WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 13 |
F

L

P

7.0x106












SA-7/IV-19


H

K

I

H

F

L

P

1.5x107












SA-7/IV-20


R

K

L

H

F

L

P

9.3x106












SA-7/IV-21


S

K

I

H

F

Y

H

5.3x106

Примечание: в таблице жирным шрифтом выделеныаминокислотные остатки, совпадаю­щие со структуройпредполагаемого эпитопа для антител;подчеркнуты аминокислотные остатки,являющиеся гомологичной заменойаминокислотного остатка в структурепред­полагаемого эпитопа дляантител.

С целью определенияструктуры консенсусных мимотопов дляантител вычисляли и анализиро­вали частотувстречаемости каждого аминокислотногоостатка (а.о.) в пептидах, представленныхотобранными фагами. Таким образом,консенсусный мимотоп для антитела SA-7определили а.о. XKIHFFP. Cовмещение консенсусного мимотопадля антитела SA-7 со структуройполноразмерного Fas позволилопредполо­жить,что эпитоп для этого антитела определяюта.о. экстраклеточной части Fas 130—134. Из 6 а.о.консенсусной мимотопнойпоследовательности три остатка совпали соструктурой предполагаемого эпитопа.Консенсус­ныймимотоп для антитела SA8 определяли а.о.:XKIHFХS. Совмещение консенсусного мимотопа саминокислотной последовательностьюполноразмерного Fas позволило сделатьпредположение, что эпитоп для антителаSA8 определяюта.о. 94 — 99экстраклеточной части Fas. Четыре из семиа.о. консенсусного мимотопасоответство­вали структуре полноразмерного Fas, аостаток изолейцина между остатками лизинаи гистидина может считаться гомологичнойзаменой остатку аланина в структурепредпола­гаемого эпитопа для антителаSA8.

Надо отметить, чтоструктуры консенсусных мимотопов для МА SA-7и SA-8 сходны между собой, поэтому мыопределяли константы аффинности всехотобранных фагов по отношению к МА, накоторых проводили селекцию. Для фагов,специфичных к антителу SA-8, не былообнаружено прямой корреляционнойзависимости между числом а.о. в мимотопнойпоследовательности, совпадающих соструктурой предполагаемого эпитопа, изначением константы аффинности (табл. 6). Вто же время для фагов, специ­фичных к антителу SA-7,было показано, что константы аффинностифаговых частиц, в составе которых былипредставлены пептиды ХKХХFFХ (3 совпадающихостатка из 7), были одними из самых высоких– 7.0х107 M-1. Для фагов,экспонирующих мимотопнуюпоследовательность СKХХFFХ(четыре совпадающих аминокислотныхостатка из семи), определили самую высокуюконстанту аффинности–1.7х108 М-1. Видимо, остатокцис­теинаочень важен для взаимодействия антитела SA-7с Fas, поэтому в предполагаемый эпитоп,узнаваемый МА SA-7, мы включили остатокцистеина. Таким образом, мы пред­положили, что эпитопдля МА SA-7 определяется а.о. 129—134 экстраклеточнойчасти Fas.

Были синтезированыгексапептиды: пептид №1, соответствующийпредполагаемому эпитопу для антитела SA-8— 94-99: KAHFSS, ипептид №2, соответствующий предпола­гаемому эпитопу дляантитела SA-7 —129-134: CKPNFF. Дляподтверждения структуры эпитопов,узнаваемых антителами, были проведеныэксперименты по конкурентномуингибированию синтетическими пептидами №1и №2 взаимодействия антител SA-7 и SA8 с полноразмерным Fas(рис. 3).

Из рисунка 3 видно, чтопептид №1, соответствующийпредполагаемому эпитопу для МА SA-8,предпочтительно ингибируетвзаимодействие антитела SA-8 сполноразмерным Fas, а на взаимодействие МАSA-7 с Fas значительного влияния не оказывает.В то же время пептид №2, соответствующийпредполагаемому эпитопу для МА SA-7,предпочти­тельно ингибирует взаимодействиеантитела SA-7 с полноразмерным Fas. Отсюда мысделали заключение, что пептид №1специфичен к антителу SA-8, а пептид №2специфи­чен кантителу SA-7.

Таким образом, былаопределена структура эпитопов для МА SA-7 иSA-8 против полноразмерного человеческогоFas. Эпитоп дляантитела SA-7 определяют а.о. Fas 129134 — CKPNFF, а для антителаSA8  – а.о. Fas 94 – 99 — KAHFSS.

Рис. 3. Конкурентное ингибированиевзаимодействия антител SA-7 и SA-8 с Fasпептидами №1 и №2

Изоформы sFas являютсярезультатом альтернативного сплайсингаполноразмерной мРНК Fas, состоящей из 9экзонов. Идентифицировано нескольковариантов сплайсиро­ванной мРНК Fas с делециями различныхэкзонов, при этом основной изоформойрастворимого Fas является FasExo6Del, в которойделетирован только трансмембранный домен,ее экспрессия на несколько порядковпревышает суммарную экспрессию остальныхминорных изоформ (Cascino I. и соавт., 1995, 1996). Всеизоформы sFas содержат а.о., соответствующиепервому и второму экзо­нам полноразмерноготранскрипта fas.Эпитоп для МА SA-8 определяют а.о. 94-99,коди­руемыенуклеотидами второго экзона fas, т.о. МА SA-8взаимодействует со всеми изоформами sFas.Делеция третьего экзона происходит привырезании из полноразмерной мРНК Fasнуклеотидов 391-529, т.е. удаляются а.о.131200первичной аминокислотнойпоследовательности полноразмерного Fas.Эпитоп для антитела SA-7 определяют а.о.129134полноразмерного Fas, кодируемыенуклеотидами, находящимися на границевто­рого итретьего экзонов fas, поэтому МА SA-7 не способновзаимодействовать с изофор­мами sFas с делециейа.о., соответствующих третьемуэкзону.

