WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Изоляция микросателлитов непосредственно из геномов изучаемых видов – процесс трудоемкий и дорогостоящий. В нашей работе для выявления SSR-локусов Aegilops были использованы праймеры к фланкирующим районам микросателлитов T. aestivum. Для проведения микросателлитного анализа с локализацией маркеров на хромосомах были выбраны виды: Ae. speltoides, Ae. longissima, Ae. searsii и полученные с их участием пшенично – эгилопсные дополненные линии. Учитывались все воспроизводимые продукты амплификации с длиной, типичной для микросателлитных маркеров пшеницы (70–300 пн). Использование 253 SSR-праймеров мягкой пшеницы показало, что с помощью 88% праймеров маркеров генома B, 72% праймеров маркеров А-генома и 74% праймеров к SSR-локусам генома D выявляются фрагменты амплификации с ДНК исследованных видов (Adonina et al., 2005). Таким образом, наибольший процент праймеров, обеспечивающих амплификацию фрагментов ДНК видов Aegilops секции Sitopsis приходится на праймеры маркеров B-генома T. aestivum. Это естественно, поскольку данные виды рассматриваются в качестве доноров именно этого генома мягкой пшеницы. То, что маркеры геномов A и D мягкой пшеницы амплифицируются у видов секции Sitopsis, может свидетельствовать о древнем происхождении этих районов ДНК, а также об их высоком уровне консервативности.

Больше всего маркеров T. aestivum, 70%, амплифицируется в геноме Ae. speltoides. Для этого же вида было выявлено наибольшее количество полиморфных маркеров, 161 из 177 амплифицирующихся (90%). Внутри вида Ae. longissima оказались полиморфными 75% амплифицирующихся маркеров. Более высокий уровень полиморфизма микросателлитных маркеров у Ae. speltoides, объясняется тем, что данный вид – единственный перекрестноопыляемый представитель секции Sitopsis.

Использование дополненных пшенично – эгилопсных линий позволило нам локализовать 103 маркера на хромосомах исследованных видов Aegilops. В качестве примера на рисунке 1 представлен амплификационный профиль маркера Xgwm382 у видов Aegilops и в дополненных линиях.

Рис. 1 Амплификационный профиль маркера Xgwm382 в геномах видов Aegilops и дополненных пшенично - эгилопсных линий. Данные электрофореза обработаны с помощью компьютерной программы Fragment Analyzer: (а) - дополненные линии T. aestivum–Ae. speltoides; (б) - дополненные линии T. aestivum–Ae. longissima; (в) - дополненные линии T. aestivum–Ae. searsii. Стрелками обозначены фрагменты амплификации, соответствующие видам Aegilops. Горизонтальная шкала отражает размер фрагментов в пн, рассчитанный исходя из длины внутренних стандартов (73 пн и 231 пн).

Большинство маркеров имеет гомеологичную локализацию в геноме S видов Aegilops секции Sitopsis. Все эти маркеры представлены на схематичной консенсусной карте хромосом генома B мягкой пшеницы (рис. 2). Три случая негомеологичной хромосомной локализации SSR-маркеров T. aestivum в геноме Aegilops были отмечены нами как возможные транслокации (рис. 2).

Рис. 2 Схематичная консенсусная карта хромосом B-генома T. aestivum (Rder et al., 1998). На карте отмечены SSR-маркеры T. aestivum, для которых была определена предположительная хромосомная локализация в геномах изученных видов Aegilops. Жирным шрифтом выделены маркеры, локализованные на гомеологичных хромосомах геномов A и D T. aestivum и маркеры, картированные в G-геноме T. timopheevii (Salina et al., 2006a); стрелками указана их примерная локализация на консенсусной карте. Звездочками отмечены предполагаемые транслокации.

Использование SSR-маркеров для уточнения филогенетических взаимоотношений видов Aegilops и Triticum.

SSR-маркеры были использованы нами для оценки филогенетических отношений между видами Aegilops и Triticum. Для построения дендрограммы, включающей всех представителей секции Sitopsis (рис. 3) мы провели дополнительно микросателлитный анализ видов Ae. sharonensis и Ae. bicornis с использованием 45 пар праймеров. В анализ так же были включены: T. timopheevii (вид с геномом G) и T. aestivum (вид с геномом B). Каждая пара праймеров выявляла от 2 до 16 микросателлитных аллелей.

Рис. 3 Дендрограмма 15 образцов видов Aegilops секции Sitopsis, 4 линий T. timopheevii и T. aestivum (сорт “Chinese Spring”). Генетическая дистанция рассчитана, исходя из данных по 463 микросателлитным аллелям. На дереве отмечены соответствующие бутстреп-значения для ветвей.

