WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 39 таблицами и 14 рисунками, библиографический указатель включает 231 источник, из них 123 отечественных и 108 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения экспериментальных исследований использовали самцов мышей-гибридов линий (CBAC57BL/6)F1 массой 18-20 г (n=420), белых мышей массой 20-22 г (n=650), белых крыс массой 200-240 г (n=390), полученных из питомника «Рапполово» РАМН. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе со свободным доступом к воде при 12 часовом световом дне.

В работе использовали терапевтические дозы алкилирующего препарата циклофосфана (циклофосфамид) и антрациклинового антибиотика доксорубицина (адриамицин) (Машковский М.Д., 2007), пересчитанные на животных (Волчегорский И.А. и др., 2000). Циклофосфан использовали в дозе 200 мг/кг (для мышей) и дозе 100 мг/кг (для крыс), доксорубицин в дозе 6 мг/кг (для мышей) и дозе 10,5 мг/кг (для крыс).

В скрининговые исследования (фитопрепараты применялись перорально) были взяты настои листьев подорожника большого, листьев крапивы двудомной, цветков календулы, травы чабреца, листьев березы, цветков и листьев липы, отвар корней алтея лекарственного (по 10 мл/кг) (Лесиовская Е.Е., Пастушенков Л.В., 2003), экстракты слоевищ цетрарии исландской (57 мг/кг) (Пат. 2203081, 2001) и травы овса посевного (0,5 мг/кг) (Дрожжина Е.В., 2002). Настои сборов из листьев подорожника большого, цветков календулы лекарственной, листьев крапивы двудомной изучались в диапазоне доз от 2,5 до 25 мл/кг и в разных соотношениях.

В качестве препаратов сравнения, терапевтические дозы которых (Машковский М.Д., 2007) пересчитаны на животных (Волчегорский И.А. и др., 2000), использовали антигипоксант триметазидин (12 мг/кг, внутрибрюшинно), иммуномодулятор с антиоксидантным эффектом – глутоксим (12 мг/кг для мышей и 6 мг/кг для крыс, подкожно), адаптоген растительного происхождения – экстракт элеутерококка жидкий (1 мл/кг для мышей, перорально). Кроме них применяли гутимин (50 мг/кг, внутрибрюшинно), используемый в эксперименте в качестве антигипоксанта (Пастушенков Л.В., 1975), и настойку листьев женьшеня «Фолигин» (2 мл/кг, перорально) (Пат. 2195950, 2001).

Экспериментальные модели: определение психофизиологического статуса (для отбора со средней эмоциональной активностью) экспериментальных животных (крыс) проводили в интегрированном тесте "открытое поле" и "норковый рефлекс" (Лесиовская Е.Е., 1989). Антигипоксическое действие изучали на моделях острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) и острой гистотоксической гипоксии (ОГТГ) (Пастушенков Л.В., 1985). Физическую выносливости животных исследовали на модели «плавательного теста» (Петренко Е.Р., 1998), используя различные модификации: первичный «плавательный тест»; повторную физическую нагрузку, которую проводили у крыс через 5 дней после «плавательного теста», оценивая адаптацию животных к ней; «плавательный тест» в условиях психоэмоционального стресса, который вызывали внезапным помещением крыс в воду без предварительной трехдневной тренировки.

Оценку токсикомодифицирующего действия настоя сбора растений проводили по влиянию противоопухолевых препаратов на изменение массы тела и лимфоидных органов (тимус, селезенка) (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000), по аутопсии внутренних органов (патоморфологическая картина) (Арзамасцев Е.В. и др., 2000). Циклофосфан и доксорубицин вводили внутрибрюшинно однократно. Одновременно с препаратами животные получали настой сбора (1:10) из подорожника большого, календулы лекарственной и крапивы двудомной в соотношении 2:2:1, в дозах 5, 10, 25 мл/кг для мышей и дозах 2,5, 5, 10, 25 мл/кг для крыс. Расчет токсических доз ЛД10, ЛД16, ЛД50, и ЛД84 проводили в соответствии с Государственной Фармакопеей XI издания (1987).

Морфологические исследования органов (печень, легкие, сердце, почки, селезенка, тимус, надпочечники, семенники, желудок). Органы фиксировали, делали срезы на микротоме, окрашивали гематоксилин-эозином. Оценку патологических изменений препаратов проводили с помощью микроскопа «Биолам» (увеличение 200, 400) под руководством канд. мед. наук Е.К. Вишневской.

