WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

3-Гидроксипроизводные жирных кислот играют важную роль в процессах адгезии, роста и репродукции клеток дрожжей. Вместе с тем остаются невыясненными как механизмы взаимодействия патогенных грибов с животными тканями, так и возможность трансформации грибных оксилипинов ферментами окисления липидов млекопитающих. Актуальным в этой связи является изучение метаболизма оксилипинов в грибах, продуктов взаимодействия оксилипинов с оксигеназами млекопитающих, оксилипин-ассоциированной трансдукции сигналов в животных клетках с целью выявления механизмов патогенеза болезнетворных грибов.

____________________________________________________________________________

* Эксперименты были выполнены в лаборатории по исследованию эйкозаноидов (рук. Ph.D. С. Нигам) отделения гинекологии университетского медицинского центра им. Бенджамина Франклина Свободного Университета Берлина. Культуры штаммов микроорганизмов дикого типа и мутантных были любезно предоставлены д-ром С. Нигамом.

2.1. Исследование ферментативной трансформации 3-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты (9с) и ее аналогов с использованием липоксигеназ и циклооксигеназы млекопитающих

С целью выяснения возможности участия 3-гидроксикислот в ферментативном каскаде окисления липидов млекопитающих были проведены исследования по окислению 3(R,S)-HETE (9с) и ее метилового эфира очищенными ферментными препаратами липоксигеназ млекопитающих. Были использованы липоксигеназа лейкоцитов свиньи (l(12S)-LOX) и эпидермальная липоксигеназа ((12R)-LOX), полученная генноинженерным методом. Продукты окисления были выделены с помощью экстракции и последующей ВЭЖХ на обращенной фазе. Наличие 3-гидроксигруппы было установлено с применением хромато-масс-спектрометрии. Было обнаружено образование конъюгированного диена, 3,12-DiHETE (41) (рис. 3). Анализ дигидроксикислот с применением ВЭЖХ на хиральной фазе не показал предпочтительного окисления R- или S-энантиомера по С-3 положению жирной кислоты какой-либо из липоксигеназ (рис. 4).

Также были проведены исследования по взаимодействию 3(R)-метокси-ЕТЕ (9б) с овечьей циклооксигеназой COX-2. Продукты окисления были выделены при помощи известного метода (Hamberg et al., 1998) и затем разделены с применением ВЭЖХ на обращенной фазе. Структура полученных продуктов установлена с использованием GC-MS анализа метиловых эфиров их TMS-производных. Соединения были идентифицированы как простагландин 3(R)-метокcи-PGE2 (42) и 3(R)-метокси-11(S)-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (43).

Рис. 3. Аналитическая ВЭЖХ на обращенной фазе продуктов окисления 3(R/S)-HETE под действием l(12S)-LOX (A) (продукт заметилирован перед проведением ВЭЖХ); метилового эфира 3(R/S)-HETE - под действием (12R)-LOX (B) и l(12S)-LOX (C), подвижная фаза MeOH/H2O/AcOH (80:20:0.1% об.)

Рис. 4. ВЭЖХ на хиральной фазе заметилированных образцов 3,12-DiHETE, образованной действием l(12S)-LOX (A), (12R)-LOX (B), подвижная фаза гексан/этанол (10% об. этанола)

Щелочной гидролиз 3(R)-метокcи-PGE2 (42) приводил к продукту его дегидратации/изомеризации – циклопентеноновому простагландину 3(R)-метокcи-PGB2 (44), который легко детектировался при 278 нм (рис.5). Структура PGB2 подтверждена данными масс-спектра его TMS-производного.

Рис. 5. Аналитическая ВЭЖХ на обращенной фазе продуктов окисления 3(R)-метокси-ЕТЕ () (100 мкМ) под действием СОХ-2 млекопитающих (20 мкг), подвижная фаза CH3CN/H2O/AcOH (85:15:0.05 % об.)

