WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |

1.5. Содержание меди и ЦП в СМЖ крыс в течение развития. В сыворотке крови и в образцах СМЖ, взятых у 8- и 14-суточных крыс, а также у взрослых половозрелых и лактирующих крыс, была измерена концентрация меди и ЦП методами атомно-абсорбционной спектрометрии и количественного иммуноэлектрофореза, соответственно. Измерения показали, что концентрация ЦП у этих животных составляет 59, 81, 358 и 512 мг/л, а концентрация меди – 200, 240, 700 и 1040 мкг/л, соответственно. Во всех образцах крови на 1 молекулу ЦП приходится примерно 5-6 атомов меди. Наблюдаемое низкое содержание ЦП и меди в крови новорожденных и его повышение в течение развития полностью соответствует данным литературы. У всех исследованных животных концентрация меди в СМЖ оказалась одинаковой и равной примерно 15 мкг/л. При этом содержание ЦП в СМЖ не зависит от его концентрационных колебаний в сыворотке крови и составляет около 3 мг/л, что почти в 100 раз меньше, чем в сыворотке взрослых крыс. Иммунопреципитация ЦП из ликвора приводит к перемещению 97% меди в осадок. Это означает, что практически все атомы меди, циркулирующие в СМЖ, ассоциированы с ЦП, молекула которого содержит около 10 атомов меди. Обработка образцов ликвора смолой Chelex-100 удаляет примерно 35% ионов меди. Следовательно, из 10 атомов меди, связанных с 1 молекулой ЦП, 3 – 4 атома связаны слабо.

1.6. Изменения активности генов, кодирующих внутриклеточные купроэнзимы. В тотальной фракции мРНК, изолированной из отделов мозга 10- и 120-дневных крыс, была определена относительная концентрация зрелых транскриптов генов, кодирующих СОД1, СОД2 и Сox4i1. Фермент СОД1 является основным цитозольным купроэнзимом, концентрация которого строго зависит от обмена меди (Suazo et al., 2008). Для него в качестве партнера по системе антиоксидантной защиты была использована СОД2. Для оценки экспрессии мультисубъединичного комплекса СОХ была выбрана изоформа 1 субъединицы 4 (Cox4i1). Выбор определили следующие соображения. Экспрессия гена Cox4i1 строго коррелирует со сборкой и функционированием зрелой СОХ, поэтому по уровню активности этого гена можно судить об активности СОХ в целом. К тому же Cox4i1 экспрессируется в клетках мозга и печени (Richter, Ludwig, 2003). Помимо этого, ядерный ген, кодирующий ее, в отличие от митохондриальных генов, содержит интроны, что позволяет адекватно использовать ОТ-ПЦР анализ. Найдено, что гены СОД1, СОД2 и Cox4i1 экспрессируются во всех отделах мозга, но у новорожденных относительный уровень их активности ниже, чем у взрослых крыс.

1.7. Распределение СОД1 в цитозоле и в межмембранном пространстве митохондрий мозга новорожденных и взрослых крыс. В следующей серии опытов было определено сравнительное содержание белка СОД1 в печени и мозге новорожденных крыс, распределение его между цитозолем и межмембранным пространством митохондрий (МПМ). Опыты этой серии проводили на целом мозге. Для этого мозг измельчали ножницами, из кашицы отбирали весовые аликвоты, из которых получали субклеточные фракции. Образцы для электрофореза строго выравнивали по белку. Относительное содержание СОД1 определяли методом иммуноблотинга. Результаты представлены на рисунке 3. Они показывают, что содержание белка СОД1 в печени и взрослых, и новорожденных крыс в несколько раз выше, чем в мозгу. У новорожденных и в мозгу, и в печени содержание СОД1 ниже, чем у взрослых. Эти данные полностью согласуются с данными ОТ-ПЦР анализа. Обращает на себя внимание внутриклеточное распределение белка СОД1 у новорожденных: в МПМ и печени, и мозга СОД1 едва обнаруживается (рис. 3). Данные, приведенные на рисунке 4 (вкладка), показывают, что ферментативная активность цитозольной СОД1 из клеток мозга и печени, по положению в геле соответствует зоне, выявляемой антителами к СОД1. Это означает, что в мозгу соотношение апо-СОД1 и холо-СОД1 у взрослых и новорожденных не отличается.

Рис. 3. Выявление СОД1 в субклеточных фракциях печени (столбцы 1 и 3) и мозга (столбцы 2 и 4) взрослых (столбцы 3 и 4) и новорожденных (столбцы 1 и 2) крыс методом иммуноблотинга. А – цитозоль, В – межмембранное пространство митохондрий, С – иммуноблотинг белков цитозоля с антителами к -актину.