Таким образом,сэндвич-ИФА на основе антител SA-7 и SA-8должен детектировать основную изоформу sFas- FasExo6Del и триминорных изоформы: FasExo4Del; FasExo4,6Del; иFasExo4,7Del.

sFas, IL-6, VEGF в сывороткекрови и содержание рецепторов эстрогенов вопухолях при новообразованиях молочнойжелезы

Нами проведеноопределение концентрации sFas и IL-6 всыворотке крови 119 больных РМЖ и у 22 больныхДОМЖ в сравнении с соответствующимипоказателями 55 практически здоровыхженщин. Результаты данного исследованияпоказаны в таблице 7.

Таблица 7. Показатели sFas и IL-6 в сыворотке кровибольных новообразованиями молочной железыи практически здоровых людей

Категорииобследованных

Количество пациентов

sFas,нг/мл

IL-6,пг/мл

M±m,
медиана

Пределыколебаний

M±m,
медиана

Пределыколебаний

Контроль

55

0.8±0.1
0.81

0.3-1.2

1.0±0.1
0.94

1.0-2.0

РМЖ

119

1.9±0.1
1.72

0.4-5.8

1.8±0.1
1.65

0.1-9.7

ДОМЖ

22

1.7±0.3
1.23

0.4-2.4

2.0±0.3
1.96

0.7-3.2

Примечание: р2vs1=0.0004; р3vs1=0.001; р3vs2>0.05; р5vs4=0.01,р6vs4=0.02.

Частота выявления sFas всыворотке крови у больных РМЖ и ДОМЖ (59% и 73%,соответственно) была достоверно выше, чем упрактически здоровых женщин (37%).Концентрация sFas в сыворотке крови больныхбыла достоверно выше, чем в контрольнойгруппе, при этом не было выявленодостоверных различий в показателях sFasмежду боль­ными РМЖ и ДОМЖ. Частота выявленияIL-6 у практически здоровых женщин составила73%, а в группах больных ДОМЖ и РМЖ IL-6 былвыявлен у всех пациенток. Медианыконцен­трацииIL-6 достоверно не различались междуболь­ными РМЖи ДОМЖ, но при этом достоверно превышалисоответствующий показатель группыконтроля. Уровни sFas и IL-6 в сыворотке кровидостоверно не зависели от возраста больныхРМЖ (r=-0.05) и больных ДОМЖ (r=0.19), однако былавыявлена отрицательная корреляционнаясвязь между концентрацией sFas ивозрас­том вгруппе больных папилломой (r=-0.85).

У 119 больных первичнымРМЖ определяли концентрацию sFas, IL-6 и VEGF всыворотке крови, а также содержание РЭ вткани опухоли и проводили анализопределяемых показателей в зависимости отосновных клинико-морфо­логическихкритериев заболевания. В нашемисследовании рецептороположительными (РЭ+)мы считали опухоли, в которых содержание РЭбыло 10 и более фмоль на 1 мг общего белкацитозольной фракции (фмоль/мг белка).Опухоли, содержащие РЭ в коли­честве ниже 10фмоль/мг белка, считалирецепторотрицательными (РЭ-). Из 119первич­ныхопухолей при РМЖ в 102 случаях уровень РЭ былвыше нуля (86%), однако РЭ+-опухолей быловсего 67 (56%). Результаты проведенныхисследований представлены в таблице8.

Содержание РЭ впервичных опухолях изменялось в широкихпределах, при этом не выявиликорреляционной связи уровня РЭ в опухоли свозрастом больных (r=0.20).

Показатели sFas, VEGF и IL-6 всыворотке крови больных РМЖ былидостоверно выше, чем в группе контроля(р<0.001), при этом не выявлено зависимостипоказателей sFas, IL-6 и VEGF от возраста ни вконтрольной группе, ни в группе больныхРМЖ.

Таблица 8. Показатели sFas, IL-6 и VEGF в сывороткекрови и гормональной чувствительностиопухоли при раке молочной железы

Исследуемые показатели

Практически здоровые люди

Ракмолочной железы

Частота выявления,%

Диапазонколебаний

M±m, медиана

Частота выявления,%

Диапазонколебаний

M±m, медиана

РЭ, фмоль/мг

-

-

-

56

10.1–382.5

73.9±8.6;
46.9

sFas,нг/мл

47

0.3 – 1.2

0.8±0.1;
0.8

59

0.5-2.6

1.9±0.1;
1.7

IL6, пг/мл

73

0.2 – 2.0

1.0±0.1;
0.9

100

0.6-2.9

1.8±0.1;
1.6

VEGF,пг/мл

100

15.0-315.0

179.0±13.4
154.0

100

35.6–1090.0

312.8±27.2;
263.9

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»