WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

АНОХИНА ЕКАТЕРИНА БОРИСОВНА

ВЛИЯНИЕ ПОНИЖЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ КИСЛОРОДА НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ-ПРЕДШЕСТВЕННИКИ КОСТНОГО МОЗГА КРЫС

03.00.13 - физиология

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва

2007

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации –

Институте медико-биологических проблем Российской академии наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор Воложин Александр Ильич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Капланский Александр Самуилович

доктор биологических наук, Романов Юрий Аскольдович

Ведущая организация:

Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «5» октября 2007 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета K 002.111.01 в Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ – ИМБП РАН) по адресу:123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ – ИМБП РАН

Автореферат разослан «31» августа 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук И.П. Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК), или мезенхимальные стромальные клетки-предшественники являются стволовыми клетками взрослого организма, которые локализуются в костном мозге, жировой ткани, а также в ряде других тканей и органов. Эти клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом, являются самообновляющейся популяцией клеток, поддерживающих свое недифференцированное состояние, а также способны к дифференцировке в определенные типы клеток под действием дифференцировочных стимулов [Fridenstein A.J. et al., 1976; Caplan A.I., 1994; Prockop D.J., 1997, 2003; Bruder S.P. et al., 1997; Pittenger M.F. et al., 1999; Bianco P. et al., 2001; Barry F.P. et al., 2004; Fibbe W.E., 2002; Grove J.E. et al., 2004; Wagner W. et al., 2005]. В свою очередь, мультипотентность МСК определяет выполняемую ими уникальную функцию формирования, поддержания и репарации тканей, а также лежит в основе современных технологий тканевой инженерии. В связи с этим, со времен открытия этих клеток А.Я. Фриденштейном интерес к ним непрерывно растет, однако все большее число работ ставит новые вопросы в отношении функционирования МСК in vivo и in vitro.

Одним из таких вопросов является функциональное состояние клеток-предшественников в условиях пониженного содержания кислорода. Парциальное давление кислорода во внеклеточной среде, обуславливающее концентрацию внутриклеточного кислорода, является одним из существенных факторов, определяющих жизнедеятельность любой клетки, в том числе, стволовой. Поддержание этого параметра в узких пределах является важнейшим компонентом гомеостаза и необходимо для предупреждения в клетке повреждений различного характера. Наиболее частым нарушением постоянства газового состава среды является снижение парциального давления кислорода во внеклеточной среде, или гипоксия. МСК могут оказываться в условиях пониженного содержания кислорода, обусловленного экзогенными факторами, рядом патофизиологических механизмов, а также ограниченным кровоснабжением имплантированных систем доставки клеток-предшественников (носителей) в место повреждения при применении современных репаративных технологий. Пониженное содержание кислорода может оказывать модифицирующее влияние на характеристики мезенхимальных стромальных клеток-предшественников, отражающие их морфофункциональное состояние, такие как их жизнеспособность, способность к пролиферации, дифференцировочный потенциал, а также морфологические и иммунофенотипические показатели, что, в свою очередь, может влиять на протекание репаративных процессов в ткани. В противовес долгой истории изучения гипоксии на организменном уровне, гипоксическое воздействие на культивируемые клетки исследовано значительно меньше. В частности, работы, посвященные воздействию пониженного содержания кислорода на культивируемые МСК, немногочисленны, затрагивают какие-либо отдельные характеристики клеток-предшественников, а их результаты зачастую противоречивы [Lennon D.P. et al., 2001; Salim A. et al., 2004; Ren H. et al., 2006; Pacary E. et al., 2006; Malladi P. et al., 2006; Lin Q. et al., 2006]. Таким образом, дальнейшее комплексное исследование функционального состояния мезенхимальных стромальных клеток-предшественников в условиях пониженного содержания кислорода является актуальной задачей клеточной биологии.

Цель исследования: изучение влияния пониженного содержания кислорода на морфо-функциональное состояние мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс на разных этапах культивирования.

Задачи исследования:

  1. Отработка метода получения и культивирования мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в условиях пониженного содержания кислорода.
  2. Морфологическая, иммунофенотипическая и функциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс на различных этапах культивирования.
  3. Исследование влияния пониженного содержания кислорода в среде культивирования (5% О2) на морфологию, пролиферативную активность, жизнеспособность, иммунофенотип и остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал мезенхимальных стромальных клеток предшественников костного мозга крыс на начальных этапах культивирования.
  4. Изучение влияния пониженного содержания кислорода в среде культивирования (5% О2) на морфологию, пролиферативную активность, жизнеспособность, иммунофенотип длительно культивируемых мезенхимальных стромальных клеток предшественников костного мозга крыс.
  5. Оценка влияния пониженного содержания кислорода в среде культивирования (0% О2) на морфологию, пролиферативную активность, жизнеспособность, иммунофенотип и остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал мезенхимальных стромальных клеток предшественников костного мозга крыс на начальных этапах культивирования.

Научная новизна. Проанализировано влияние пониженного содержания кислорода (5% O2) на комплекс характеристик МСК костного мозга крыс, которые в своей совокупности отражают морфофункциональное состояние клеток-предшественников. Показано, что на начальных этапах культивирования (1 – 4 пассажи) МСК костного мозга крыс гипоксия снижает степень их морфологической гетерогенности, стимулирует пролиферацию, оказывает цитопротекторный эффект, а также модулирует ранние этапы их остеогенной, но не адипогенной дифференцировки при сохранении характерного для МСК иммунофенотипа.

