WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 ||

Кроме того, было проведено математическое моделирование кинетической кривой окисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена в присутствии кислорода в буферном растворе, в предположении определенной последовательности стадий взаимопревращений активных парамагнитных интермедиатов пероксидазы (5).

(5)

Наилучшее совпадение экспериментальной и расчетной кривых (рисунок 2) получено при включении в модель в качестве первой стадии акта переноса электрона между НАДН и пероксидазой хрена приводящего к образованию восстановленной формы пероксидазы, Per2+.

Полученные результаты позволили впервые обосновать предположение о том, что первой стадией окисления НАДН в аэробных условиях в отсутствии перекиси водорода является акт одноэлектронного переноса между субстратом и нативным ферментом с образованием восстановленной формы пероксидазы хрена, так называемой, ферропероксидазы (Per2+). В этом случае каталитический цикл окисления НАДН пероксидазой отличается от общепринятых представлений и включает последовательность стадий, приведенную на рисунке 3.

В четвертой главе обсуждаются результаты исследований методами спиновой химии (ХПЯ и МЭ) реакций окисления НАДН и нифедипина, катализируемых пероксидазой хрена в аэробных условиях в отсутствии перекиси водорода.

Анализ эффективных констант скоростей, извлекаемых для реакции окисления НАДН, позволил построить экспериментальную полевую зависимость магнитного эффекта, рассчитываемого как отношение средних значений эффективных констант в магнитном поле к соответствующим константам в нулевом поле. При этом такая зависимость от внешнего магнитного поля была зарегистрирована только для константы k1 (рисунок 4) в последовательности стадий (5).

Наиболее вероятной магниточувствительной стадией является акт переноса электрона между нативной ПХ и НАДН. Последующее превращение ферропероксидазы в реакции с кислородом (рисунок 3) протекает в кинетическом диапазоне, поэтому скорость образования компаунда III будет намного меньше скорости гипотетически возможной спиновой конверсии в паре (Per2+ O2), следовательно, этот процесс, скорее всего, не будет спиновозависимым. Взаимодействие компаунда III с радикалом НАД тоже не может быть источником заметного магнитного эффекта, если в результате его встречи с радикалом НАД в объеме образуется так называемая F-пара, в которой, как известно, не формируются значительные магнитные эффекты. Что касается последующих стадий каталитического цикла, то при взаимодействии компаунда I и НАДН не происходит формирования РП, а стадия образования пероксидазы в результате реакции между компаундом II и молекулой НАДН вообще не учитывалась в аналитической функции, поскольку в исследованном временном диапазоне данная стадия не наблюдалась. Таким образом, имеются достаточные доказательства полагать, что зависимость константы k1 от напряженности внешнего магнитного поля обусловлена его влиянием на скорость образования ферропероксидазы в процессе одноэлектронного переноса между ПХ и НАДН.

Для проверки предположения о формировании магнитного эффекта на первой стадии каталитического цикла был проведен теоретический расчет полевой зависимости магнитного эффекта для парамагнитной пары (Per2+ НАДН+). Расчет вероятности рекомбинации исследуемой РП проводился в рамках формализма матрицы плотности для двухпозиционной модели. Основы этого подхода подробно описаны в первой главе диссертационной работы. Предполагалось, что наблюдаемая спиновая эволюция в РП определяется взаимодействием электронных спинов с постоянным внешним магнитным полем, изотропным сверхтонким взаимодействием неспаренных электронов с магнитными ядрами и обменным взаимодействием между неспаренными электронами, которое расщепляет термы радикальной пары на дублетный и квартетный.

Экспериментальная зависимость МЭ (рисунок 4) демонстрирует хорошее согласие с теоретической (рисунок 5) в предположении, что РП (Per2+ НАДН+) образуется в акте одноэлектронного переноса от НАДН к нативной ПХ в квартетном состоянии.

Интеркомбинационная конверсия переводит нереакционноспособное исходное квартетное спиновое состояние в реакционноспособное дублетное. Последнее в результате рекомбинации (обратного переноса электрона) обеспечивает регенерацию исходной ПХ и НАДН (рисунок 6).

Таким образом, проведенные исследования влияния магнитного поля на кинетику процесса каталитического окисления НАДН пероксидазой хрена продемонстрировали, что начальной стадией ферментативного окисления НАДН в отсутствии перекиси водорода является акт одноэлектронного переноса между субстратом и нативным ферментом с формированием РП (Per2+ НАДН+).

