WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 |

На правах рукописи

Афанасьева Мария Сергеевна

РОЛЬ ПАРАМАГНИТНЫХ ИНТЕРМЕДИАТОВ В ФЕРМЕНТАТИВНОМ ОКИСЛЕНИИ ПЕРОКСИДАЗОЙ ХРЕНА

01.04.17 – химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Новосибирск – 2007

Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат химических наук Тарабан Марк Борисович

Официальные оппоненты:

кандидат физико-математических наук Стась Дмитрий Владимирович

доктор химических наук Фёдорова Ольга Семёновна

Ведущая организация:

Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Защита диссертации состоится «30» января 2008 г. в 15.00 на заседании диссертационного совета Д 003.014.01 в Институте химической кинетики и горения СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и горения СО РАН.

Автореферат разослан « 10 » декабря 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор химических наук А.А. Онищук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие методы спиновой химии находят все более широкое применение для исследования сложных химических и биологических процессов. Их использование позволяет решить одну из ключевых задач современной химии - определение строения и свойств короткоживущих интермедиатов химических реакций.

Изучение ферментативных реакций и установление их элементарных стадий имеет особое значение как для понимания механизмов каталитического действия ферментов, так и для исследования актуальной проблемы участия ферментов в процессах регулирования образования и гибели свободнорадикальных частиц в биологических системах.

Совместное применение методов спиновой химии и расчетных методов квантовой химии позволяет получать важную информацию о механизмах реакций, катализируемых ферментами. Кроме того, установление детальных механизмов ферментативного катализа, важно для понимания факторов, обеспечивающих его эффективность и высокую степень специфичности. Спиновые состояния парамагнитных интермедиатов ферментативного каталитического цикла должны обеспечивать такую корреляцию электронных спинов, которая никоим образом (например, вследствие спинового запрета) не нарушила бы закономерной последовательности взаимопревращений в каталитическом цикле. Механизм, обеспечивающий необходимую корреляцию электронных спинов, изучен слабо. В этой связи, методы спиновой химии представляют огромную ценность, поскольку именно их применение позволяет вскрыть роль спиновых состояний и факторы, определяющие селективность ферментативных процессов.

Основные цели работы:

1. Кинетическими методами и методами спиновой химии установить элементарные стадии взаимодействия пероксидазы хрена с субстратами: нативным – никотинамидадениндинуклеотидом (НАДН), и специфичным, синтетическим аналогом НАДН – 1,4-дигидро-2,3-диметил-3,5-дикарбометокси-4-нитрофенилпиридином, нифедипином (НФ).

2. Разработать кинетическую модель, описывающую последовательность взаимопревращений интермедиатов каталитического цикла пероксидазы хрена.

3. В рамках теории радикальных пар дать описание магнитных и спиновых эффектов для многоспиновых ферментативных систем.

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование детального механизма первой стадии каталитического цикла пероксидазы хрена. Показано, что при аэробном окислении субстратов без перекиси водорода, начальной стадией цикла является акт одноэлектронного переноса в фермент-субстратном комплексе с образованием ферропероксидазы. Впервые зарегистрированы эффекты ХПЯ в ферментативном процессе. Впервые использовались расчетные методы квантовой химии для описания многоспиновых ферментативных систем. С помощью такого подхода удалось доказать формирование прочного фермент-субстратного комплекса, определить, что в акте одноэлектронного переноса дигидропиридиновый фрагмент НАДН в фермент-субстратном комплексе располагается близко к плоскости гема. Продемонстрировано влияние спинового состояния исходной парамагнитной пары на каталитический цикл пероксидазы хрена. Также получены доказательства одноэлектронного многостадийного окисления НАДН в биологических системах: НАДН НАДН•+ НАД• НАД+. При исследовании системы НАДН – ПХ методом ХПЯ показано, что неконкурентное ингибирование пероксидазы изменяет ее акцепторные свойства, но существенно не влияет на расстояния в фермент-субстратном комплексе.

