WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |

1.2. Внутриклеточное распределение меди в мозгу 10-дневных крыс. Сравнительный анализ внутриклеточного распределения меди в мозгу и печени новорожденных и взрослых крыс был осуществлен следующим образом. Постъядерные супернатанты гомогенатов, полученных из равных по весу кусочков печени и мозга 10- и 120-дневных крыс фракционировали в ступенчатом градиенте концентраций сахарозы. Во фракциях градиента определяли содержание меди. Количество меди, открываемой в органеллах, относили к ее общему содержанию. Результаты показали, что у взрослых концентрация меди в мозгу выше, чем в печени (33 против 16 мкг/г сырой ткани). У новорожденных, напротив, концентрация меди в печени многократно, почти в 30 раз, превышает таковую в мозгу (700 против 23 мкг/г сырой ткани). Таким образом, в течение развития концентрация меди в печени падает (16 против 700 мкг/г сырой ткани), а в мозгу повышается (33 против 23 мкг/г сырой ткани). Эти результаты полностью совпадают с данными, известными по литературе. Обобщенные данные по внутриклеточному распределению меди в печени и мозге в течение развития приведены в таблице 2. Они показывают, что в клетках печени новорожденных основная часть меди локализуется в цитозоле и во фракции внутриклеточных мембран, которую составляют микросомы, аппарат Гольджи и везикулы. При переходе на взрослый тип метаболизма меди ее содержание в цитозоле снижается.

Таблица 2. Распределение меди в клеточных компартментах печени и мозга крыс в течение развития.

Клеточный компартмент

Доля меди от ее общего содержания, %

печень

мозг

новорожденные

взрослые

новорожденные

взрослые

Цитоплазма

40

22

11

9

Внутриклеточные мембраны

38

37

50

46

Митохондрии

9

21

19

21

Лизосомы

11

10

11

18

Пероксисомы

2

10

9

6

Основная часть меди выявляется во фракции внутриклеточных мембран. Повышается и относительное содержание меди в митохондриях. В клетках мозга 10-дневных и взрослых крыс медь распределяется одинаково и сходно с печенью взрослых: основная часть меди присутствует во фракции внутриклеточных мембран и в митохондриях. Такой рисунок распределения хорошо объясняет известное участие этих клеточных компартментов в метаболизме меди. Так, цитозоль и митохондрии являются местами локализации соответственно СОД1 и СОХ, основных клеточных купроэнзимов, а во фракции внутриклеточных мембран формируются такие купроэнзимы, как ЦП, ГФИ-ЦП, пептидилглицин -гидроксилирующая монооксигеназа, тирозиназа и допамин--монооксигеназа. В лизосомах клеток мозга взрослых крыс по сравнению с 10-дневными крысами содержание меди выше. Возможно, это связано с накоплением в них нейромеланина. Таким образом, механизмов депонирования меди, подобных механизмам, существующим в печени новорожденных, в мозгу новорожденных нет, а наблюдаемое в онтогенезе повышение содержания меди в отделах мозга, за исключением сосудистого сплетения, вероятно, связано с активацией синтеза купроэнзимов в онтогенезе.

1.3. Экспрессия генов медьтранспортных белков в отделах мозга 10-дневных крыс. В работе определена квазистационарная концентрация мРНК, кодирующих ЦП, ГФИ-ЦП, CTR1, АТР7А, АТР7В, АРР, СОД1, СОД2 и Сox4i1 (субъединица 4 изоформа 1 СОХ). Измерение проведено в отделах мозга крыс на 10-е и 120-е сутки жизни. В работе результаты представлены в виде гистограмм, рассчитанных по данным трехкратных измерений. В качестве внутреннего стандарта всегда использовали данные ОТ-ПЦР, полученные для -актина. Разница значений не составляла больше 10%. Для иллюстрации на рис. 1 приведены протоколы ОТ-ПЦР анализа экспрессии взятых в рассмотрение генов. Видно, что профиль экспрессии генов – органоспецифичен, а длины продуктов амплификации соответствуют предсказанным.

А С

В D

Рис. 1. Примеры протоколов ОТ-ПЦР анализа. А – электрофорез амплификатов, полученных на РНК, выделенных из мозга 10-дневных крыс: 1 – -актин, 2 – ЦП, 3 – ГФИ-ЦП, 4 – CTR1, 5 – CTR2, 6 - маркеры. В – то же: 1 – АРР, 2 – СОД1, 3 – СОД2, 4 – Сox4i1, 5 – маркеры. С – РНК изолирована из мозга 19-дневных эмбрионов: 1 – АТР7А, 2 – АТР7В, 3 – АРР, 4 – СОД1, 5 – СОД2, 6 – Сox4i1, 7 – маркеры. D – РНК изолирована из печени взрослых крыс: 1 – -актин, 2 – мтЦП, 3 - АТР7А, 4 – АТР7В, 5 – CTR1, 6 – ЦП, 6 – ГФИ-ЦП, 7 – АРР, 8 – маркеры. Дорожки считать слева направо.