На представленной дендрограмме (рис. 3) образцы группируются преимущественно согласно видам, за исключением кластера, образованного тремя видами: Ae. longissima, Ae. sharonensis и Ae. bicornis. Это может объясняться недостаточным для разделения данной группы видов числом маркеров, использованных при построении дендрограммы, и возможно связано с тем, что, по мнению ряда исследователей, вид Ae. sharonensis произошел в результате межвидовой гибридизации Ae. bicornis и Ae. longissima.

Согласно полученной дендрограмме, Ae. speltoides располагается ближе к T. timopheevii, чем другие виды секции Sitopsis. Это подкрепляет предположение о том, что Ae. speltoides является наиболее вероятным донором генома G полиплоидных пшениц. T. aestivum (вид с геномом B) равноудален от всех представителей секции Sitopsis. С использованием большего числа SSR-праймеров (68 пар) была построена дендрограмма для Ae. speltoides, Ae. longissima, Ae. searsii и T. aestivum, на которой Ae. speltoides и T. aestivum образуют один кластер с величиной бутстрепа, равной 96, а Ae. longissima и Ae. searsii образуют второй кластер. Полученные данные указывают на Ae. speltoides, как на наиболее вероятного донора генома B T. aestivum.

В целом, в обоих случаях кластерный анализ выявляет одни и те же особенности, которые согласуются с основными современными представлениями о филогенетических отношениях между исследуемыми видами. Например, по разным признакам многие исследователи выделяют Ae. speltoides среди остальных представителей секции Sitopsis. На построенных нами дендрограммах образцы Ae. speltoides так же расположенны обособленно от остальных видов секции Sitopsis.

Следует отметить, что с увеличением количества маркеров, использованных для построения дендрограммы трех видов Aegilops и T. aestivum, увеличиваются значения бутстрепов для всех ветвей, что говорит о большей достоверности итоговой дендрограммы, построенной с использованием большего числа маркеров.

Изучение популяционного полиморфизма видоспецифичных макросателлитных субтеломерных повторов Aegilops секции Sitopsis.

На настоящий момент известно два семейства видоспецифичных макросателлитных повторов представителей секции Sitopsis: Spelt1 и Spelt52. Оба повтора имеют субтеломерную локализацию, изучены их структура и межвидовой полиморфизм. Для использования Spelt1 и Spelt52 в качестве маркеров было необходимо исследование их популяционного полиморфизма у видов Aegilops.

Проведенная нами дот-гибридизация повторов Spelt1 и Spelt52 с ДНК различных образцов Aegilops показала значительный полиморфизм количественного содержания изучаемых повторов между разными образцами одного вида. Внутри большинства образцов Aegilops были так же выявлены достоверные различия по содержанию Spelt1 и Spelt52.

С помощью флуоресцентной гибридизации in situ мы изучили распределение блоков повторов на хромосомах индивидуальных растений Ae. speltoides K-389 и Ae. longissima TL05. Для идентификации хромосом использовался зонд pSc119.2.

Рис. 4 Гибридизация in situ зонда Spelt52 (черный) на хромосомы индивидуальных растений Ae. longissima TL05: (а) – растение 1; (б) – растение 2; (в) – растение 3; (г) - растение 4.

Обнаружен значительный полиморфизм по числу блоков повтора Spelt52 (рис. 4). У Ae. longissima картировано 4 сайта Spelt52 на гаплоидный геном. По трем из них наблюдается полиморфизм, как между индивидуальными растениями, так и между гомологичными хромосомами (рис. 5). Результаты дот-гибридизации так же свидетельствуют о достоверных различиях между индивидуальными растениями в содержании повтора. У Ae. speltoides полиморфными оказались два из четырех сайтов Spelt52 (рис. 5).

Все хромосомы Ae. speltoides К-389 несут блоки Spelt1 на каждом плече, за исключением хромосомы 4S, у которой единственный блок локализован на длинном плече (рис. 5). Среди проанализированных растений не было отмечено полиморфизма по количеству блоков Spelt1, несмотря на то, что при дот-гибридизации ДНК наблюдались статистически достоверные различия в содержании повтора между индивидуальными растениями.

Рис. 5 Обобщенная идиограмма хромосом Ae. speltoides K-389 и Ae. longissima TL05 после FISH с пробами Spelt1 (левый гомолог) и Spelt52 (правый гомолог).

* Непостоянные сайты гибридизации

* Гетероморфизм между гомологичными хромосомами

Таким образом, у разных растений внутри одной популяции могут наблюдаться как изменение числа сайтов локализации изучаемых повторов на хромосомах, так и количественные вариации повторов в пределах отдельных блоков.

Использование тандемных повторов, в качестве маркеров для анализа гибридных форм мягкой пшеницы, полученных с участием Aegilops секции Sitopsis.

В задачи нашей работы входила оценка эффективности использования геном-специфичных макросателлитных повторов Spelt1, Spelt52 и SSR-маркеров для анализа гибридных форм мягкой пшеницы, полученных с участием Aegilops секции Sitopsis.