Практическая ценность работы. Проведенное исследование раскрывает элементарный механизм действия пероксидазы хрена, как катализатора, в аэробных условиях в отсутствии инициатора окисления, перекиси водорода, и меняет представление о проявлениях стадии одноэлектронного переноса в реакциях гем-содержащих ферментов, а также имеет огромное значение для понимания селективного действия ферментов и роли спиновых состояний парамагнитных интермедиатов в обеспечении селективности. Тот факт, что парамагнитные интермедиаты могут находиться в двух состояниях, одно из которых является реакционноспособным и приводит к следующей стадии каталитического цикла, а второе возвращает реакцию к исходным реагентам, создает предпосылки для использования этих знаний для разработки новых биотехнологических процессов с использованием моделей активных центров ферментов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих международных конференциях и симпозиумах: 8th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena, Chapel Hill, NC, USA, September, 2003; Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, Россия, 2004; Biological Research Trust Workshop, The Royal Society, London, United Kingdom, January 15, 2004; 2nd International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances, Novosibirsk, Russia, 2004; XVIII Симпозиум «Современная химическая физика», Туапсе, Россия, 22 сентября – 3 октября, 2006.

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 3 статьях, 1 обзоре и 3 тезисах международных научных конференций и симпозиумов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 77 наименований. Работа изложена на 131 странице, содержит 2 таблицы, 1 схему и 44 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении изложена актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи работы.

В первой главе представлен обзор литературы, посвященный современным представлениям о реакциях, катализируемых пероксидазой хрена (ПХ), а также методам спиновой химии как инструменту исследования ферментативных процессов. Описаны особенности процессов окисления субстратов (изобутиральдегида и НАДН), катализируемых ПХ, окисления НАДН в колебательной пероксидазно-оксидазной реакции. Рассмотрены методы исследования элементарных процессов, приводящих к свободным радикалам и аспекты применения методов спиновой химии для исследования сложных ферментативных систем. Обсуждаются первые попытки применения методов спиновой химии (магнитного эффекта, МЭ) для установления механизмов ферментативных процессов. При исследовании окисления 2-метил-1-(триметилсилилокси)проп-1-ена, катализируемого ПХ в присутствии перекиси водорода в стационарном режиме была установлена магниточувствительная стадия процесса – стадия каталитического цикла, включающая взаимодействие компаунда II и субстрата.

На основании сопоставления экспериментальных результатов с квантовохимическими расчетами было показано, что радикальная пара, в которой происходит перенос электрона образуется в триплетном состоянии, приводящем к регенерации компаунда II, в то время как ее синглетное состояние приводит к исходной пероксидазе. Так, впервые было продемонстрировано влияние спинового состояния радикальной пары на взаимопревращения активных парамагнитных интермедиатов в каталитическом цикле. При изучении механизма окисления НАДН в режиме осцилляций было зарегистрировано влияние внешнего магнитного поля на изменение концентрации кислорода, но вследствие отсутствия модели описания магнитного эффекта, проведенные исследования не позволили решить вопрос о магниточувствительной стадии процесса, а также установить точный механизм взаимопревращений парамагнитных интермедиатов. Последний раздел литературного обзора посвящен описанию теории магнитных и спиновых эффектов, применяемой для квантово-механических расчетов вероятности рекомбинации парамагнитных пар в многоспиновых системах.

Заканчивается обзор литературы постановкой задачи, в рамках которой планировалось применение методов спиновой химии для исследования радикальных стадий окисления НАДН и его синтетических аналогов, катализируемого пероксидазой хрена, а также для установления структуры и механизмов взаимопревращений парамагнитных интермедиатов этих процессов. Предлагается использовать методики остановленной струи со спектрофотометрической регистрацией в сочетании с экспериментами по наблюдению магнитных и спиновых эффектов для получения информации о магниточувствительных стадиях ферментативного окисления и спиновых состояниях образующихся интермедиатов. Для установления структуры парамагнитных интермедиатов стадии инициирования каталитического цикла пероксидазы хрена анализируются эффекты химической поляризации ядер в акте фотоиндуцированного одноэлектронного переноса на начальной стадии процесса, а также исследуются спектроскопические характеристики промежуточных частиц в условиях остановки каталитического цикла. Для получения выводов о структуре и спиновых состояниях парамагнитных интермедиатов следует провести моделирование экспериментальных магнитных эффектов и эффектов химической поляризации ядер в рамках описания многоспиновых ферментативных систем на основе теории радикальных пар.