Дополнительным подтверждением наличия стадии одноэлектронного переноса в каталитическом цикле ПХ стали исследования магнитных эффектов в реакциях ферментативного окисления синтетического аналога НАДН, нифедипина (НФ). Было показано, что при окислении нифедипина наблюдается аналогичная последовательность взаимопревращений активных парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена (5), причем магниточувствительной также оказывается эффективная константа первой стадии процесса. Расчет в рамках теории радикальных пар для многоспиновых систем показал, что экспериментальная зависимость МЭ совпадает с теоретической в предположении, что магниточувствительной стадией, также как и в случае реакции с НАДН, является первая стадия каталитического цикла, то есть окисление НФ так же начинается со стадии одноэлектронного переноса и формирования РП (Per2+ НФ+•) в квартетном состоянии.

Кроме того, наблюдение эффекта ХПЯ (рисунок 7) при взаимодействии фотовозбужденного НАДН с пероксидазой хрена, который, согласно теоретическим расчетам, формируется в результате квартет-дублетной эволюции в РП (Per2+ НАДН+) и проявляется только на С(4) атомах НАДН (рисунок 8), не только подтверждает вывод о возможности переноса электрона между НАДН и гемом пероксидазы, но и позволяет сделать два важных вывода.

Первый вывод касается доказательства образования катион-радикала НАДН, которое постулировалось при анализе магнитного эффекта. Такой вывод имеет принципиально важное значение, поскольку является убедительным доказательством возможности одноэлектронного постадийного окисления НАДН в биологических системах: НАДН НАДН•+ НАД• НАД+. Второй вывод основан на особенностях ингибирования пероксидазы продуктами ферментативного окисления и формирования фермент-субстратного комплекса. Показано, что при неконкурентном ингибировании продуктом окисления (НАД+) реакция смешения ПХ и НАДН не наблюдается. Однако такое неконкурентное ингибирование не влияет на фотоиндуцированный перенос электрона между ферментом и субстратом (возможно, при этом меняются акцепторные свойства пероксидазы, например, полуволновой потенциал восстановления), не препятствуя образованию фермент-субстратного комплекса и не оказывая существенного влияния на расстояния между активным центром фермента и связанным с ним в комплекс субстратом.

Наблюдение влияния внешнего магнитного поля на эффективные константы скорости трансформации активных частиц каталитического цикла пероксидазы указывает на зависимость каталитических процессов от спиновых состояний парамагнитных интермедиатов. Действительно, в рекомбинирующем дублетном состоянии РП приводит к образованию исходной пероксидазы, тем самым, нарушая каталитический цикл (или возвращая его в исходную точку), в то время как в соответствии с правилами отбора РП в нерекомбинирующем квартетном состоянии оказывается предшественником следующей стадии каталитического цикла. Таким образом, в зависимости от мультиплетности исходной парамагнитной пары, внешнее магнитное поле может ускорить или замедлить трансформацию реакционноспособных интермедиатов.

Согласие экспериментальных полевых зависимостей магнитных эффектов, зарегистрированных в процессах окисления, катализируемых пероксидазой хрена, с рассчитанными в рамках развитых приближений теории радикальных пар для многоспиновых ферментативных систем, позволяет сделать важные выводы о детальных механизмах процессов, образующих каталитический цикл.

Молекулярная динамика партнеров фермент-субстратного комплекса должна удовлетворять основным приближениям теории РП, а именно: скорости переноса электрона в ферментативном процессе должны быть близки к диффузионным (иначе невозможно проявление магнитного эффекта), времена жизни активных реагирующих интермедиатов не должны быть длиннее микросекунд, а расстояния в фермент-субстратном комплексе находиться в диапазоне расстояний для неконтактных ион-радикальных пар, то есть ~ 7-10. Расчетные полевые зависимости лучше всего совпадали с экспериментальными (для НАДН и нифедипина, НФ) для субмикросекундных времен жизни пары парамагнитных частиц. Поскольку в основе расчетной модели лежит представление о диффузионном движении партнеров, приходится предполагать, что в ферментативном процессе сохраняется определенная подвижность реагентов. Кроме этого, наличие на полевых зависимостях экстремумов в магнитных полях с напряженностью порядка сотен Гаусс однозначно указывает на проявление электронного обменного взаимодействия между партнерами в каталитическом цикле ПХ. Последнее, очевидно, указывает на связывание субстрата в активном центре фермента.

