WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 13 |

Концентрация sFas, нг/мл

Коэффициентвариации, %

1

2.67,2.75, 2.60, 2.59, 2.73, 2.65

2.5

2

5.45,5.39, 5.55, 5.59, 5.48, 5.62

1.6

3

0.76,0.85, 0.70, 0.81, 0.74, 0.77

6.9

4

3.59,3.48, 3.75, 3.55, 3.67, 3.64

2.6

5

8.40,8.90, 8.65, 8.56, 8.73, 8.57

2.0

6

1.78,1.83, 1.64, 1.75, 1.68, 1.67

4.2

7

0.53,0.64, 0.59, 0.58, 0.61, 0.57

6.3

8

3.67,3.75, 3.53, 3.58, 3.64, 3.52

2.5

Средний коэффициент вариации (M±m),%

3.7±0.7

Коэффициент вариацииизменялся от 1.6% до 6.9% и в среднем составил3.7%. Полученные данные свидетельствуют охорошей воспроизводи­мости результатов измеренияконцентрации sFas в данном виде теста(intra-assay). Коэф­фициент вариации был выше принизкой концентрации sFas в сыворотке крови,что объясняется бльшим вкладом ошибки метода(разброс значений оптической плотности,краевые эффекты) вблизи значенияминимального предела детекциитест-системы.

Таблица 3. Результаты определения уровня sFas внезависимых экспериментах

Образецсыворотки

Эксперимент№1

Эксперимент№2

Эксперимент№3

Коэффициентвариации, %

1

2.67

2.80

2.50

5.6

2

5.51

5.30

5.45

2.0

3

0.77

0.67

0.73

6.9

4

3.61

3.70

3.55

2.1

5

8.64

8.80

8.54

1.5

6

1.73

1.68

1.65

2.4

7

0.59

0.55

0.63

6.8

8

3.62

3.54

3.58

1.1

Средний коэффициент вариации (M±m),%

3.6±0.8

Проводили сравнениерезультатов определения концентрации sFas всыворотке и плазме крови онкологическихпациентов с использованием сэндвич-ИФА наоснове МА SA-7 и SA-8.

Таблица 4. Сравнительные результатыопределения концентрации sFas в сыворотке иплазме крови онкологических больных всэндвич-ИФА на основе МА SA-7 и SA-8

Типобразца

Концентрация sFas, нг/мл

Коэффициентвариации, %

Сыворотка

4.28

4.30±0.06

1.3

EDTA-плазма

4.36

Гепарин-плазма

4.25

Из данных таблицы 4видно, что разработанный нами сэндвич-ИФАдает близкие результаты определенияконцентрации sFas как в сыворотке, так и вплазме крови человека, при этом методприготовления плазмы не влияет нарезультаты определения концентрации.

Определяли, насколькополно разработанный нами сэндвич-ИФАвыявляет sFas в сыворотке крови, для этого всыворотку, в которой первоначально не былвыявлен sFas, вносили различные количества Fasи определяли его концентрацию, затемсравнивали определяемый показательконцентрации Fas в сыворотке с ожидаемойвеличиной. Результаты данныхэкспериментов отражены в таблице 5.

Таблица 5. Сравнительные результаты выявленияпривнесенного в сыворотку крови Fas

Концентрация добавленного Fas,нг/мл

%выявления добавленного Fas

9.0

86,98, 93

6.0

88,105, 99

3.0

87,118, 113

1.5

102,112, 95

0.8

105,95, 98

Средний % выявления Fas

99.6

Из данных таблицы 5видно, что присутствующие в сывороткекрови компоненты не влияют на выявление sFasc помощью разработанной намитест-сис­темы.

Определение структурыэпитопов, узнаваемых МА SA-7 и SA-8, с помощьюпептидного фагового дисплея

Растворимый Fas являетсяпродуктом альтернативного сплайсинга мРНКFas. В литературе описано несколько изоформsFas и показано их количественноесоотношение на уровне экспрессии мРНК: Fas FasExo6Del >>>FasExo3,4,6Del > FasExo4Del FasExo4,6Del FasExo4,7Del FasExo3,4Del. Также идентифицированыизоформы FasExo3Del и FasExo8Del (Cascino I. и соавт., 1995,1996).

Поскольку МА SA-7 и SA-8взаимодействуют с денатурированным Fas виммуно­блоттинге, то мы предположили, чтоэпитопы Fas, узнаваемые каждым из этихантител, являются не конформационными, алинейными. Поэтому для локализацииминимальных эпитопов, с которымивзаимодействуют антитела, мы выбралипептидную фаговую библио­теку PH.D.7ТМ (New England BioLab) спредставленностью около 2х109 возможныхвари­антовгептапептидов и проводили четыре раундааффин­нойселекции фаговых частиц из даннойбиблиотеки. После клонирования былиотобраны фаги, взаимодействующие с МА SA-7 иSA-8, которые использовали дляиммунохимического анализа и определенияcтруктуры аминокислотнойпоследователь­ности пептидов, представленныхданными фагами. Первичная структурапептидов, экспо­нированных фагами, показана втаблице 6.

Таблица 6. Структура пептидов,экспонированных фагами библиотекиPH.D.-7ТМ,взаимодействующими с МА SA-7 и SA8 противполноразмерного человеческого Fas

Название
клона

Структура пептида в составефага

Кa, М-1

Название
клона

Структура пептида в составефага

Кa, М-1

SA-8/III-1


A

K

I

H

F

Y

S


3.9x106

SA-7/IV-1


G

K

I

H

F

F

R

7.0x107

SA-8/III-2


D

K

I

H

F

K

S


5.6x106

SA-7/IV-2

G

Y

K

P

T

F

S


1.1x107

SA-8/III-3

V

N

K

P

H

F

H



7.0x106

SA-7/IV-3

G

Y

K

P

T

F

S


1.1x107

SA-8/V-1


A

Y

I

H

F

L

P


1.4x107

SA-7/IV-4


S

K

I

H

F

H

P

8.0x106

SA-8/IV-2


S

E

I

H

L

M

G


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»