Результаты измерений показали, что ген CTR1 экспрессируется во всех отделах взрослых и 10-суточных крыс. У новорожденных относительное содержание CTR1-мРНК только в коре и мозжечке выше, чем у взрослых крыс. В гипофизе активность этого гена у новорожденных и взрослых крыс не отличается. В гиппокампе, миндалевидном теле и особенно в гипоталамусе и в сосудистом сплетении относительный уровень CTR1-мРНК у взрослых крыс выше. Ген АРР также экспрессируется во всех отделах мозга крыс обеих групп. Относительная концентрация АРР-мРНК выше у взрослых крыс. Самым низким уровнем экспрессии гена АРР характеризуется кора. Во всех исследованных отделах мозга новорожденных крыс экспрессируются гены обеих Cu(I)-АТРаз, однако, активность гена АТР7В ниже активности гена АТР7А, а уровень экспрессии обоих генов у новорожденных ниже, чем у взрослых. У новорожденных ген АТР7А с наибольшей активностью экспрессируется в гипоталамусе, гиппокампе и в сосудистом сплетении, а активность гена АТР7В выше в гиппокампе и в сосудистом сплетении. В целом, результаты позволяют считать, что в мозгу в постнатальный период развития активность генов медьтранспортных белков растет, а профиль Cu-АТФаз изменяется.

1.4. Изменения экспрессии гена церулоплазмина в мозгу развивающихся крыс. Существенные отличия обнаружены в экспрессии гена ЦП. О ней судили по относительному содержанию изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга: мРНК, кодирующей секреторный ЦП, и мРНК, программирующей синтез ГФИ-ЦП. Полный протокол одного из этих опытов приведен на рисунке 2 (вкладка). Видно, что во всех исследуемых отделах мозга взрослых крыс преимущественной изоформой продукта транскрипции гена ЦП является мРНК, кодирующая ГФИ-ЦП, а у новорожденных – мРНК секреторного ЦП. Исходя из того, что ЦП-мРНК и ГФИ-ЦП мРНК являются продуктами одного и того же гена, который активен только в клетках глии (Платонова и др., 2005), мы определили прямое соотношение этих мРНК. Оказалось, что у новорожденных крыс в мозжечке, гиппокампе, миндалевидном теле и гипоталамусе обе изоформы образуются примерно в одинаковых количествах (соотношение ЦП-мРНК/ГФИ-ЦП мРНК колеблется около 1). В гипофизе и, особенно, в коре у 10-дневных крыс образование ЦП-мРНК существенно превышает образование ГФИ-ЦП мРНК. У взрослых крыс во всех отделах, исключая гиппокамп, отношение ЦП-мРНК/ГФИ-ЦП мРНК ниже 1, что указывает на преимущественное образование в них ГФИ-ЦП мРНК. Только в сосудистом сплетении и новорожденных, и взрослых крыс ГФИ-ЦП мРНК и ЦП-мРНК образуются примерно в равных соотношениях. Полученные данные однозначно показывают, что уровень образования секреторного ЦП в нервных клетках у новорожденных крыс выше, чем у взрослых. Напротив, формирование ГФИ-ЦП происходит значительно интенсивнее у взрослых. Повышение концентрации меди в коре, гиппокампе и мозжечке в течение развития может быть прямо связано с увеличением уровня ГФИ-ЦП. Об этом можно с уверенностью судить, так как в ходе перфузии ЦП удаляется, в то время как ГФИ-ЦП остается связанным с клеточной поверхностью. В пользу этого предположения свидетельствует и тот факт, что в мозгу взрослых крыс, по данным

Рис. 2. Транскрипционная активность гена церулоплазмина в отделах мозга взрослых и новорожденных крыс. А – схема соответствия праймеров на кДНК ЦП, с помощью которых выявляли мРНК ГФИ-ЦП (вверху) и мРНК растворимого ЦП (внизу).

Б – электрофорез продуктов ОТ-ПЦР, полученных на препаратах тотальной РНК, выделенной из различных отделов мозга взрослых (а) и новорожденных (б) крыс. В – электрофореграмма типичных препаратов РНК, использованных в работе. 1 – кора, 2 – мозжечок, 3 – гиппокамп, 4 – миндалевидное тело, 5 – гипофиз, 6 – гипоталамус, 7 – сосудистое сплетение. bp – пар оснований.

