WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Гроза Наталья Викторовна

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ОКСИЛИПИНОВ

ГРИБНОЙ И РАСТИТЕЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

02.00.10 Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва-2007

Работа выполнена на кафедре Химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в лаборатории по исследованию эйкозаноидов отделения гинекологии университетского медицинского центра им. Бенджамина Франклина Свободного Университета (Берлин, Германия)

Научный руководитель доктор химических наук,

профессор

Мягкова Галина Ивановна

Официальные оппоненты доктор химических наук,

ведущий научный сотрудник

Степанов Александр Евгеньевич

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

Терёшина Вера Михайловна

Ведущая организация НИИ Физико-химической биологии им.

А.Н. Белозерского Московского

государственного университета им.

М.В. Ломоносова

Защита состоится «_24_» _декабря__2007 г. в _15_ часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru

Автореферат разослан «___» ноября 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат химических наук,

старший научный сотрудник Лютик А.И.

Общая характеристика работы*

Актуальность проблемы. Микозы сопровождают человеческую цивилизацию не одно тысячелетие. Возбудителями микозов являются микроскопические грибы, одноклеточные или многоклеточные эукариоты – хемоорганогетеротрофы по способу питания. В настоящее время наблюдается значительный рост заболеваемости микозами из-за миграции населения и изменения образа жизни в индустриальных странах. Особенно ощутим вред микозов в трансплантологии, онкогематологии, неонаталогии, а наиболее распространенные возбудители микозов, такие как дрожжи Candida spp., уверенно вытесняют с лидирующих позиций внутрибольничных бактериальных возбудителей. Микозы лидируют в структуре СПИД-ассоциированных патологий, поражая организм, лишенный иммунной защиты. Для разработки эффективных подходов к терапии и диагностике микологических инфекций актуальным является фундаментальное изучение метаболических и сигнальных процессов, определяющих вирулентные свойства, механизмы развития и патогенеза болезнетворных грибов.

В последнее время интенсивно исследуется липидный метаболизм грибов с целью выявления потенциальных клеточных мишеней, знания о которых могут открыть перспективы создания новых фунгицидных или фунгистатических препаратов. Особенное внимание привлекают оксилипины, представляющие широкое семейство окисленных производных полиненасыщенных жирных кислот и выполняющие регуляторную и сигнальную функции в организме животных, растений и грибов. Среди них гидроксилипины – гидроксипроизводные жирных кислот – наиболее распространены в царстве грибов и играют важную роль в процессах роста и развития этих микроорганизмов (Tsitsigiannis et al., 2007). 3- и 18-Гидроксиполиеновые кислоты были обнаружены как продукты трансформации эндогенных и экзогенных жирных кислот в некоторых видах микроскопических грибов и дрожжей (Mucor genevensis, Dipodascopsis uninucleata, Lipomyces yarrowi, Candida albicans, Gaeumannomyces graminis), показано их участие в росте и морфогенезе грибов, а также в модуляции защитных реакций клеток млекопитающих (Deva et al., 2000). Для изучения процессов окисления липидных компонентов клеточных мембран растений и грибов, а также с целью выяснения механизмов действия биологически активных оксилипинов необходимы препаративные количества образцов этих соединений, что делает актуальным поиск эффективных методов их получения.

Оксилипины, являющиеся производными длинноцепных полиненасыщенных

_______________________

* В руководстве работой принимал участие старший научный сотрудник, кандидат химических наук Иванов И.В.

жирных кислот, достаточно трудно выделить из природных источников в количествах, необходимых для проведения биохимических исследований. Поэтому для изучения механизмов биосинтеза липидных метаболитов в грибах и трансдукции сигналов в животных клетках при микозном поражении актуальной задачей является разработка новых подходов к химическому (в том числе препаративному), ферментативному, микробиологическому синтезу 3-гидрокси- и 18-гидроксипроизводных жирных кислот, их предшественников и изотопно-меченных аналогов.

Настоящая работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках бюджетной темы № 1Б-4-355 «Синтез супрамолекулярных структур на основе порфиринов, липидов и углеводов с целью изучения процессов, протекающих в клетке и создания препаратов для онкологии, генной терапии и других областей медицины», по грантам РФФИ 02-03-33138, 04-03-32454, 05-03-32392, президента РФ по поддержке ведущих научных школ № НШ-2013.2003.3, а также частью работ, выполняемых в плане проекта по исследованию 3-гидроксиполиеновых жирных кислот в лаборатории эйкозаноидов кафедры гинекологии медицинского университетского центра Свободного Университета Берлина (Германия) при поддержке VW-фонда (грант Ni-1/77643).