Проведенные исследования показали, что 3-гидроксиполиеновые кислоты и их аналоги могут служить субстратами для ферментов окисления липидов млекопитающих – липоксигеназ и циклооксигеназ. При окислении 3-гидроксипроизводных жирных кислот образуются метаболиты, аналогичные оксигенированной АК, за исключением наличия 3-гидроксигруппы, что, вероятно, делает их узнаваемыми для клеток грибов. Таким образом, можно заключить, что 3-НЕТЕ и ее аналоги являются миметиками арахидоновой кислоты в процессах вторичного окисления. Вследствие доступности генноинженерных ферментов энзиматический синтез 3-гидроксиэйкозаноидов открывает перспективы для изучения потенциальной биологической активности данных соединений в стимуляции клеток млекопитающих в ответ на инфекционное поражение.

2.2. Исследование метаболизма 3(R/S)-НЕТЕ (9с) и 18(R/S)-НЕТЕ (26) в клетках дрожжей Dipodascopsis uninucleata и Candida albicans

Для выяснения путей метаболизма 3-гидроксиэйкозаноидов в клетках грибов было проведено исследование деградации рацемической 3(R,S)-НЕТЕ (9с) дрожжами Dipodascopsis uninucleata (UOFS Y 128). Клетки на репродуктивной стадии развития инкубировали с субстратом 3(R,S)-НЕТЕ, после чего определяли степень превращения R- и S-энантиомеров. Остаток 3(R,S)-НЕТЕ был выделен из супернатанта при помощи стандартных процедур с применением ВЭЖХ на обращенной фазе, и энантиомерный состав проанализирован с использованием ВЭЖХ на хиральной фазе. Результаты ВЭЖХ показали (рис.6), что преимущественному метаболизму в дрожжах Dipodascopsis uninucleata подвергается изомер 3(R)-HETE, в то время как 3(S)-HETE практически не расходуется.

Следующим этапом работы явилось изучение продуктов окисления АК и ее производных - 3(R,S)-НЕТЕ (9с), 18(R,S)-НЕТЕ (26) - в клетках Dipodascopsis uninucleata или Candida albicans 1386 (бронхоизолят), которые были инкубированы с жирнокислотными субстратами. Ранее 3,18-DiHETE была обнаружена на стадии развития гиф в дрожжах Candida albicans как продукт трансформации экзогенной АК (Deva et al., 2000).Нами были

Рис. 6. Деградация 3(R/S)-HETE (9с) культурой клеток дрожжей Dipodascopsis uninucleata. ВЭЖХ на хиральной фазе (Chiral Pack AD) (CH3CN/H2O/H3PO4 95:5:0.1 % об.). Соотношение энантиомеров 3(S)/3(R) в %: после 6 ч 71/29; после 12 ч 78/22; после 24 ч 91/9.

проведены исследования на предмет обнаружения данного метаболита в разных типах дрожжей при добавлении 3-НЕТЕ в питательную среду. Продукты метаболизма дрожжей были выделены при помощи модифицированного (применением этилацетата в качестве растворителя для экстракции) метода (Bligh et al., 1959) с последующей хроматографией на обращенной фазе и препаративной тонкослойной хроматографией полярных компонентов на силикагеле. TMS-производные метиловых эфиров продуктов окисления были проанализированы с применением GC-MS на наличие 3-гидроксиэйкозаноидов. Результаты анализа ионных фрагментов позволили идентифицировать 3,18-DiHETE, 3,18,20-TriHETE (полученные в результате трансформации АК, 3-НЕТЕ и 3,18-DiHETE) как в дрожжах Candida albicans (А), так и в Dipodascopsis uninucleata (В) (рис.7). На наличие 3-гидроксиметаболитов были тестированы как клеточный лизат, так и супернатант; 3-оксилипины были обнаружены в каждой фракции. Важным представляется тот факт, что Di- и Tri-HETE экскретируются в межклеточное пространство и, по-видимому, участвуют в передаче клеточных сигналов.

Рис.7. Продукты метаболизма АК, 3-НЕТЕ, 18-НЕТЕ в клетках дрожжей.