Рис. 4. Активность СОД1 в цитозоле мозга новорожденных (1) и взрослых (2) крыс. А – окрашивание геля на присутствие СОД1 после нативного электрофореза, В – иммуноблотинг тех же образцов с антителами к СОД1. 3 – цитозоль печени взрослых крыс.

Рис. 5. Содержание СОД1 в цитозоле отделов мозга контрольных (1 – 3) и Ag-крыс (4 – 6) по данным иммуноблотинга (А). 1 и 4 – кора, 2 и 5 – мозжечок, 3 и 6 – гиппокамп. Нижний ряд – иммуноблотинг этих же образцов цитозоля с антителами к ГД3ФД. В – активность СОД1, выявляемая в этих же образцах. Вверху: активность СОД1, выявляемая в геле, внизу: иммуноблотинг этих же образцов с антителами к СОД1 после нативного электрофореза в ПААГ. Обозначения, как на блоке А.

Рис. 6. Обнаружение СОД1 в межмембранном пространстве митохондрий методом иммуноблотинга после электрофореза в ПААГ в денатурирующих (А) и нативных (С) условиях, а также по ферментативной активности (В). 1 и 3 – кора, 2 и 4 – мозжечок. 1 и 2 – контрольные крысы, 3 и 4 – Ag-крысы.

Рис. 7. Влияние пищевого серебра на оксидазную активность ЦП. А – ПААГ после электрофореза в нативных условиях окрашен орто-дианизидином; 1 – сыворотка крови контрольной самки; 2 – то же, Ag-самка. 3 и 4 – смеси равных объемов сывороток от трех 10-дневных крыс; 5 и 6 – то же, Ag(10)-крысы. На дорожку нанесено по 1 мкл сыворотки. 7 – смесь содержимого желудков трех Ag(10)-крыс (20 мкл), 8 – то же, контроль. В – иммуноблотинг с антителами к ЦП крысы. 1 – сыворотка крови контрольной самки; 2 – то же, Ag-самка. 3 и 4 – смеси равных объемов сывороток от трех Ag(10)-дневных крыс; 5 и 6 – то же, 10-дневные крысы. На дорожку нанесено по 0.1 мкл сыворотки. 7 – смесь содержимого желудков трех Ag(10)-крыс (5 мкл), 8 – то же, контроль.

Рис.9. Относительное содержание CTR1-мРНК в плазматических мембранах печени (1, 2, 5 и 6) и мозга (3, 4, 7 и 8) контрольных (нечетные) и опытных крыс (четные). 1 – 4: новорожденные, 5 – 8: взрослые. Стрелкой показано положение в геле BSA.

Рис. 10. Содержание (А) и активность (В) СОД1 в цитоплазме, выделенной из печени (1, 2, 5 и 6) и мозга (3, 4, 7 и 8). контрольных (нечетные) и опытных крыс (четные). 1 – 4: новорожденные, 5 – 8: взрослые.

Рис. 11. Выявление полипептидов СОД1 в цитозоле (слева) и в МПМ (справа). Слева: А – иммуноблотинг цитозоля, выделенного из коры, мозжечка и гиппокампа контрольных крыс (1-3) и с индуцированным фибриллогенезом (4-6). Вверху – антитела к СОД1, внизу – антитела к ГДЗФД. В: то же, вверху – гель окрашен на активность СОД1, внизу – иммуноблотинг с антителами к СОД1 после электрофореза в 10% ПААГ в неденатурирующих условиях. Справа: иммуноблотинг МПМ, выделенного из коры (1 и 3) и мозжечка (2 и 4) контрольных крыс (1 и 2) и крыс с МДАТ (3 и 4). Вверху: иммуноблотинг с антителами к СОД1 после электрофореза в SDS-ПААГ, в центре: активность СОД1, выявляемая в геле, внизу: иммуноблотинг с антителами к СОД1 после электрофореза в 10% ПААГ в неденатурирующих условиях.

А

В С

Рис. 12. Влияние опухолевого роста у Min мышей на метаболизм меди в печени. А: содержание оксидазного ЦП в крови 70-дневных мышей; 1 – 5: Min мыши, 6 – 8: С57BL/6J мыши; 9 – образец крови крысы. Образцы по 1 мкл сыворотки крови подвергнуты электрофорезу в 7.5% ПААГ, который затем окрашен орто-дианизидином.. В: результаты обработаны с помощью программы “Scion Image”. С: экспрессия генов медьтранспортных белков.

иммуногистохимического окрашивания, ГФИ-ЦП присутствует во всех клетках, выстилающих желудочки и в клетках глии (Платонова и др., 2005; Повалихин, 2007). В то же время мы не наблюдали окрашивания срезов мозга новорожденных антителами к ЦП при использовании той же техники (данные не приводятся).

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»