Цель работы. Цель настоящей работы состояла в синтезе, наработке и изучении биохимических свойств новых и известных 3- и 18-гидроксилипинов природной структуры.

Основными задачами исследования явились:

1) разработка новых методических подходов к химическому и ферментативному синтезу, в том числе препаративному, 3- и 18-гидроксилипинов, их аналогов и меченных тритием производных;

2) изучение метаболизма полученных 3- и 18-гидроксиполиеновых кислот в дрожжах, характеристика профиля образующихся метаболитов и кинетики окисления гидроксикислот;

3) исследование ферментативных превращений синтезированных 3-гидроксилипинов и их аналогов с использованием оксигеназ млекопитающих, определение влияния 3-гидроксикислот на передачу сигналов в животных клетках на моделях хозяин-патоген.

Научная новизна.

- Разработаны новые схемы получения и осуществлен препаративный химический синтез:

а) оптически активных 3-гидроксилипинов: 3(R)-гидрокси-(5Z,8Z,11Z,14Z)-эйкозатетраеновой кислоты (3(R)-НЕТЕ) и ее аналогов, 3(R)-гидрокси-(5Z,8Z)-тетрадекадиеновой кислоты (3(R)-HTDE) на основе полиацетиленовых предшественников с использованием оптически активных исходных синтонов;

б) 18-гидроксипроизводных арахидоновой кислоты: 18-гидрокси-(5Z,8Z,11Z,14Z)-эйкозатетраеновой кислоты (18-НЕТЕ), 3(R),18(R/S)-дигидрокси-(5Z,8Z,11Z,14Z)-эйкозатетраеновой кислоты (3,18-DiHETE) и их аналогов;

в) -гидроксипроизводных линолевой и -линоленовой кислот – 18-гидрокси-(9Z,12Z)-октадекадиеновой кислоты (18-HODE) и 18-гидрокси-(9Z,12Z,15Z)-октадекатриеновой кислоты (18-HOTrE).

- Впервые получены кратно-меченные тритием аналоги 3-НЕТЕ и 3,18-DiHETE.

- Разработан способ ферментативного получения дигидроксипроизводных ПНЖК на примере окисления 3-НЕТЕ соевой 15-LOX. Впервые получена 3(R),15(S)-дигидрокси-(5Z,8Z,11Z,13E)-эйкозатетраеновая кислота (3,15-DiHETE), подобраны условия для ее выделения с применением ВЭЖХ на хиральной фазе.

- Впервые установлено, что дрожжи Dipodascopsis uninucleata и условно-патогенный штамм Candida albicans способны синтезировать ди- и тригидроксиполиеновые продукты из экзогенных моногидроксиполиеновых жирных кислот. Определены кинетические параметры взаимодействия синтезированных жирнокислотных субстратов с клетками дрожжей C. albicans, показано, что 3-НЕТЕ является хорошим субстратом для C. albicans.

- Впервые показано, что 3-НЕТЕ и ее производные подвергаются ферментативной трансформации под действием липоксигеназ и циклооксигеназы млекопитающих с образованием метаболитов, аналогичных продуктам окисления арахидоновой кислоты.

- Установлена принципиальная возможность участия 3-гидроксикислот в трансдукции сигналов при взаимодействии хозяин-патоген, и впервые показано, что 3-НЕТЕ является модулятором клеточных сигналов и миметиком арахидоновой кислоты при взаимодействии с клетками млекопитающих.

Практическая значимость. Практическое значение представляют разработанные универсальные подходы к химическому синтезу ациклических производных природных полиненасыщенных кислот, основанные на ацетиленовой стратегии и позволяющие получать аналоги арахидоновой, линолевой, линоленовой кислот, в том числе радиоактивно-меченные и модифицированные заместителями и функциональными группировками с различной степенью гидрофильности, предназначенные для исследования механизмов биологического действия оксилипинов. Способы химического и ферментативного синтеза оксилипинов, а также методы очистки целевых продуктов, разработанные в ходе выполнения исследования, позволяют нарабатывать индивидуальные образцы этих соединений в количествах, достаточных для проведения биохимических исследований, важных для медицины. Полученные данные по изучению метаболизма и ферментативной трансформации оксилипинов природной структуры могут быть использованы при поиске новых малотоксичных соединений с потенциальной фармакологической активностью.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработка новых путей препаративного химического синтеза природных 3-и 18-гидроксилипинов, а также их аналогов и кратно-меченных тритием производных.

