WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Инкубирование клеток Лейдига in vitro. Мышей забивали путем декапитации, извлеченные семенники декапсулировали и помещали в среду Игла, насыщенную карбогеном (95%О2+5%СО2) и содержащую 0.1% БСА. Семенники диспергировали, т.е. последовательно пропускали через набор наконечников для автоматического дозатора объемом 5 см3, выпускные отверстия которых имели постепенно уменьшающиеся диаметры. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр с величиной отверстий около 90 мкм, клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, клетки ресуспендировали в 1 мл среды Игла. Данная методика позволяет получить суспензию, содержащую 4050% клеток Лейдига, выживаемость составляет около 90%. Количество клеток Лейдига подсчитывали в камере Горяева с помощью микроскопа с фазово-контрастным объективом (увеличение 400). Их идентифицировали по специфическому ярко-желтому свечению в среде Игла, содержащей феноловый красный (10 г/л). Полученную суспензию клеток разводили средой Игла до рабочей концентрации таким образом, чтобы в 1 мл ее содержалось: 105 клеток Лейдига для 60- и 100-суточных животных; 0.75ґ105 клеток для 35-суточных и 0.25ґ105 клеток для 20-суточных животных. Суспензию клеток в объеме 100 мкл, содержащую соответственно возрасту 10000, 7500 и 2500 клеток Лейдига, инкубировали со 100 мкл препарата. Для определения контрольной продукции клетки инкубировали со 100 мкл среды без стимуляторов. Продукцию тестостерона пересчитывали в нг на 105 клеток Лейдига за 3 часа для всех возрастов.

Количество тестостерона в инкубационной среде определяли радиоиммунологическим методом при помощи [1, 2, 6, 7 3H]-тестостерона ("Amersham", Санкт-Петербург) и высоко специфической антисыворотки, полученной из Института физиологии РАН им. И.П. Павлова (г. Санкт-Петербург). В эксперименте определено содержание тестостерона в 2804 пробах.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку материала проводили на основе одно- и двухфакторного дисперсионного анализа, корреляционного анализа и регрессионного анализа с использованием пакета компьютерных программ STATISTICA (версия 5.0). Различия между выборочными средними оценивались с использованием методов множественных сравнений Newman-Kauls или планируемых сравнений, главным образом, при двухфакторном дисперсионном анализе. Использование сравнений в рамках однофакторного анализа дополнительно отмечали. Дальнейшую статистическую обработку материала проводили на основе методов многомерной статистики (метод главных компонент) с использованием пакета компьютерных программ STATISTICA (версия 5.0) и дисперсионного анализа по Райту, запрограммированного в пакете электронных таблиц EXCEL.

Дисперсионный диаллельный анализ. Метод позволяет разложить генотипическую вариансу на вариансу общей комбинационной способности, которая определяется в основном аддитивным действием генов, вариансу специфической комбинационной способности, зависящей от генов с доминантными и эпистатическими эффектами, и на вариансу реципрокных эффектов.

Для каждой из родительских линий (хii) среднее определяется просто ее отклонением (vi) от среднего родительского уровня (mv): xii=mv+2vi+eii. Для гибридов 1-го поколения, т.е. для внедиагональных элементов диаллельной матрицы, среднее определяется более сложным образом по уравнению xij=mv+h+gi+gj+sij+ri+rj+rij+eij и зависит от следующих параметров:

1) от эффекта среднего гетерозиса или среднего доминирования (h), который определяется как разность между средним по всем гибридным комбинациям F1 и средним родительским уровнем;

2) от эффектов общей комбинационной способности i-ой линии (gi), равных среднему проявлению признака в тех гибридных комбинациях, где присутствует данный генотип;

3) от специфической комбинационной способности (sij), равной отклонениям в реципрокных суммах, не описываемых эффектами общей комбинационной способности;

4) от реципрокных эффектов. Последние разлагаются на два эффекта: средний реципрокный эффект i-ой линии (ri), равный разности между средним проявлением признака в гибридных комбинациях, в которых данная линия используется как отцовская и материнская, и остаточный реципрокный эффект (rij), который равен отклонениям, не учтенным в средних реципрокных эффектах.

