WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 13 |

Проводили определениеконцентрации sFas и общей активностищелочной фосфатазы у 99 больногоновообразованиями костей (61 мужчина и 38жен­щин) ввозрасте от 14 до 59 лет. Определение концентрации VEGFпроводили только у больных остеогеннойсаркомой и опухолью Юинга. Новообразованиякостей были представлены следующиминозологическими едини­цами: первичнаяостеогенная саркома (32), вторичнаяостеогенная саркома (1), паростальнаяостеогенная саркома (1), периостальнаяостеогенная саркома (1), первич­ная хондросаркома(17), вторичная хондросаркома (1), опухольЮинга (10), злокачественная фибрознаягистиоцитома кости (9), гигантоклеточнаяопухоль кости (10), плазмоцитома (1),гемангиоэндотелиома (1),гемангиоперицитома (1), хордома (3), липомакости (1), доброкачественная ос­теобластома (2),хондробластома (3), хондрома (1),костно-хрящевой экзостоз (2), анев­ризмальная костнаякиста (2).

В группе больныхновообразованиями яичников было 141 больнаязлокачествен­ными новообразованиями в возрастеот 24 до 80 лет и 206 пациенток с добро­качественныминовообразованиями в возрасте от 18 до 69 лет,которые прошли обследование и лечение в ГУРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН в период с января2000 по март 2006 г.г. В группе больных ДОЯ былипредставлены следующие морфологическиеварианты опухоли: дермоид (24), киста желтоготела (20), фолликулярная киста (14),цистаденома (56), цистаденофиброма (6),простая киста (4), папиллярная цистаденома(10), опухоль Бреннера (8), пограничнаяопухоль (18), муцинозная пограничная опухоль(4), эндомет­риоидная киста (24), муцинозная киста(6), фиброма (8). В общей группе больных РЯбыли следующие нозологические единицы:папилляр­наяцистаденокарцинома (22), серознаяцистаденокарцинома (53), эндометриоиднаяаде­нокарцинома (27), муцинознаяаденокарцинома (26), аденогенный рак (3),серозный рак (10).

В исследование быливключены 111 больных раком тела матки (РТМ) ввозрасте от 31 до 80 лет. Гистологическоеисследование выявило следующиеморфологические варианты строенияопухолей у больных РТМ: аденокарцинома (102),железисто-плоскоклеточный рак (7),светлоклеточный рак (2). Больные находилисьв разных стадиях опухолевого про­цесса, большинство(62.8%) из них было в 1 и 2 стадии.

В исследование быливключены 113 больных колоректальным раком,из них 57 муж­чин и 56 женщин в возрасте от 35 до 72лет.

В общую группу больныхбыли включены 141 пациент с различнымипатологиями щитовидной железы, из них 127женщин и 14 мужчин, в возрасте от 17 до 73,которые находились на обследовании илечении в отделении опухолей верхнихдыхательно-пищеварительных путей ГУ РОНЦим. Н.Н. Блохина РАМН г.Москвы за период сдекабря 1998 по январь 2002 года.Новообразования щитовидной железы былипредставлены следующими морфологи­ческими типамиопухолей: 1) рак щитовидной железы – 32; 2) аденомащитовидной железы – 16; 3) узловой коллоидныймикро-макрофолликулярный зоб с признакамиадено­матоза– 20; 4) узловойколлоидный микро-макрофолликулярный зоббез признаков аде­номатоза – 48; 5) диффузный токсический зоб спризнаками аденоматоза – 9; 6) диффуз­ный токсический зоббез признаков аденоматоза – 14; 7) аутоиммунныйтиореоидит Хошимото – 2.

В общей группепациентов было 109 больных опухоляминадпочечников, из них 59 мужчин и 50 женщин, ввозрасте от 45 до 75 лет. Гистологическоеисследование выявило следующиенозологические единицы: рак корынадпочечника – 32, аденома коры надпочечника – 52,адренокортикальная опухоль снеопределенным потенциаломзлокачественности – 6, феохромоцитома – 18 и миелоли­пома – 1.

Сопутствующаяпатология выявлена более чем у половины (56%)всех больных новообразованиями. Средисопутствующих заболеваний былигипертоническая болезнь, хроническаяишемическая болезнь сердца, стенокардия,миома матки, полип матки, мастопатия,хронический гастрит, хронический колит,хронический пиелонефрит, мочекаменнаяболезнь, сахарный диабет II типа. Сочетаниенескольких хронических заболеваний ванамнезе выявлено у 212 (20%) больных.

