WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 |

3.3. Изменение метаболизма меди в мозгу крыс с экспериментально индуцированным фибриллогенезом. В этой части работы представлены результаты изучения уровня экспрессии генов медьтранспортных белков у крыс с экспериментально вызванным фибриллогенезом, МДАТ, путем прямого введения в мозг нейротоксического пептида -амилоида (см. раздел «Методы»). В отделах мозга крыс с МДАТ была измерена концентрация меди, железа и цинка. Результаты показали, что концентрация меди в коре, мозжечке и гиппокампе достоверно снижается. Резкое снижение концентрации меди происходит в гипофизе и в гипоталамусе. При этом концентрация железа в отделах мозга практически не меняется. В то же время в сосудистом сплетении многократно увеличивается удельное содержание и меди, и железа. Во всех отделах мозга, исключая миндалевидное тело и сосудистое сплетение, наблюдается значимое снижение концентрации цинка. Изменения концентрации d-элементов в мозгу крыс с МДАТ совпадают с изменениями их концентрации в отделах мозга пациентов с паталогоанатомически подтвержденным диагнозом БА (Andraisi et al., 2000).

Экспрессия генов медьтранспортных белков у крыс с МДАТ претерпевает драматические изменения. Так, ни в одном из исследуемых отделов мозга не удалось обнаружить мРНК, кодирующие ЦП, ГФИ-ЦП, АТР7А и АТР7В. На низком уровне сохраняется активность генов CTR1 и АРР. Анализ экспрессии этих генов был проведен и в печени этих животных. Результаты показали, что введение нейротоксического пептида в мозг не влияет ни на профиль, ни на уровень экспрессии генов медьтранспортных белков в печени (Федотова и др., 2006).

За период проведения эксперимента (21 день) содержание СОД2-мРНК практически не меняется, количество зрелых транскриптов гена СОД1 снижается только в гиппокампе. Уровень Cox4i1 снижается равномерно по отделам. Однако снижение мРНК купроэнзимов, в отличие от мРНК медьтранспортных белков, при индуцированном фибриллогенезе существенно менее значительное.

В коре, мозжечке и гиппокампе было измерено относительное содержание белка СОД1 и ее ферментативная активность (рис. 11, вкладка). Представленные результаты демонстрируют, что в отделах мозга полипептиды СОД1 синтезируются, однако, уровень активности цитозольной СОД1 во всех исследованных отделах мозга снижен. В МПМ, выделенном из митохондрий коры и мозжечка, активность СОД1 выявлена (рис. 11, вкладка).

Так как для болезни Альцгеймера характерным является снижение уровня ЦП и меди в мозгу (Klevay, 2008), можно предположить, что МДАТ является подходящей моделью для изучения определенных аспектов БА у человека.

3.4. Изменение метаболизма меди в опухолях. Для того чтобы оценить связь между обменом меди и опухолевым ростом, метаболизм меди был изучен у Min мышей. Мыши этой линии получены методом химического мутагенеза из линии C57BL/6J. Изменения вызваны мутацией в гене АРС (adenomatosis poliposis coli), кодирующем онкосупрессор, входящий в состав комплекса, формирование которого регулируется через Wnt-сигнальный путь. Гомозиготы Арс-/- не жизнеспособны. У 100% гетерозигот (мыши АрсMin, Min мыши), выращенных на рационе, богатом жирами, на всем протяжении кишечного тракта развивается до 30 и более аденом. Процесс начинается с 60-дневного возраста с роста аденом, на поздних сроках появляются аденокарциномы, но образование метастазов не отмечено. Эти мыши живут примерно 120 дней. Эксперименты проводили на образцах печени, стенки кишечника и аденомах, полученных от 70-дневных Min мышей. В качестве контроля использовали мышей линии C57BL/6J того же возраста. В опыте участвовали 3 контрольные мыши и 6 Min мышей. ЦП сыворотки крови выявляли в геле окрашиванием орто-дианизидином, проявившиеся зоны анализировали с помощью программы “Scion Image”. Результаты показывают (рис. 12, А и В, вкладка), что у Min мышей содержание ЦП в крови увеличивается на 50% (Р<0.05). По данным ОТ-ПЦР анализа (рис. 12, С, вкладка) в печени Min мышей активность гена ЦП примерно в три раза выше, чем в печени контрольных мышей. Более того, относительная концентрация АТР7В-мРНК и CTR1-мРНК также достоверно выше. Помимо этого, в клетках печени Min мышей мы наблюдали экспрессию АТР7А и ГФИ-ЦП. Ген АТР7А в культивируемых гепатоцитах (линия HepG2) не экспрессируется, не образуется в них и ГФИ-форма ЦП-мРНК. При ОТ-ПЦР анализе РНК, полученной из ткани печени эти две мРНК, как правило, выявляются в небольших количествах. Это объясняют тем, что печень, помимо гепатоцитов, содержит клетки, экспрессирующие эти мРНК (например, купферовские клетки, клетки эндотелия). В нашем случае относительное количество мРНК ГФИ-ЦП и АТР7А, определяемое в печени Min мышей, нельзя отнести к загрязнению. В составе тотальной РНК, выделенной из клеток кишечного эндотелия и аденом, продуктов экспрессии генов ЦП и АТР7В не найдено. В некоторых препаратах выявлялись следы АТР7А. В то же время во всех этих тканях эффективно экспрессируются ген CTR1. При этом уровень экспрессии этого гена повышается в ряду дикий типMin мышиаденомы (рис. 13). Представленные результаты позволяют считать, что Min мыши являются подходящей моделью для изучения механизмов, влияющих на активацию генов метаболизма меди в печени при росте опухолей различной локализации. Такие данные могут быть ценными для понимания транс-регуляции экспрессии гена ЦП и помогут понять феномен повышения содержания ЦП в крови млекопитающих