Всего было проанализировано 11 интрогрессивных линий, полученных путем скрещивания мягкой пшеницы сорта «Родина» с Ae. speltoides К-389 (Лапочкина, 1999).

Дот-гибридизация с радиоактивно-меченными зондами (рис. 6) показала достоверное присутствие повтора Spelt1 в семи линиях, наиболее выделяются по содержанию Spelt1 линии: 32/98w, 170/98i, 178/98i. Повтор Spelt52 был выявлен в восьми линиях, наиболее выделяется по содержанию Spelt52 линия

182/98i.

Рис. 6 Результаты дот-гибридизации повторов Spelt1, Spelt52 с ДНК интрогрессивных линий T. aestivum Ae. speltoides: 1 – 32/98w; 2 – 75/98w; 3 – 84/98w; 4 – 167/98i (73/00i); 5 – 170/98i (76/00i); 6 – 172a/98i (78/00i); 7 – 172b/98i (79/00i); 8 – 178/98i (81/00i); 9 – 182/98i (84/00i); 10 – 207/98i (102/00i); 11 – 255/98i (103/00i); 12 - T. aestivum «Родина». В скобках указаны новые обозначения линий (персональное сообщение И.Ф. Лапочкиной) далее в работе линии обозначаются в соответствии с публикациями (Salina et al., 2001; Adonina et al., 2004).

Увеличение содержания повтора по сравнению с T. aestivum «Родина» достоверно при: **Р0,99, ***Р0,999.

С помощью гибридизации in situ продемонстрировано, что линии: 32/98w, 170/98i, 178/98i несут от двух до четырех хромосомных плеч или субтеломерных районов Ae. speltoides с блоками повтора Spelt1, в остальных линиях данный метод не выявил блоков Spelt1. Ни в одной из исследованных линий методом FISH не было выявлено сайтов гибридизации со Spelt52.

Рис. 7 Авторадиогамма, полученная после «squash»-дот гибридизации радиоактивно-меченного зонда Spelt1 с раздавленными корешками интрогрессивных линий T. aestivum Ae. speltoides: 1 – 32/98w; 2 – 75/98w; 3 – 84/98w; 4 – 207/98i; 5 – 167/98i; 6 – 170/98i; 7 – 172a/98i; 8 – 172b/98i; 9 – 178/98i; 10 –182/98i; 11 – 255/98i; 12 - T. aestivum «Родина»; 13 - Ae. speltoides K389.

Высокая копийность повтора Spelt1 позволяет использовать его для первичной оценки интрогрессии без выделения ДНК, методом гибридизации меченого зонда с меристематической тканью корешков (рис. 7). Причем интенсивность сигнала коррелирует с количеством блоков Spelt1, выявленных в соответствующих линиях с помощью FISH.

Таким образом, из двух, рассматриваемых в работе геном-специфичных повторяющихся последовательностей, наиболее удобным маркером субтеломерных участков хромосом Ae. speltoides К-389 оказался тандемный повтор Spelt1.

Линия 170/98i с одним блоком Spelt1 на гаплоидный набор хромосом является удобной моделью для исследования динамики количественных изменений Spelt1 у потомков одного растения, полученных путем самоопыления, поскольку изучать данный аспект в поколениях растений Ae. speltoides сложно из-за множественных участков локализации повтора в геноме данного вида. На рисунке 8 представлены результаты дот-гибридизации ДНК потомков одного из растений этой линии с зондом Spelt1. В 11 случаях с разной степенью достоверности наблюдается уменьшение содержания повтора по сравнению с родительским растением. Достоверного увеличения содержания повтора в потомстве нами не обнаружено. Таким образом, выявлена тенденция к элиминации повтора Spelt1 при самоопылении пшенично-эгилопсных гибридов, которая может быть обусловлена гибридным дисбалансом.

Рис. 8 Результаты дот-гибридизации ДНК потомков одного из растений линии 170/98i с радиоактивно меченым зондом Spelt1. За 100% принято количественное содержание Spelt1 в родительском растении. Изменение содержания повтора по сравнению с родительским растением достоверно при: *Р0,95, **Р0,99, ***Р0,999.

С целью определения протяженности и локализации участков интрогрессии генетического материала Ae. speltoides в геноме пшеницы мы провели микросателлитный анализ двух интрогрессивных линий: 170/98i и 178/98i.

Рис. 10 Схематическое изображение замещения хромосом и предполагаемой транслокации в интрогрессивных линиях: (а) 170/98i и (б) 178/98i. Хромосомный материал Ae. speltoides выделен черным цветом. C – центромера. Локализация микросателлитных маркеров (Xgwm) указана в соответствии с данными для T. aestivum (Rder et al., 1998).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»