Случайные отклонения eij=1/nijeijk (где i,j=1,…,p; k=1,…,nij) независимы и нормально распределены. При этом налагаются следующие ограничения: gi=0, sij=0, rij=0, sij=sji, rij=-rji.

Вышеуказанные эффекты рассчитывали для каждого кросса.

Результаты исследований

Результаты дисперсионного анализа как контрольной, так и стимулированной ХГ, цАМФ и прегненолоном продукции тестостерона клетками Лейдига показали, что она существенно изменялась с возрастом и зависела от генотипа (Табл. 2, Рис. 1). Наибольшую среднюю контрольную продукцию тестостерона имели кроссы (C х PT)F1 и (C х CBA)F1, а наименьшую (CBA х A)F1 и (A х CBA)F1 (р<0.05). В возрасте 35 суток контрольная продукция тестостерона кросса (C х PT)F1 в 2.3 раза превышала среднее значение продукции остальных 15 кроссов (F1,636=22.74, p<0.00001).

Влияние генетических факторов на контрольную продукцию тестостерона клетками Лейдига значительно модифицировалось в ходе полового созревания мышей. Об этом свидетельствуют изменение степени межгрупповых различий в постнатальном онтогенезе и изменение порядка (ранга) кроссов по контрольной продукции тестостерона в постнатальном онтогенезе (Рис.2а), на что указывает отсутствие достоверных межгрупповых корреляций между показателями контрольной продукции в различные возрастные периоды (Табл. 3).

Продукция тестостерона клетками Лейдига при их стимуляции ХГ, цАМФ и прегненолоном значительно сильнее, чем контрольная, зависела от возраста животного (Табл. 2). При добавлении в инкубационную среду стимуляторов максимальную усредненную по возрасту продукцию имели клетки Лейдига кроссов (C x PT)F1, (PT x C)F1, а минимальную кроссов (CBA x A)F1 и A (p<0.04). Однако существенное влияние эффекта взаимодействия главных факторов генотипа и возраста животного (Табл. 2) указывает на значительные изменения характера генетических различий в реактивности клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе. Таким образом, характер наследственных различий в реактивности клеток Лейдига к ХГ, цАМФ и прегненолону в различные периоды постнатального развития претерпевал существенные изменения.

Таблица 2. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа цАМФ- и субстрат-зависимой продукции тестостерона клетками Лейдига в постнатальном онтогенезе в полных диаллельных скрещиваниях между четырьмя инбредными линиями мышей (Ахмерова и др. Генетика. 2002. Т. 38. №2. С. 196-206)

Источник изменчивости

Число степеней свободы

Средний квадрат

Критерий Фишера

Уровень значимости

df

M

F

p

Контрольная продукция:

Генотип

Возраст

Взаимодействие

Случайные отклонения

15

3

45

636

6745.80

32093.07

5117.81

2601.27

2.59

12.34

1.97

0.001

0.00001

0.0002

Продукция, стимулированная ХГ:

Генотип

Возраст

Взаимодействие

Случайные отклонения

15

3

45

636

643047

13803300

384525

89595

7.18

154.06

4.29

0.00001

0.00001

0.00001

Продукция, стимулированная цАМФ:

Генотип

Возраст

Взаимодействие

Случайные отклонения

15

3

45

636

378335

15440000

368270

108187

3.50

142.71

3.40

0.00001

0.00001

0.00001

Продукция, стимулированная прегненолоном:

Генотип

Возраст

Взаимодействие

Случайные отклонения

15

3

45

636

2245207

40951800

1485049

328251

6.84

124.76

4.52

0.00001

0.00001

0.00001



В период полового созревания процесс становления стероидогенной функции клеток Лейдига семенников протекал по-разному у 16 изученных нами кроссов: каждый кросс имел свою характерную онтогенетическую динамику продукции тестостерона.

