, что, в отличие от активности щелочной фосфатазы, не было отмечено в случае отсутствия остеогенных стимулов (Рис.1в,г). При этом минерализация матрикса МСК происходила не ранее чем через три недели культивирования клеток в среде с остеогенными стимулами.

В отличие от остеогенного направления дифференцировки, для МСК костного мозга крыс был не характерен спонтанный адипогенез. В ходе индуцированной адиподифференцировки клетки-предшественники приобретали характерную для адипоцитов форму, располагались в виде отдельных кластеров и накапливали в цитоплазме жировые включения, которые сначала имели небольшой размер, а затем сливались, формируя большие липидные капли (Рис.1д,е). Интересно, что способность к адипогенезу была наилучшей у клеток первого пассажа. Вероятно, адипогенный потенциал МСК снижается при культивировании. Напротив, при длительном культивировании две из трех исследуемых культур сохраняли способность к увеличению активности щелочной фосфатазы в среде с остеогенными стимулами, после 200 удвоений популяций. Этот факт согласуется с представлениями о том, что длительно поддерживаемые культуры МСК долго сохраняют способность к остеогенной дифференцировке, однако перестают дифференцироваться в адипоциты, что может говорить о потере мультипотентности при старении культур [Digirolamo C.M. et al., 1999; Muraglia A. et al., 2000]. С другой стороны, согласно ряду исследований, прогениторные клетки взрослого организма способны давать более чем 80 удвоений популяции в случае МСК человека и более чем 120 удвоений популяции в случае культур МСК грызунов, без признаков изменения фенотипа, изменения длины теломер, потери дифференцировочного потенциала и других признаков старения [Jiang Y. et al., 2002; Reyes M. et al., 2001], а число удвоений популяции стволовых клеток из мышечной ткани мышей может достигать 200 без появления каких-либо признаков старения клеток и потери функциональной состоятельности [Deasy B.M. et al., 2005].

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»