Морфофункциональные изменения тимуса и селезенки оценивали у мышей-гибридов (CBAC57BL/6)F1, которых иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ, 2x106/мышь), и одновременно с введением циклофосфана (200 мг/кг) или доксорубицина (6 мг/кг) (однократно, внутрибрюшинно) они получали (перорально) настой сбора растений (10 мл/кг), который вводили в течение 6 дней. В качестве препарата сравнения использовали глутоксим в дозе 12 мг/кг (Добрица В.П. и др., 2001). На 7 сутки мышей умерщвляли путем дислокации шейных позвонков, извлекали лимфоидные органы, взвешивали их на торсионных весах, массу органа выражали в мг.

Реакцию гемагглютинации (РГА) (Хаитов Р.М. и др., 2000) проводили на мышах-гибридах, у которых на 7 сутки после иммунизации ЭБ забирали кровь, отделяли плазму и проводили РГА в 96-луночном пластиковом планшете.

Количество антителообразующих клеток (АОК/106 спленоцитов) определяли на 5 сутки после иммунизации ЭБ мышей-гибридов линий (CBAC57BL/6)F1 (Jerne N.K. et al., 1974) и введения им циклофосфана (200 мг/кг) или доксорубицина (6 мг/кг) и/или настоя сбора растений (10 мл/кг). Контролем служили мыши, иммунизированные той же дозой эритроцитов барана и получающие воду очищенную перорально.

Реакцию Артюса инициировали у мышей-гибридов (CBAхC57BL/6)F1, которых сенсибилизировали подкожной инъекцией в основание хвоста 0,02 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ, «Sigma») и которым вводили разрешающую дозу ПАФ (тот же объем ПАФ через 2 недели после сенсибилизации) (Медуницин Н.В., 1983). Степень повреждения кожных покровов оценивали ежедневно в течение 14 суток после введения разрешающей дозы ПАФ. Циклофосфан (200 мг/кг) или доксорубицин (6 мг/кг) вводили (внутрибрюшинно, однократно) одновременно с сенсибилизирующей дозой ПАФ. Настой сбора растений (10 мл/кг) мыши получали перорально в течение 14 дней. В качестве препарата сравнения использовали глутоксим (12 мг/кг, в течение 14 дней). Контролем служили мыши, получавшие цитостатики или воду очищенную (интактные).

Исследования состава крови проводили через 24 часа и на 3, 7, 14, 21, 28 сутки после введения цитостатиков с настоем сбора растений (в течение 28 дней). Контролями служили крысы, получавшие цитостатики или интактные.

Подсчет числа эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов в цельной крови проводили методом Культера с помощью гематологического анализатора Abacus Junior Vet (Австрия), используя реагенты фирмы «Реамед» (Россия) (интактные животные) и унифицированным способом (Меньшиков В.В., 1982) (животные с патологией). Лейкоцитарную формулу определяли на мазках периферической крови, окрашенных по Романовскому-Гимза на микроскопе фирмы ЛОМО АУ-12 при увеличении 900.

Оценку проницаемости эритроцитов (Колмаков В.Н., Радченко В.Г., 1982) проводили после однократного внутрибрюшинного введения циклофосфана (100, 200 мг/кг) или доксорубицин (10,5, 12 мг/кг) и настоя сбора растений (2:2:1), который крысы получали перорально в течение 14 дней.

Биохимические исследования крови: определение активности супероксиддисмутазы (Костюк В.А. и др., 1990), каталазы (Beutler E., 1975), концентрации малонового диальдегида (Гончаренко М.С., Летвинова А.М., 1985), сульфгидрильных групп белков (Арутюнян А.В. и др., 2000) проводили через 1 и 24 часа, на 14 и 28 сутки после введения циклофосфана или доксорубицина и настоя сбора растений. Активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, концентрацию гемоглобина, общего белка определяли через 24 часа и на 28 сутки, используя наборы реагентов фирмы «Ольвекс Диагностикум» (Санкт-Петербург).

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывали параметрическим методом с помощью t-критерия Стьюдента, используя программу статистической обработки «BIOSTAT 4.03» для биомедицинских исследований (Гланц C., 1999). Различия считали достоверными при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При выборе растений для скрининга опирались на то, что они должны иметь стабильную сырьевую базу в России, быть официнальными растительными препаратами, имея в качестве экстрагента воду, а также обладать противоопухолевыми и детоксикационными свойствами (Барнаулов О.Д., 2007). Для скрининга использовали модель гипоксии (ОГБГ) и реакцию определения титра специфических антител к ЭБ, которые позволяли оценить фармакологическую активность большого числа фитопрепаратов.