2. Влияние дефицита оксидазного ЦП в крови на метаболизм меди в мозгу взрослых и новорожденных крыс. Для изучения влияния дефицита меди на экспрессию генов медьтранспортных белков и купроэнзимов в мозгу взрослых крыс был применен известный экспериментальный прием – добавление в корм солей серебра, снижающих содержание оксидазного ЦП и меди в сыворотке крови крыс (Prybil et al., 1981). Мы показали, что у крыс (Ag-крысы), вскармливаемых в течение четырех недель ионами серебра (50 мг AgCl/кг массы тела), в крови циркулирует апо-ЦП, серебро накапливается в печени, метаболизм меди в печени не изменяется (Клотченко и др., 2008). У Ag-крыс, как показало измерение в целом мозге, концентрация серебра незначительно превышает фон. Чтобы установить, распределяется ли серебро в мозгу равномерно или аккумулируется локально, концентрация серебра была определена в отделах мозга Ag-крыс. Параллельно в этих же образцах определяли концентрацию меди и железа, так как конкурентное поступление серебра может снижать уровень меди и образование медьсодержащих ферроксидаз (ЦП и ГФИ-ЦП), дефицит которых приводит к нарушению баланса железа в клетках. Также измеряли и концентрацию цинка, которая может служить в качестве контроля специфичности действия серебра. Результаты показали, что за время эксперимента ни в одном из отделов мозга, за исключением гипофиза (Р<0.05), серебро не аккумулируется. Отклонения в концентрации меди и железа найдены только в гипоталамо-гипофизарной системе. Так, концентрация меди достоверно снижается в гипоталамусе (в два раза), а в гипофизе содержание железа увеличивается в пять раз. Концентрация цинка в гипофизе повышается в два раза.

По данным ОТ-ПЦР анализа экспрессия генов медьтранспортных белков (СTR1, АТР7А и АТР7В), а также гена ЦП в отделах мозга Ag-крыс почти полностью подавляется, гена АРР – существенно снижается. При этом во всех отделах, включая гипофиз и гипоталамус, steady state уровень мРНК, кодирующих СОД1, СОД2 и Сox4i1, не меняется.

У Ag-крыс содержание иммунореактивных полипептидов СОД1 в цитозоле, полученном из клеток коры, мозжечка и гиппокампа, определенное методом иммуноблотинга, не меняется, как и активность этого фермента (рис. 5, вкладка). Эти результаты хорошо согласуются с данными ОТ-ПЦР анализа.

В отличие от контрольных животных, у Ag-крыс в МПМ обнаруживается белок СОД1, демонстрирующий ферментативную активность (рис. 6, вкладка).

Таким образом, дефицит церулоплазминовой меди в крови, к тому же практически полный в течение последней из четырех недель эксперимента, не влияет на содержание меди, железа и цинка в коре, мозжечке, гиппокампе и в миндалевидном теле взрослых крыс. При этом не меняется и уровень экспрессии генов внутриклеточных купроэнзимов. Однако распределение СОД1 у Ag-крыс отличается от такового у контрольных крыс: в то время как у контрольных крыс митохондриальная СОД1 едва определяется, у Ag-крыс она почти равномерно распределяется между цитозолем и митохондриями. Возможно, что у Ag-животных источником атомов меди для СОД1 становятся митохондрии, выполняющие роль депо меди у млекопитающих (Cobine et al., 2006).

Обращают на себя внимание изменения концентрации меди, железа и цинка в гипоталамо-гипофизарной системе. Они показывают, что снижение уровня образования ЦП в гипоталамусе, возможно, влияет на освобождение железа из клеток гипофиза. Интересно, что именно в гипоталамусе взрослых крыс не только самая высокая концентрация меди (табл. 1), но и самый высокий уровень экспрессии секреторного ЦП (рис. 2, вкладка) и АТР7В. В то же время в гипофизе уровень образования ГФИ-ЦП превышает таковой в других отделах мозга. Локальное резкое повышение концентрации железа в гипофизе, позволяет считать, что ЦП, синтезирующийся в этой системе, играет важную роль в экспорте железа. Понимание наблюдаемого эффекта требует дополнительных исследований.

Полученные данные показывают, что полный дефицит церулоплазминовой меди приводит к потере активности генов медьтранспортных белков, при этом ни концентрация меди, ни активность внутриклеточных купроэнзимов не меняются. Результаты позволяют предположить, что в клетках мозга существует система, сохраняющая ионы меди в условиях их общего дефицита и активность генов медьтранспортных белков регулируется поступлением меди в мозг.

3. Влияние AgCl на метаболизм меди в печени и мозгу крыс при эмбриональном типе метаболизма меди. Исследование проведено на печени и мозге 10-дневных крыс (обозначены – Ag(10)-крысы), вскармливаемых самкой, в корм которой с первого дня после родов добавляли AgCl. За эти 10 суток у взрослых Ag-крыс уровень оксидазного ЦП в крови снижается примерно в два раза.