Лабораторные методыисследования

Определениеконцентрации sFas в сыворотке крови. МА против Fas SA-8 (IgG1 (); (4.0±0.6)x107 М-1) сорбировали наИФА-планшеты (“Linbro”) в 0,05 М карбонатномбуфере (рН 9.6) в концентрации 5 мкг/мл втечение ночи при 4оС. Для блокирования остаточныхсвободных центров связывания планшетыинку­бировалис 1% раствором БСА в фосфатно-солевом буфере(РВS) (рН 7.2) 1 час при 37оС. Затем в планшеты вносилисыворотки больных и практически здоровыхлюдей, которые хранили при -20оС до анализа. Дляпостроения калибровочного графика вкаждый планшет вносили последовательныедвукратные разведения пол­норазмерногорекомбинантного бакуловирусного Fas от 40нг/мл до 0.1 нг/мл. Планшеты инкубировали 1.5часа при 37оС.После инкубации планшеты промывалираствором РВS, содержащим 0.1% Tween 20 (“Sigma”)(буфер для отмывки). Процедуру отмывкидалее повторяли после каждой стадии теста.После отмывки в планшеты вносилибиотинилированные МА против Fas SA-7 (IgG1();(5.8±0.7)x108М-1) вконцентрации 10 мкг/мл в буфере для отмывки,содержащем 0.1% БСА и инкубировали 2 часа при37оС. Затем впланшеты вносили растворстрептавидин-пероксидазы (“Amersham”) врабо­чемразведении в буфере для отмывки. Планшетыинкубировали 1 час при 37оС. В качествесубстрата использовали свежеприготовленный раствор 0.04% орто-фенилендиамина в 50 мМцитрат-фосфатном буфере (рН 5.0), содержащем0.03% пере­кисиводорода. Планшеты инкубировали 15-20 минутпри комнатной температуре до раз­вития окраски.Реакцию останавливали 10% серной кислотой,оптическую плотность из­меряли при длиневолны 492 нм на спектрофотометре MR 700 MicroplateReader (“Dynatech Labs”, США). Концентрацию sFasопределяли по калибровочному графику,построенному заново для каждогопланшета.

Определение эпитопов,узнаваемых МА SA-7 и SA-8, проводили с помощью биб­лиотекигептапептидов в варианте фагового дисплея– PH.D.7ТМ (BioLabs, Cat. #E8100S) поприлагаемой инструкции.

Синтез пептидов проводили твердофазным методом вручном твердофазном реак­торе (Rodionov I.L. исоавт., 1992) с использованием Fmoc-стратегии(Reid G.E. и Simpson R.J., 1992).

Приготовлениесыворотки крови пациентов и практическиздоровых людей

Кровь у больных ипрактически здоровых людей забиралинатощак из кубитальной вены с 8 до 9 утра.После свертывания крови пробиркицентри­фугировали при 500g втечение 10 минут, сывороткуаккуратно отбирали, разливали попромаркированным пробиркам и хранили при20оС до анализа.

Определениеконцентрации IL-6 в сыворотке крови проводили с помощью имму­ноферментногонабора «human IL-6» компании “R&D”, США поприлагаемой к набору инструкциипроизводителя.

Определениеконцентрации VEGF в сыворотке крови проводили с помощьюиммуноферментного набора “CytElisatm Human VEGF” компании“Cytimmune Science inс.” (США) по прилагаемой к наборуинструкции производителя.

Определениеконцентрации uPA в гомогенизированной тканиопухоли проводили с помощьюиммуноферментного набора реактивов,разработанных в Католическом Университете г.Наймегена в лабораториипроф. Т.Benraad'a (Нидерланды).

Определение рецепторовэстрадиола-17в экстрактах опухоли молочной железы проводилирадиолигандным методом при насыщающихконцентрациях лиганда [2,4,6,7-3H]-эстрадиола-17 (“Amersham Int. PLC”,Англия). Неспецифичное связываниеопреде­лялипри 100-200-кратном молярном избыткедиэтилстильбэстрола. Для разделениясвободных и связанных с рецепторомстероидов пробы после инкубацииобрабатывали суспензией активированногоугля, покрытого декстраном.Радиоактивность образцов определяли наспектрометре “LS 6500” (“Beckman”, США).

Определение общейактивности щелочной фосфатазы в сывороткекрови проводилиоптимизированными методами прииспользовании автоматическогоанализатора «Hitachi 911».

Статистический анализрезультатов исследования

Выбор центральныххарактеристик исследуемых количественныхданных осущест­вляли после изучения формы ихраспределения. Оценку различия формыраспределения от формы распределенияГаусса проводили по критерию согласияКолмогорова-Смир­нова. При логнормальномраспределении проводили математическоепреобразование зна­чений. Рассчитывали среднеезначение показателя и его 95% доверительныеграницы, ошибку среднего, а также медианы(для логнормальных показателей) и пределыколеба­ния.

Рассчитывалиабсолютные и относительные частотыкачественных и ординальных признаков.Оценку различий частот проводилинепараметрическим критерием i-2, для малых выборок– точнымкритерием Фишера. Расчет доверительныхинтервалов для малых долей проводили сучетом биноминального распределения.

Для выяснениядиагностической способности показателейпроводили дискриминантный анализ.Рассчитывали точное значение р. Примножественных сравнениях значения ропределяли с помощью специальных тестов споправкой на множественность сравнений (testScheffe). При корреляционном анализерассчитывали коэффициент корреляцииПирсона, а также значимость его отличия отнуля. Выживаемость рассчитывали по методуКаплана-Майера.