2. Разработка способа ферментативного получения 3,15-дигидроксиэйкозатетраеновой кислоты на примере окисления 3-НЕТЕ при помощи соевой 15-LOX, оптимизация условий выделения DiHETE с применением ВЭЖХ.

3. Изучение метаболизма синтезированных 3- и 18-гидроксилипинов в клетках дрожжей, выделение продуктов и исследование кинетики окисления гидроксикислот.

4. Исследование ферментативной трансформации синтезированных оксилипинов с использованием оксигеназ млекопитающих, выделение и идентификация продуктов оксигенации.

5. Изучение влияния 3-гидроксипроизводных жирных кислот на трансдукцию сигналов в животных клетках с применением известных биологических моделей и репортерных систем.

Публикации. Результаты работы отражены в 12 публикациях, в том числе в 3 статьях в зарубежных журналах, 1 статье в российском журнале и 8 тезисах докладов на международных и российских научных конференциях.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международном симпозиуме «Recent BioMedical Advances in Eicosanoid Research» (Берлин, 2002), на VIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии 2002» (Уфа, 2002), на I Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003), на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), на Международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2004).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на ____ стр. машинописного текста, содержит ____ рисунков, ____ таблиц, ____ схем, состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего ____ ссылок.

Список сокращений. COX – циклооксигеназа;

DiHETE – дигидроксиэйкозатетраеновая кислота;

DMF – диметилформамид;

EET – эпоксиэйкозатетраеновая кислота;

GC-MS – хромато-масс-спектрометрия;

HETE – гидроксиэйкозатетраеновая кислота;

HTDE – гидрокситетрадекадиеновая кислота;

HODE – гидроксиоктадекадиеновая кислота;

HOTrE – гидроксиоктадекатриеновая кислота;

HMPA – гексаметилтриамид фосфорной кислоты;

LOX – липоксигеназа;

PGB2 – простагландин В2 (9-оксо-(15S)-гидрокси-проста-(5Z,8(12),13E)-триен-1-овая кислота);

PGE2 – простагландин E2 (9-оксо-(11,15S)-дигидрокси-проста-(5Z,13E)-диен-1-овая кислота);

THF – тетрагидрофуран;

TMS – триметилсилильный;

TriHETE – тригидроксиэйкозатетраеновая кислота;

prСОХ-2-pLUC - репортерный вектор, содержащий промоторную конструкцию гена cox-2, лигированную с геном люциферазы;

PPAR D/N – плазмида, содержащая точечную мутацию в кодирующей области гена белка PPAR (изоформы рецептора PPAR);

IKK D/N – плазмида, содержащая точечную мутацию в IB киназном домене IKK-белкового комплекса, ответственного за фосфорилирование процессингового протеина, обеспечивающего действие транскрипционного фактора NF-B;

prNF-B-pLUC – репортерный вектор, содержащий промоторный участок гена nf-B транскрипционного фактора NF-B, лигированный с геном люциферазы;

АК (АА) – арахидоновая кислота ((5Z,8Z,11Z,14Z)-эйкозатетраеновая);

ПНЖК – природные полиненасыщенные жирные кислоты.

Результаты работы и их обсуждение

Перспективность изучения влияния жирнокислотных метаболитов на трансдукцию сигналов и формирование ответа в клетке, низкое содержание их в природных источниках, отсутствие высокочистых стандартов, трудности биотехнологического получения, малоэффективность известных способов синтеза оксилипинов и изотопно-меченых аналогов стимулировали проведение исследований в области их химического и ферментативного синтеза. Для исследования механизмов ферментативной трансформации и биологических эффектов оксилипинов в клетках млекопитающих и грибов в качестве субстратов были выбраны жирнокислотные производные грибного происхождения и их аналоги: оптически активные R-энантиомеры – 3(R)-HTDE; 3(R)-НЕТЕ, 3(R),18(R/S)-DiHETE и их кратно-меченные тритием производные, а также 18-НЕТЕ – в качестве инструмента для изучения биосинтеза DiHETE. С целью исследования механизмов защиты высших растений от грибковых и бактериальных патогенов были синтезированы -гидроксильные производные эндогенных полиненасыщенных кислот растительного происхождения: 18-HODE и 18-HOTrE.

1. Синтез 3- и 18-гидроксилипинов, их аналогов и меченных тритием производных

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»