В проведенном эксперименте центральными вопросами были:

1) поступает ли серебро в клетки молочной железы лактирующей крысы

2) поступает ли серебро в молоко

3) если да, то, как оно распределяется в организме Ag(10)-крыс

4) изменяется ли метаболизм меди в печени и мозгу Ag(10)-крыс

В качестве контроля использовали 10-дневных крыс, родившихся одновременно с крысами экспериментальной группы. Масса тела Ag(10)-крыс достигает 16.8±1.9 г (n=8). К этому же времени у контрольных животных она составляет 21.0±2.5 г (n=8). Разница в 25% оказалась незначимой. Животные обеих групп не отличались по показателям физического развития (появление шерстного покрова, вставание, вращение хвостом, отлипание ушной раковины). В печени и мозгу этих крыс были определены концентрация и внутриклеточная локализация ионов серебра и меди, измерены относительное содержание зрелых транскриптов генов медьтранспортных белков и купроэнзимов, а также их белковых продуктов. Исследование проводили на целом мозге. Все измерения у 10-дневных крыс повторены дважды. Каждый образец ткани, крови и мочи состоял из аликвот, взятых от трех животных. Таким образом, данные для новорожденных являются средними значениями для шести животных. В опыте участвовали только две взрослые крысы, взятые на 10-й день лактации: контрольная и получавшая с кормом AgCl с первого дня после родов.

Результаты, представленные на рисунке 7 (вкладка), показывают, что у вскармливающей самки, получавшей серебро в течение 10 дней, уровень оксидазного ЦП в крови снижается, а в кровотоке циркулирует неоксидазная форма ЦП. У Ag-крыс в крови появляется неоксидазная форма ЦП с большей подвижностью, чем холо-ЦП. Заметно снижается оксидазная активность и в сыворотке крови Ag(10)-крыс. При этом уровень иммунореактивного ЦП не меняется. В экстрактах содержимого желудков у Ag(10)-крыс, в отличие от контрольных 10-дневных крыс, оксидазный ЦП не обнаруживается. В то же время в них присутствует белок ЦП. В экстрактах содержимого желудков серебро выявляется в количестве почти в 40 раз превышающее фоновое. Это означает, что серебро поступает в молочную железу и, не влияя на уровень экспрессии гена ЦП, блокирует встраивание атомов меди в активные центры ЦП молока. Обращает на себя внимание тот факт, что в экстрактах содержимого желудков концентрация меди не снижается. Таким образом, серебро с молоком поступает в ЖКТ новорожденных. О том, всасывается ли оно из ЖКТ, судили по данным измерения его распределения в организме. Результаты показали, что у Ag(10)-крыс концентрация серебра в крови заметно выше фона, концентрация меди при этом не снижается. Ag(10)-крысы аккумулируют серебро в печени примерно в 10 раз интенсивнее, чем в мозгу. Однако накопление меди в печени, характерное для эмбрионального типа метаболизма меди, у Ag(10)-крыс не нарушается: у них, как и у контрольных 10-дневных крыс, концентрация меди в печени многократно превышает таковую у взрослых крыс. Это указывает на то, что при эмбриональном типе метаболизма меди в клетках печени существует особый путь для ее накопления. Ионы серебра не конкурируют с медью за транспорт по этому пути. В мозгу содержание меди у Ag(10)-крыс не меняется.

Профили распределения меди и серебра в клетках печени Ag(10)-крыс полностью совпадают (рис. 8). Оба элемента определяются в цитозоле, мембранах эндоплазматического ретикулума и в митохондриях. Данные ОТ-ПЦР анализа показали, что в печени Ag(10)-крыс активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов не меняется. В мозгу под действием пищевого серебра резко снижается относительная концентрация ЦП-мРНК. Уровень экспрессии других генов, взятых в рассмотрение, меняется мало. Это подтверждается и данными иммуноблотинга для CTR1 и СОД1 (рис. 9 и 10, вкладка).

Рис. 8. Распределение ионов серебра и меди в клеточных компратментах печени Ag(10)-крыс. Постъядерный супернатант гомогената печени анализировали методом изопикнического центрифугирования в ступенчатом градиенте концентраций сахарозы (см. Методы). По оси абсцисс – номер фракции градиента; по оси ординат – концентрация Ag и Cu, мкг/л.

Результаты этой части работы однозначно показывают, что атомы серебра абсорбируются в ЖКТ млекопитающих и переносятся по внеклеточным пространствам и внутри клетки по тому же пути, что и атомы меди. К тому же на всех этапах переноса во всех компартментах организма атомы серебра «упакованы» в молекулы таким образом, что они остаются в обменной форме. Способность ионов серебра создавать дефицит меди в крови без существенных изменений синтеза купроэнзимов может быть использована как средство снижения уровня меди при нейродегенеративных заболеваниях и в качестве средства для подавления роста опухолей, которые нуждаются de novo в большем количестве меди, ассоциированной с ЦП, чем нормальные клетки (Cohen et al., 1979; Linder et al., 1979; Campbell et al, 1981). Для разработки таких подходов необходимы дополнительные разносторонние исследования. В рамках такой задачи оценка метаболизма меди была проведена в мозгу крыс с индуцированным фибриллогенезом и у Min мышей.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»