При выборестатистических процедур учитывалиметодологические требованияМеждународного конгресса по гармонизацииGGP “Статистические принципы дляклини­ческихисследований” (ICH Guidelines//Good Clin.Pract.J.-1998.-Vol.5,№4.-р.27-37).

Все вычисленияпроводили с помощью математическихпакетов «Статистика» и SPSS.

Результаты собственныхисследований

Разработка ихарактеристика сэндвич-ИФА дляколичественного определения sFas
в сыворотке крови на основемоноклональных антител

Получениемоноклональных антител противчеловеческого Fas

Для иммунизации брали8-недельных мышей линии BALB/c, в качествеантигена использовали полноразмерный рекомбинантныйбакуловирусный Fas (“Сoultronics”, Франция).Гибридизацию иммунных спленоцитов мыши склетками мышиной линии NSO/1 проводили постандартной методике. Отбор положительныхгибридом проводили методом непрямогоИФА. Одиночные положительныеклоны получали методом лимитирующихразведений.

МА нарабатывали васцитной жидкости мышей линии BALB/c. Выделение МА изасцитной жидкости осуществлялипреципитацией сульфатом аммония ипоследующей жидкостной хроматографиейумеренного давления на колонке MonoQ. Определение типов тяжелых и легкихцепей иммуноглобулинов проводили непрямымИФА с помощью набора для типированияантител (“Amersham”, Великобритания).

Иммунохимическаяхарактеристика полученных антителприведена в таблице 1.

Таблица 1. Иммунохимическая характеристикамоноклональных антител кFas

Антитело

Тип тяжелойи легкой цепи

Константааффинности, М-1

SA-1

IgG2a()

(7.8±1.3)x107

SA-2

IgG1()

(4.1±0.3)x107

SA-3

IgG1()

(6.4±0.5)x107

SA-4

IgG1()

(2.1±0.4)x109

SA-5

IgG1()

(3.8±0.3)x107

SA-6

IgG1()

(3.3±0.2)x107

SA-7

IgG1()

(5.8±0.7)x108

SA-8

IgG1()

(4.0±0.6)x107

SA-9

IgG1()

(6.5±0.5)x107

С целью разработкитест-системы для количественногоопре­делениярастворимого Fas в сыворотке крови былиполучены конъюгаты МА против Fas с биотином.Были проверены все возможные вариантысэндвич-ИФА, наилучшие результатыопределения sFas показала «пара» антител SA-7и SA-8. МА SA-7 и SA-8 выявляли одну мажорнуюполосу, соответствующую молекуляр­ному весуполноразмерного Fas в клеточных экстрактахчеловеческих линий HL-60, MCF7 и Jurkat, и невзаимодействовали с экстрактом клетокмышиной линии L929 в иммуноблоттинге, чтоможет свидетельствовать о видовойспецифичности этих антител.

Проводили определениеминимальной концентрации sFas,детектируемой разрабо­таннойтест-системой, для этого делалипоследовательные двукратные разведенияполно­размерного Fas от 10 до 0.08 нг/мл. Нижнимпределом детекции sFas, определяемымсэндвич-ИФА, считали кон­центрацию Fas,достоверно превышающую фоновое значениеоптической плотности тест-системы плюс тристандартных отклонения. Минимальныйпредел детекции sFas тест-системы на основеМА SA-7 и SA-8, определенный в 6 независимыхэкспериментах, составил 0.3 нг/мл (рис.1).

Рис. 1. Калибровочный график дляопределения концентрации растворимогоFas

В литературе описанонесколько тест-систем для определенияконцентрации sFas в варианте сэндвич-ИФА,нижний предел детекции которых колеблетсяот 2 нг/мл (Tomokuni A. и соавт., 1997) до 0.1 нг/мл(Seishima M. и соавт., 1996), по данному показателюразработанный сэндвич-ИФА не уступаетаналогичным тест-системам.

Показали, чтоприсутствие sFasL в концентрации 10 нг/мл невлияет на результаты количественногоопределения sFas разработанной намитест-системой (рис. 2).

Рис. 2. Определение концентрации sFas вприсутствии sFasL

С целью оценкивоспроизводимости результатовопределения концентрации sFas в сывороткекрови человека с помощью разработанногосэндвич-ИФА проводили определе­ние уровня sFas в 8различных образцах сыворотки в 6параллельных повторах для каж­дого образца впределах одного ИФА-планшета (intra-assay) ирассчитывали коэффициент вариации.Эксперимент повторяли 3 раза в независимыхэкспериментах (inter-assay) и рас­считываликоэффициент вариации для данного теста,учитывая результаты 18 определе­ний для каждогообразца сыворотки. Результаты проведенныхэкспериментов представлены в таблицах 2 и3.

Таблица 2. Результаты определенияконцентрации sFas в сыворотке крови
в пределах одногоИФА-планшета

Образецсыворотки

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»