Впервые при длительном культивировании (более 20 пассажей) мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс выявлена субселекция морфологически гомогенных линий клеток со стабильным иммунофенотипом, пролиферативной активностью и различным остеогенным дифференцировочным потенциалом, и оценено влияние гипоксии (5% О2) на полученные культуры МСК. Показано, что эффекты гипоксии на морфологию, пролиферацию и жизнеспособность длительно культивируемых клеток-предшественников варьируют, однако в любом случае гипоксия не приводит к стимуляции их пролиферативной активности и изменению характерного для МСК иммунофенотипа.

Впервые при исследовании влияния аноксии на комплекс характеристик мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс выявлены временные пределы их устойчивости к аноксическому воздействию, а также механизмы повреждения клеток в условиях аноксии. Показано, что в условиях 96-часовой аноксии в культурах МСК костного мозга крыс сохраняется морфология и иммунофенотип клеток, их способность к пролиферации, а также возможность начальных этапов остеогенной и адипогенной дифференцировки. При этом в культурах не происходит значительного увеличения количества поврежденных клеток, а имеющее место повреждение обусловлено апоптозом, в то время как при более длительном аноксическом воздействии основным повреждающим механизмом становится некроз.

Научно-практическая значимость работы. Показано стимулирующее влияние гипоксии на пролиферацию и жизнеспособность мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс, что может быть использовано для наращивания массы клеток-предшественников, сохраняющих свои морфофункциональные свойства при использовании технологий тканевой инженерии. Подана и зарегистрирована заявка на патент № 2007119977 от 30.05.2007.

Полученные данные о сохранении ряда морфофункциональных характеристик мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в условиях 96-часовой аноксии расширяют представления об устойчивости клеток-предшественников, в частности, к значительному снижению концентрации кислорода в среде.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. 96-часовое воздействие гипоксии (5% О2) оказывает стимулирующее влияние на мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс на начальных этапах культивирования (1 – 4 пассажи), что выражается в снижении степени гетерогенности культур МСК, стимуляции их пролиферации, цитопротективном действии, сохранении характерного для МСК фенотипа, а также торможении начальных этапов дифференцировки в остеогенном направлении, что может рассматриваться как сохранение их менее коммитированного состояния
  2. Мезенхимальные стромальные клетки-предшественники из костного мозга крыс представляют собой клеточную популяцию, чрезвычайно устойчивую к значительному понижению содержания кислорода в среде, что подтверждается сохранением их морфологии, фенотипа, жизнеспособности, способности к пролиферации, а также возможностью дифференцировки, хотя и менее эффективной, в условиях аноксии, поддерживаемой в течение нескольких суток.

Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на IV, V и VI конференциях молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2005, 2006, 2007); 4-й Всероссийской конференции с международным участием “Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция” (Москва, 2005); VI Международной конференции “Молекулярная генетика соматических клеток” (Звенигород, 2005); 2-й Международной конференции “Стратегии в тканевой инженерии ” (Вюрцбург, Германия, 2006); 8-м Международном конгрессе Международного общества по адаптивной медицине (Москва, 2006); Всероссийском симпозиуме “Биология клетки в культуре” (Санкт-Петербург, 2006).

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 работы в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН “Космическая физиология и биология” 21.06.2007 г. Работа выполнена при поддержке программы ОБН РАН “Физиологические механизмы регуляции внутренней среды и организации поведения живых систем” и контракта в рамках программы ФЦНТП (2002 – 2006 гг.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, заключения, списка литературы. Текст диссертации изложен на 161 странице машинописного текста, сопровождается 27 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 224 источника, из них 40 на русском и 184 на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования являлись культуры мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс. Культуры, используемые для оценки различных морфофункциональных характеристик МСК в нормоксии и в условиях пониженного содержания кислорода были получены от 20 животных и поддерживались в течение 4 – 130 пассажей.

Получение и культивирование МСК. Стромальные клетки-предшественники получали из бедренных и больших берцовых костей молодых беспородных крыс и крыс линии Wistar путем стерильной промывки диафизов культуральной средой, дезагрегации полученной костномозговой суспензии и адгезии клеток к культуральному пластику с последующим удалением фракции неадгезивных клеток [Javazon E. H. et al., 2001]. В качестве полной среды использовали среду -MEM (ICN, США) с добавлением 2 мМ глутамина (Gibco или Sigma, США), 1мМ пирувата натрия (Gibco, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 г/мл стрептомицина в солевом буфере (Gibco, США), эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco или Hyclone, США) и, при необходимости, 10 мМ HEPES буфера (Gibco, США) или среду -MEM (Биолот, Россия) с добавлением раствора антибиотиков и сыворотки. При достижении 80 – 90% монослоя в островках клеток первичной культуры или последующих субкультурах МСК проводили их пассирование. При этом использовали 20 мМ фосфатный буфер (Gibco, США) и раствор 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА (Gibco, США). Плотность посадки клеток составляла 500 – 1500 клеток/см2. Среду во флаконах с культивируемыми клетками меняли каждые 3 – 4 дня. Культивирование в стандартных условиях проводили при 37оС в атмосфере 5% СО2 с использованием СО2 инкубатора (Sanyo,Япония).

Для создания пониженного содержания кислорода в среде культивирования использовали мультигазовый инкубатор (Sanyo,Япония) или герметичную камеру (Stem Cell Technologies, Канада), которую, после установки в нее культуральных флаконов или чашек Петри (Nunc, Дания) с культивируемыми МСК, продували газовой смесью (95% N2, 5% СО2) до установления концентрации кислорода в среде 5% (гипоксия) или 0% (аноксия) и помещали в термостат. Содержание кислорода и давление в газовой среде контролировали с помощью встроенных в камеру датчиков, полагая, что выравнивание концентраций кислорода в газовой и жидкой фазе происходит к трем часам инкубации [Allen C.B. et al., 2001].

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»