Изучение на модели ОГБГ влияния настоев и экстрактов растений на продолжительность жизни мышей показало, что введение большинства настоев за 60 мин до подъема мышей на высоту 11000 м приводило к удлинению продолжительности жизни мышей. Применение отвара алтея лекарственного удлиняло продолжительность жизни мышей на 2,4 мин, календулы лекарственной – на 5,3 мин, крапивы двудомной – на 2,9 мин, подорожника большого – на 3,6 мин, тимьяна ползучего – на 2,7 мин по сравнению с контролем (мыши, получавшие воду очищенную) (в каждой группе по 10 животных, p<0,05). Применение настоя березы повислой, липы сердцевидной и растворов экстрактов цетрарии исландской (ислацет) и овса посевного не приводило к увеличению продолжительности жизни животных. Исследование влияния настоев растений на РГА показало, что настой календулы лекарственной увеличивал титр антител в 1,6 раз, подорожника большого – в 1,3 раза, крапивы двудомной – в 1,2 раза, а настои березы повислой, тимьяна ползучего, отвар алтея лекарственного и растворы экстрактов цетрарии исландской и овса посевного не оказывали существенного влияния на продукцию специфических антител. Применение цитостатиков, которые усугубляют гипоксию, с подорожником большим (выживаемость мышей в 20-25% случаев), календулы лекарственной (в 20-30% случаев), крапивы двудомной (в 15-20% случаев) существенно удлиняло продолжительность жизни мышей (рис. 1).

Кроме того, известно, что подорожник большой обладает выраженными регенераторным, иммуномодулирующим и противовоспалительным эффектами; календула лекарственная – противовоспалительным, ранозаживляющим, гепатопротекторным, спазмолитическим и др. действием; крапива двудомная – противовоспалительным действием, улучшает обменные процессы в организме, способствует снижению содержания продуктов перекисного окисления липидов, нормализует гемопоэз, увеличивает количество гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов крови (Корсун В.Ф. и др., 2007), что позволило выбрать эти растения для настоя сбора растений.

Рис.1. Влияние циклофосфана (а) и доксорубицина (б) с настоями лекарственных растений на продолжительность жизни мышей при гипоксии.

1 – Контроль (интактные животные); 2 – цитостатик; 3 – цитостатик + настой листьев подорожника; 4 – цитостатик + настой цветков календулы; 5 – цитостатик + настой листьев крапивы; 6 – цитостатик + настой сбора растений (1:1:1); 7 – цитостатик + настой сбора растений (2:2:1); 8 – цитостатик + триметазидин. * – p<0,05 (n=10) по сравнению с интактными животными (негативный контроль); х – то же самое по сравнению с животными, которые получали цитостатик (позитивный контроль).

Оценка антигипоксического эффекта настоя сбора этих растений в дозе 10 мл/кг и соотношении 2:2:1 (соответственно) показала, что он наиболее выражено лимитирует гипоксию (рис. 1) по сравнению с настоем сбора растений в соотношении 1:1:1 (в 2,2 раза) и эффектами компонентов сбора (2 – 4 раза). Полученные данные показывают, что настой сбора, содержащий подорожник большой (2 части), календулу лекарственную (2 части) и крапиву двудомную (1 часть) проявлял выраженную антигипоксическую активность, аналогичную известному антигипоксанту триметазидину.

Токсикомодифицирующее действие разных доз настоя сбора растений (2:2:1) (для крыс – 2,5, 5, 10, 25 мл/кг; для мышей – 5, 10, 25 мл/кг) при применении их с циклофосфаном или доксорубицином показало, что дозы настоя, начиная с 5 мл/кг для крыс или 10 мл/кг для мышей, оказывают одинаковый эффект, предупреждая потерю в массе тела, инволюцию тимуса и селезенки. Введение цитостатика с настоем сбора растений крысам приводит к уменьшению его токсичности, увеличивая ЛД10 и ЛД16 и снижая степень повреждения внутренних органов (табл. 1).

Таблица 1. Оценка токсикомодифицирующего действия настоя сбора растений на эффекты цитостатиков.

Препарат

Летальная доза

Повреждающее действие на ткани органов

Циклофосфан

ЛД10

ЛД16


Печень, почки, эпителий желудка, селезенка.

Доксорубицин

ЛД10

ЛД16


Печень, почки, эпителий желудка, селезенка.

(продолжение таблицы 1)

Циклофосфан +настой сбора растений

ЛД10

ЛД16

Печень, почки, эпителий желудка, селезенка.

Доксорубицин +настой сбора растений

ЛД10

ЛД16


Печень, почки, эпителий желудка, селезенка.

Примечание. – снижение, - увеличение.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»