Рис. 13. Экспрессия гена CTR1 в клетках кишечника мышей. По оси абсцисс: относительные единицы.

при развитии опухолей и научно обоснованно использовать этот показатель в качестве биомаркера для оценки роста опухоли.

ВЫВОДЫ

1. В мозгу крыс в течение развития происходят регион-специфические изменения распределения меди. Параллельно происходит смена профилей экспрессирующихся генов медьтранспортных белков: у новорожденных из двух медьтранспортных АТФаз преимущественно экспрессируется АТФаза Менкеса, у взрослых в мозгу активируется ген, кодирующий АТФазу Вильсона. Из двух сплайс-форм мРНК церулоплазмина у новорожденных преимущественно формируется мРНК, кодирующая секреторную форму ЦП, у взрослых – мРНК, кодирующая мембранную изоформу (ГФИ-ЦП). Это позволяет определить метаболизм меди в мозгу новорожденных как эмбриональный тип, смена которого на взрослый происходит в разных отделах мозга не одновременно.

2. У Ag-крыс наблюдается накопление серебра и изменение концентрации меди, железа и цинка только в гипоталамо-гипофизарной системе. На фоне дефицита церулоплазминовой меди в крови активность генов медьтранспортных белков в клетках мозга снижается, уровень экспрессии внутриклеточных купроэнзимов не меняется.

3. У новорожденных крыс ионы серебра поступают в организм с молоком и аккумулируются в печени в тех же компартментах, где накапливается медь. У животных снижается оксидазная активность ЦП крови, но не меняется уровень экспрессии гена этого белка в печени. В мозгу относительная концентрация мРНК, кодирующей секреторный ЦП, падает.

4. Фибриллогенез, индуцированный введением в мозг фрагмента нейротоксического пептида -амилоида, вызывает в клетках нервной ткани снижение концентрации меди и цинка. При этом экспрессия генов медьтранспортных белков и купроэнзимов падает. В печени экспрессия генов медьтранспортных белков и купроэнзимов у этих животных не меняется.

5. Изменения метаболизма меди в сосудистом сплетении в течение развития отличаются от изменений в других рассмотренных отделах мозга и сходны с таковыми в печени при смене эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый. У МДАТ-крыс в сосудистом сплетении не происходит снижения концентрации меди и цинка. Отличия метаболизма меди в клетках сосудистого сплетения по сравнению с клетками нервной ткани, вероятно, связаны с мезенхимальным происхождением этого отдела.

6. При дефиците меди в сыворотке крови (Ag-крысы) и нарушении обмена меди (МДАТ-крысы) цитозольная апо-СОД перемещается в митохондрии и переходит там в холо-форму. При этом, по-видимому, в качестве источника меди используется митохондриальный пул меди.

7. Рост аденом у мышей линии ApcMin сопровождается повышением уровня и изменением профиля экспрессии генов медьтранспортных белков в печени. Повышается уровень экспрессии гена CTR1 в тканях кишечника и аденомах.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Клотченко С. А., Цымбаленко Н. В., Соловьёв К. В., Скворцов А. Н., Затуловский Е. А., Бабич П. С., Платонова Н. А., Шавловский М. М., Пучкова Л. В., Броджини М. Влияние ионов серебра на метаболизм меди и экспрессию генов медьтранспортных белков в печени крыс // Доклады Академии Наук, 418 (4): 549—552, 2008.

2. Platonova N., Scotti M., Babich P., Bertoli G., Mento G., Meneghini V., Egeo A., Zucchi I. Merlo G.R. TBX3, the gene mutated in ulnar-mammary syndrome, promotes growth of mammary epithelial cells via repression of p19ARF, independently of p53 // Cell Tissue Res. 328(2): 301-316, 2007.