При сравнении масс-спектров 3,18-DiHETE, полученной микробиологическим синтезом, со спектром химически синтезированного стандарта 3,18-DiHETE (29) установлена их полная идентичность. В результате проведенных экспериментов можно сделать вывод о том, что (-3)-гидроксилирование полиненасыщенных кислот является общим процессом для указанных типов дрожжей.

С целью определения скорости метаболизма жирнокислотных субстратов дрожжами Candida albicans оксиметрическим методом (электрод Кларка) была исследована кинетика общего поглощения кислорода клетками условно-патогенного штамма дикого типа 1386 в присутствии субстратов: АК, 3(R/S)-НЕТЕ (9с), 18(R/S)-НЕТЕ (26) в диапазоне концентраций от 5 до 20 мкМ.

Рис. 8. Кинетические кривые зависимости скорости поглощения О2 клетками Candida albicans от концентрации жирнокислотных субстратов. Условия: 0,1 М фосфатный буфер, предварительно насыщенный О2. Значения Km и Vmax рассчитаны по уравнению Лайнуивера-Берка (1/[S] от 1/V), исходя из результатов 4 экспериментов.

Оказалось, что условные величины Кm для АК и 3(R/S)-НЕТЕ были одного порядка, тогда как для 18(R/S)-НЕТЕ условное значение Кm было в два раза выше, а скорость поглощения кислорода ниже (рис. 8). Можно предположить, что АК и 3(R/S)-НЕТЕ являются более предпочтительными субстратами для клеток гриба Candida albicans, чем 18(R/S)-НЕТЕ, и в первую очередь подвергаются клеточному метаболизму.

2.3. Изучение влияния 3-гидроксилипинов на передачу сигналов в клетках млекопитающих с применением известных репортерных систем*

Следующим этапом биологических исследований было изучение влияния 3(R/S)-НЕТЕ (9с) и 3(R)-HETE () на трансдукцию сигналов в клетках человека. Известно, что _____________________________________________________________________________________* Плазмиды, содержащие конструкцию промотора гена СОХ-2, лигированного с геном люциферазы, и другие векторы, клонированные в E.coli, были любезно предоставлены научным сотрудником лаборатории по исследованию эйкозаноидов Свободного Университета Берлина Р. Shankaranarayanan.

циклооксигеназы (COX-1, COX-2) катализируют ключевые реакции биосинтеза простаноидов. Внешние физиологически различные клеточные стимулы, такие как факторы роста, цитокины, регулируют уровень экспрессии генов cox-1 и cox-2. Повышение уровня экспрессии гена индуцибельной COX-2 сопровождает множество патологических и онкологических процессов: ревматоидный артрит, опухоли желудка, кишечника, молочной железы. С целью определения возможности модуляции активности гена cox-2 с помощью 3-гидроксилипинов было исследовано изменение уровня его экспрессии как под воздействием дрожжей Candida albicans, питавшихся субстратом АК, так и в присутствии индивидуальной 3-НЕТЕ в среде инкубации. В качестве экспериментального животного объекта была выбрана культура клеток человека эпителоидной карциномы матки – HeLa клетки, которая в комбинации с C. albicans является моделью вульвовагинального кандидоза.

HeLa клетки подвергали временной трансфекции: 1) репортерным вектором, содержащим конструкцию функциональной области гена cox-2, лигированного с геном люциферазы (prСОХ-2-pLUC), 2) либо аналогичной плазмидой, содержащую функциональную область гена транскрипционного фактора NF-B (prNF-B-pLUC).

Рис. 9. Контроль - нетрансфицированные HeLa клетки. Мутанты cav2, cav3 (кратность инфекции =5) инкубировали с трансфицированными 1.5 мкг плазмиды -327/+59 prСОХ-2-pLUC HeLa клетками 5-6 ч при 37оС. Внутриклеточную среду анализировали по активности люциферазы-luc/субстрат (Promega) (относительные световые единицы).