ВЫВОДЫ

1. В результате спектрофлуориметрических исследований процесса автоокисления НАДН показано, что количество перекиси водорода, накапливающееся при автоокислении НАДН, мало и не может обеспечить протекание постулируемой в литературе первой стадии каталитического цикла пероксидазы хрена – превращение ПХ в активный интермедиат компаунд I.

2. На основании анализа кинетических кривых и спектров поглощения короткоживущих интермедиатов, зарегистрированных при взаимодействии пероксидазы хрена и НАДН в бескислородной среде, сделан вывод, что начальной стадией каталитического цикла пероксидазы хрена является образование ферропероксидазы (восстановленной формы нативной пероксидазы).

3. Предложена кинетическая модель каталитического цикла пероксидазы хрена в процессе ферментативного окисления НАДН и нифедипина, включающая последовательное превращение нативной пероксидазы в ферропероксидазу, компаунд III, компаунд I и, наконец, в компаунд II.

4. Обнаружено влияние постоянного внешнего магнитного поля на кинетику превращения парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена. Продемонстрировано совпадение экспериментального эффекта с рассчитанным в предположении, что магнитный эффект формируется в акте обратного переноса электрона в паре ферропероксидаза и катион-радикал НАДН (или нифедипина).

5. Дополнительное подтверждение магниточувствительных квартет-дублетных переходов продемонстрировано с помощью наблюдения эффекта ХПЯ в парамагнитной паре ферропероксидаза и катион-радикал НАДН (Per2+ НАДН•+).

6. Применение методов спиновой химии также позволило сделать ряд важных заключений об особенностях элементарного акта в ферментативных системах на примере пероксидазы хрена:

6.1 Наличие магнитного эффекта указывает на то, что скорость превращений парамагнитных интермедиатов в каталитическом цикле может зависеть от их спиновых состояний и меняться при воздействии внешнего магнитного поля.

6.2 Совпадение расчетных полевых зависимостей магнитных эффектов, а также эффектов ХПЯ с экспериментальными только с учетом электронного обменного взаимодействия указывает на наличие связывания субстрата с ферментом.

6.3 Полученные доказательства участия радикальных состояний НАДН в реакциях ферментативного окисления указывают на возможность постадийного одноэлектронного окисления НАДН в биологических системах: НАДН НАДН•+ НАД• НАД+.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах

1. Afanasyeva M.S., Taraban M.B., Purtov P.A., Leshina T.V., Grissom C.B., Magnetic spin effects in enzymatic reactions: radical oxidation of NADH by horseradish peroxidase // J. Am. Chem. Soc. - 2006. - V. 128, No. 26. - P. 8651-8658.

2. Afanasyeva M.S., Taraban M.B., Polyakov N.E., Purtov P.A., Leshina T.V., Grissom C.B., Elementary steps of enzymatic oxidation of nifedipine catalyzed by horseradish peroxidase // J. Phys. Chem. B. - 2006. - V. 110, No. 42. - P. 21232-21237.

3. Афанасьева М.С., Пуртов П.А., Тарабан М.Б., Лешина Т.В., Гриссом Ч.Б., Исследование фотоокисления NADH, катализируемого пероксидазой хрена, методом химической поляризации ядер // Изв. РАН, Сер. хим. - 2006. - № 7. - C. 1090-1094.

4. Афанасьева М.С., Пуртов П.А., Тарабан М.Б., Лешина Т.В., Спиновая химия ферментативных процессов // Усп. хим. - 2007. - V. 76, No. 6. - C. 651-668.

5. Афанасьева М.С., Применение методов спиновой химии для изучения цикла окисления NADH, катализируемого пероксидазой хрена. Тезисы докладов XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», секция «Химия», Новосибирск, Россия. - 2004. - C. 132.

6. Afanasyeva M.S., Taraban M.B., Purtov P.A., Leshina T.V., Grissom C.B., New reactive intermediates in enzymatic oxidations studied by means of spin chemistry methods. Book of Abstracts of 2nd International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances. Novosibirsk, Russia. September 12-17, 2004. - P.33.

7. Афанасьева М.С., Тарабан М.Б., Пуртов П.А., Лешина Т.В., Гриссом Ч.Б., Магнитные эффекты в процессах ферментативного окисления пероксидазой хрена. Тезисы докладов XVIII Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, Россия. 22 сентября - 3 октября 2006. - С. 85.

Pages:     | 1 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»