Во второй главе описаны экспериментальные установки, в частности: быстросканирующий спектрофотометр остановленной струи OLIS-RSM-1000, модифицированный для проведения реакций смешения в магнитных полях различной напряженности, а также установка для исследования фотоиндуцированной химической поляризации ядер в ферментативных системах на базе серийного спектрометра ЯМР Bruker DPX-200 (1H, 200 мГц). Также приведена подробная методика приготовления образцов.

В третьей главе обсуждаются результаты кинетических исследований автоокисления НАДН в средах с различным значением рН и флуориметрическое определение концентраций перекиси водорода, накапливающейся при таком автоокислении. Показано, что даже в кислых средах при выдерживании раствора при комнатной температуре концентрация образующейся перекиси столь мала (таблица 1), что только через двухчасовой промежуток времени достигает значений, достаточных для инициирования процесса окисления НАДН (1) в результате превращения пероксидазы хрена в компаунд I (2).

НАДН + O2 + H+ НАД+ + H2O2 (1)

Per3+ + H2O2 компаунд I + H2O (2)

Что касается нейтрального и щелочного значений рН, то в данных условиях концентрация образовавшейся перекиси на два порядка ниже, чем в кислых средах, что недостаточно для инициирования каталитического цикла, включающего превращение пероксидазы хрена в компаунд I.

Таблица 1. Концентрация накопленной перекиси водорода при окислении раствора НАДН в различных средах

Среда

с(Н2О2), мкМ

NaOH (pH = 8.1)

0.19

фосфатный буфер (KH2PO4 + K2HPO4, pH = 7.2)

0.2

NaOH + HCl (pH = 6.4)

14

MES буфер (pH = 5.56)

43


Основываясь на полученных данных о пренебрежимо малой скорости автоокисления НАДН в нейтральных и щелочных средах, не приводящего к достаточным концентрациям перекиси, а также принимая во внимание термодинамические и кинетические особенности данной реакции, разумно было предположить, что в отсутствии перекиси водорода инициирующей стадией является акт одноэлектронного переноса в фермент-субстратном комплексе [Per3+НАДН] с образованием ферропероксидазы (Per2+) (3).

Per3+ + HАДН [Per3+НАДН] Per2+ + HАДН+ (3)

Поскольку образующаяся в акте одноэлектронного переноса ферропероксидаза быстро реагирует с растворенным кислородом буферного раствора с образованием компаунда III (4), для доказательства проявления стадии одноэлектронного переноса между НАДН и пероксидазой хрена в процессе ферментативного окисления, была предпринята попытка остановить реакцию окисления НАДН на стадии образования Per2+, проводя взаимодействие между пероксидазой хрена и НАДН в бескислородной среде.

Per2+ + O2 компаунд III (4)

Эксперимент проводился на установке остановленной струи, которая позволяет получать трехмерные зависимости оптического поглощения смеси от времени реакции и длины волны. Анализ кинетики взаимопревращений активных парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена на разных длинах волн в фиксированный момент времени показал, что спектр поглощения реакционной смеси представляет собой сумму поглощений исходной пероксидазы и интермедиата стадии инициирования реакции, Per2+.

Действительно, после вычета спектра пероксидазы хрена из суммарного спектра реакционной смеси, результирующим оказался известный из литературы спектр Per2+ с максимумом на 435 нм (рисунок 1).

На основании анализа кинетических кривых, зарегистрированных при проведении реакции между ПХ и НАДН в бескислородной среде, был сделан важный вывод о том, что начальной стадией процесса ферментативного окисления НАДН в отсутствии перекиси водорода, является стадия образования восстановленной формы пероксидазы, ферропероксидазы.

Pages:     || 2 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»