Дополнительно применяли D/N плазмиды, содержащие нарушенные функциональные области генов: а) изоформы ядерного рецептора PPAR (PPAR D/N), б) IB киназы IKK-киназного белкового комплекса, ответственного за фосфорилирование процессингового протеина NF-B-зависимого сигнального пути (IKK D/N). Трансфицированные HeLa клетки были заражены C. albicans (ослабленные мутанты cav2 и cav3, питавшиеся АК) или обработаны 3(R/S)-НЕТЕ (9с), либо 3(R)-НЕТЕ (), затем внутриклеточная жидкость была исследована на люциферазную активность (счетчик-сцинтиллятор). Результаты эксперимента показали, что мутанты Candida albicans, питавшиеся АК, селективно повышали уровень экспрессии гена cox-2 в HeLa клетках (рис.9). Было выявлено, что 3(R,S)-HETE (9с), добавленная в инкубационную среду вместо инфекции, повышала уровень экспрессии гена cox-2 в дозозависимой манере (рис.10), как и было установлено ранее для АК. Аналогичный эксперимент с применением препарата оптически активного изомера 3(R)-HETE () не показал изменений в уровне экспрессии гена cox-2. Опираясь на эти данные, можно сделать вывод о том, что энантиомер 3(R)-HETE () не влияет на уровень экспрессии гена cox-2 в клетках млекопитающих.

Рис. 10. Контроль - HeLa клетки, трансфицированные пустым люциферазным вектором pGL3. 3(R/S)-HETE в кнцентрациях 1, 5, 10 мкМ инкубировали с трансфицированными 1.5 мкг плазмиды-327/+59 prСОХ-2-pLUC HeLa клетками 2 ч при 37оС. Внутриклеточную среду анализировали по активности люциферазы - luc/субстрат (относительные световые единицы).

Каскад окисления полиненасыщенных жирных кислот вовлечен в такой важный физиологический ответ организма, как развитие воспаления. Семейство ядерных рецепторов, в которое входит PPAR (рецепторы, активируемые веществами, вызывающими пролиферацию пероксисом), является связующим звеном между регуляцией транскрипции некоторых генов, клеточными ответами и производными жирных кислот. PPAR – одна из изоформ ядерного рецептора PPAR. Поэтому представлялось интересным изучение влияния оксилипинов на PPAR-ассоциированный путь клеточных сигналов в СОХ-2-зависимом ответе HeLa клеток, инфицированных ослабленной Candida albicans. Результаты экспериментов по котрансфекции HeLa клеток плазмидой prСОХ-2-pLUC и плазмидой PPAR D/N показали, что ядерный рецептор PPAR участвует в СОХ-2-зависимых сигналах трансдукции, вызываемых мутантом дрожжей Candida albicans cav2, питавшимся АК. Инфекция не повышала уровня экспрессии СОХ-2 в присутствии плазмиды PPAR D/N (рис.11).

В данной работе проводились исследования по изучению влияния 3-гидроксилипинов на сигнальные внутриклеточные механизмы, ассоциированные с действием фактора NF-B. Последний представляет собой редокс-чувствительный гетеродимерный транскрипционный фактор, связанный с пролиферацией, апоптозом, воспалением, иммунным, стрессовым ответом и другими регулируемыми процессами клеток млекопитающих.

Рис. 11. Контроль - нетрансфицированные HeLa клетки; HeLa клетки, трансфицированные пустым вектором pGL3. Мутант cav2 (кратность инфекции =5) преинкубировали с трансфицированными 1.5 мкг плазмиды -327/+59 prСОХ-2-pLUC и 1.5 мкг плазмиды PPAR D/N HeLa клетками 2 ч при 37оС. Внутриклеточную среду анализировали по активности люциферазы - luc/субстрат (относительные световые единицы).

Эксперименты по котрансфекции HeLa клеток люциферазным вектором (prNF-kB-pLUC) и плазмидой IKK D/N показали, что 3(R/S)-НЕТЕ (9с) влияет на регуляцию экспрессии гена транскрипционного фактора NF-B. В то же время данное производное жирной кислоты не повышало уровня экспрессии гена nf-b в присутствии плазмиды IKK D/N (рис.12).

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»