3. Федотова Ю. О., Бабич П. С., Платонова Н. А., Клотченко С. А., Цымбаленко Н. В., Пучкова Л. В., Сапронов Н. С. Экспрессия медьтранспортных генов в мозге крыс при экспериментальной деменции альцгеймеровского типа // Доклады Академии Наук, 409 (4): 555—558, 2006.

4. Бабич П.С., Цымбаленко Н.В., Пучкова Л.В. Онтогенетические изменения активности генов медьтранспортных белков и купроэнзимов в отделах мозга крыс. Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г., Новосибирск. С. 736.

5. Цымбаленко Н.В., Клотченко С.А., Затуловский Е.А., Скворцов А.Н., Бабич П.С., Шавловский М.М., Пучкова Л.В. Влияние ионов Ag на метаболизм Cu и синтез купроэнзимов у крыс. Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г., Новосибирск. С. 510.

6. Babich P., Platonova N., Tsymbalenko N., Puchkova L. Brain-region specific copper metabolism in rats with copper deficiency induced by Ag-ions. European Journal of Human Genetics, 2008, V. 16, sup. 2, pp. 139-140. (EHG, conference, Barselona, Spain, 2008).

7. Zatulovskiy E.A., Skvortsov A.N. Tsymbalenko N.V., Babich P.S., Ilyeichyova E.Yu., Shavlovsky M.M., Broggini M., Puchkova L.V. The model to study effects of blood serum copper deficiency on d-element metabolism in liver and brain of rodents. Abstract book of 38th International Conference on Coordination Chemistry, Jerusalem, Israel, July, 2008, P. 310.

8. Бабич П.С. Пучкова Л.В., Мутанен М. Метаболизм меди в печени и эпителии кишечника у Min-мышей до и после развития аденом. Сборник материалов 12-й Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века», 2007 Пущино.

9. Бабич П. С., Федотова Ю. О., Клотченко С. А., Платонова Н. А. Изменение метаболизма меди при экспериментальной деменции альцгеймеровского типа. Сборник материалов 10-й Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века», Пущино, 17—21.05.2006, с. 65—66.

10. Babich P. Fedotova J.O. Copper transporting genes expression in bran regions of the rats with experimental dementia of Alzheimer’s type. 17th European Students Conference, Berlin, Germany, October 8–12, 2006, book of abstracts, p. 4.

Работа поддержана грантами РФФИ № 03-04-48748 и № 06-04-49786, III Итальянской правительственной программой совместных научных программ Италия-Россия № 10-RB18; стипендией CIMO (Central for International Mobility, Финляндия) NTM-07-4748/WC10; а также грантами правительства Санкт-Петербурга (2007 и 2008 гг.).

Polina S. Babich

Summary of the PhD-thesis “Copper metabolism in the rat brain at the different states” (carried out at the Department of Molecular Genetics, Research Institute of the experimental medicine, and at the chair of Biophysics of St.-Petersburg State Polytechnic University, St.-Petersburg, and at the Department of Applied Chemistry and Macrobiology in University of Helsinki, Helsinki, Finland)

Background. Copper is necessary for mammals at all developmental period, since it is present in the active centers of vitally important enzymes. Simultaneously, copper ions have toxic effect because they initiate oxidation of various biomolecules. Copper deficiency during development has a long-term effect on central nervous system activity, while excess of copper can lead to severe diseases. The planning of the work is based on our data which were obtained previously. It was shown that concentrations of copper and ceruloplasmin (Cp) rise up to 7 times in cerebrospinal fluid (CSF) in rats fed with baby formula. Others in vitro shown that cultured neurons loss iron ions and their membranes undergo the depolarization if medium Cp concentration is higher than it is in CSF. It is possible that abnormalities in brain copper balance in newborns can be result in long term effects on central nervous system function. However there are not clear data on copper metabolism in bran of the newborns as well as on connection between different states of organism and copper metabolism in brain.

The present study aimed to clarify connection between physiological states and copper metabolism.

The animal models. The work is performed on the four animal models:

1) Newborn and adult rats – models of embryonic and adult types of copper metabolism;

2) Adult rats consumed AgCl with feeder during 4 weeks – model of copper deficiency in blood serum (Ag-rats); bonus model – newborn rats fed by milk from Ag-rat;

3) Rats with fibrillogenesis induced by administration of the neurotoxic fragment of -amiloid into ventricle of brain – model of dementia of Alzheimer’s type (MDAT-rats);

4) ApcMin mice – model of cancer development.

Investigation was done for cortex, cerebellum, hippocampus, amygdaloidal body, hypophysis, hypothalamus, choroid plexus, liver, blood serum, and CSF.

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»