В период 2035 суток установлено препубертатное повышение стимулированной продукции тестостерона различной интенсивности у 16 диаллельных кроссов. В результате чего в

Рис. 1. Среднее изменение показателей цАМФ- и

субстрат-зависимой реактивности клеток Лейдига

по 16 кроссам в постнатальном онтогенезе

возрасте 35 суток межгрупповые различия между отдельными кроссами при стимуляции биосинтеза тестостерона достигли 3-4-кратных величин. Самая высокая продукция тестостерона при действии любого из трех стимуляторов обнаружена в возрасте 35 суток у кросса (CBA PT)F1. У этого кросса по данному признаку наблюдается сверхдоминирование.

Анализ генотипических (межгрупповых) корреляций между показателями реактивности клеток Лейдига к различным стимуляторам стероидогенеза не выявил достоверных связей в возрастные периоды 20-35 и 35-60 суток, что подтверждает перераспределение рангов кроссов к 60-м суткам. Корреляции между показателями гормональной активности были выражены только между 60 и 100 сутками после рождения (Табл. 3), т.е. к концу пубертатного периода развития. Именно к 60 суткам после рождения у самцов мышей начинает складываться дефинитивный паттерн наследования гормональной активности клеток Лейдига. Причем в конце полового созревания и у взрослых животных F1 реципрокные гибриды обеих высоко реактивных и обеих низко реактивных линий имели аналогичную родительским линиям гормональную активность клеток Лейдига: потомки высоко реактивных линий имели также высокие показатели, а потомки низко реактивных линий – низкие.

По степени активации стероидогенеза ХГ, цАМФ и прегненолоном в клетках Лейдига в исследованные возрастные периоды порядок (ранг) кроссов оставался практически одинаковым (Рис. 2, б-г). Следовательно, в каждом исследованном возрастном периоде постнатального онтогенеза нами установлена координированная генетическая изменчивость по трем показателям гормональной активности клеток Лейдига их цАМФ- и субстрат зависимой продукции тестостерона. Наличие сильных положительных межгрупповых (генотипических) корреляций между всеми тремя показателями их реактивности в изученные возрастные периоды также указывает на координированный генетический контроль гормональной активности клеток Лейдига. В основе этой координации, как и у взрослых животных, может лежать коррелятивная межлинейная изменчивость активностей микросомальных ферментов стероидогенеза (Осадчук, Свечников, 1995, 1998), которая, в свою очередь, может зависеть от координированной экспрессии их генов в исследованные периоды постнатального развития.

Генетический диаллельный анализ гормональной функции клеток Лейдига. Метод главных компонент корреляционной матрицы для каждого из четырех периодов постнатального онтогенеза (20, 35, 60 и 100 суток) выявил, что генетическая изменчивость, соответственно на 91, 87, 83 и 92%, определяется одной компонентой или фактором, что также указывает на координированный генетический контроль их гормональной активности. Поскольку значения факторных нагрузок для выделенного фактора в каждом возрастном периоде оказались высокими и имели положительные значения, то, следовательно, мы можем ввести интегральную оценку – координированную реактивность клеток Лейдига (КРКЛ), что позволит провести генетический анализ гормональной активности клеток Лейдига на основе КРКЛ и значительно облегчит изложение и восприятие материала. При помощи метода главных компонент удалось эффективно, без потери существенной информации сократить размерность анализируемых признаков (нормализация на среднее значение признака по всем кроссам), получить интегральную оценку гормональной активности клеток Лейдига и провести ее генетический анализ.

Значения фактора КРКЛ были вычислены для каждого кросса в каждом возрастном периоде. Как и следовало ожидать, межкроссная вариабельность по выделенным факторам являлась фактически интегральным отражением наследственно обусловленной изменчивости по исследуемым показателям цАМФ- и субстрат-зависимой продукции тестостерона клетками Лейдига in vitro (Рис. 3). Иными словами, динамика координированной реактивности клеток Лейдига, построенной для каждого из 16 кроссов по всем трем стимуляторам, практически совпадает с таковой для межгрупповой изменчивости реактивности клеток Лейдига при действии любого из трех стимуляторов стероидогенеза (Рис. 2, б-г).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»