WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |

2. Крысы с дефицитом оксидазного ЦП в крови. Самцы линии Вистар с массой тела около 250 г получали в течение 4-х недель корм, содержащий 50 мг AgCl на1 кг массы тела крыс в сутки. Корм и воду животные получали без ограничения. О развитии дефицита меди судили по исчезновению оксидазной активности в сыворотке крови.

3. Крысы с индуцированным фибриллогенезом (модель деменции альцгеймеровского типа, МДАТ). Самкам крыс линии Вистар массой 180 – 200 г в латеральный мозговой желудочек вводили 5 мкл водной взвеси, содержащей 15 мкг агрегированного пептида, который соответствует по последовательности нейротоксическому пептиду -амилоида (10YEVHHQKLVFFAEDV25, “Sigma”, США), на глубину 3,8 мм через операционное отверстие, сделанное над правым боковым желудочком в координатах А = 0,8, L = – 1,5 по атласу мозга крысы (Fifkova and Marsala, 1967). Крыс контрольной группы подвергали такой же операции, но в полость желудочка вводили по 5 мкл стерильной бидистиллированной воды. В опытах использовали животных через 21 день после операции. О развитии у них МДАТ судили по появлению на гистологических препаратах выраженных нейрональных повреждений и замедлению скорости выработки условного пищевого рефлекса (Stepanov and Sapronov, 2005).

4. Мыши линии ApcMin были предоставлены проф. М. Мутанен в рамках работы по стипендии CIMO. Часть работы выполнена на клетках линии НС11, первично полученных из эпителия молочной железы мышей на среднем сроке беременности (Merlo et al., 1995).

Материалы, использованные в работе.

Реактивы для проведения электрофореза в полиакриламидном и агарозном гелях, сахароза, детергенты, реагенты для ферментативных реакций, смесь ингибиторов протеаз приобретены у фирмы «Sigma», США; неорганические соли – у фирмы «Merсk», Германия; кислоты, щелочи и хлороформ – у фирмы «Вектон», Россия. Реагенты для проведения хемилюминесцентного иммуноблотинга приобретены у фирмы «Amersham», Великобритания. Для выделения тотальной РНК использован реактив “TRIzol Reagent”, “Invitrogen” (Великобритания). Ферменты, буферные смеси, растворы солей и праймеры для обратной транскрипции приобретены у фирмы «Амплисенс» (Москва). Реактив для определения концентрации белка по Брэдфорду, твердый Cu-хелатирующий агент Chelex-100 и белковые маркеры для электрофореза произведены фирмой “BioRad” (США), ДНК-маркеры – фирмой «Сибэнзим» (Новосибирск).

Антитела. Моновалентные поликлональные кроличьи антитела к ЦП сыворотки крови крысы получены к высокоочищенному препарату ЦП крысы. Для получения антител к CTR1 был использован 15-членный пептид, по последовательности соответствующий участку: 17TMQPSHHHPTTSASH31. Пептид синтезирован ООО «НПФ Верта», СПб, Россия. Кролики породы шиншилла иммунизированы конъюгатом пептида с гемоцианином из гемолимфы камчатского краба по общепринятой схеме. Специфичность антител проверена методом конкуренции с пептидом и по их связыванию Р15/BSA. Антитела к глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназе (Г3ФД), -актину и к полноразмерной рекомбинантной СОД1 приобретены у фирмы “Аbcаm”, США.


Методы исследования.

Извлечение отделов мозга крыс. Крыс подвергали анестезии фенобарбиталом, 60мг/кг массы тела, проводили интракардиальную перфузию 50 мл теплого PBS, содержащего 10 Ед/мл гепарина. Мозг помещали на охлажденную чашку Петри и иссекали отделы в соответствии с атласом (Mitro, Palkovits, 1981). Материал хранили при температуре -70 °С. Забор спинномозговой жидкости (СМЖ) производили под эфирным наркозом из затылочной цистерны, в которую вводили полиэтиленовый капилляр, соединенный с микрошприцом системы Гамильтон. Кровь собирали из шейных или хвостовых сосудов. После образования сгустка сыворотку отделяли центрифугированием. Растворимые белки из содержимого желудков экстрагировали следующим образом. 100 мг содержимого желудка гомогенизировали в 200 мкл PBS, содержащего коктейль ингибиторов протеаз, гомогенат инкубировали на льду 30 мин, центрифугировали 10000g 5 мин. Для исследования использовали надосадочную жидкость.

Субклеточные фракции выделяли методом дифференциального и равновесного центрифугирования, как описано ранее (Васин и др., 2005). Тотальную РНК изолировали с использованием реактива “TRIzol Reagent” в полном соответствии с инструкцией производителя. Полученные препараты РНК (А260/280 = 1,9) по данным электрофореза в 1 % агарозном геле не содержали примесей ДНК и продуктов деградации РНК.

Гель-электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 1% агарозном геле, гели окрашивали бромистым этидием. В качестве маркеров использовали ДНК-маркеры молекулярных весов длиной 250—10000 п.н. фирмы «Сибэнзим», Новосибирск.

Синтез кДНК проводили в реакции обратной транскрипции (ОТ) на тотальной РНК со случайными праймерами. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) на полученных кДНК использовали уникальные праймеры, подобранные по программе Gene Runner 3.0. Детали проведения анализа описаны ранее (Платонова и др., 2005).

Иммуноблотинг. Электрофорез белков проводили в 10% или 8%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) с или без додецилсульфата натрия (SDS) по методу Laemmli (1970). Перенос белков из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли полусухим методом. В качестве вторых антител использовали антикроличьи (или антимышиные) козьи гамма-иммуноглобулины, конъюгированные с пероксидазой хрена. Иммунные комплексы визуализировали хемилюминесцентным методом. Количественный (ракетный) иммуноэлектрофорез. Концентрацию полипептидов ЦП определяли методом количественного иммуноэлектрофореза, как подробно описано ранее (Платонова и др., 2005). Выявление ЦП окрашиванием геля орто-дианизидином, специфическим хромогенным агентом, проводили в соответствии с методом, предложенным Owen и Smith (1961). Определение активности СОД1 проводили в геле. Активные зоны выявляли в соответствии с ранее описанным методом (Vives-Bauza et al., 2007). Измерение концентрации металлов. Кусочки ткани взвешивали, гомогенизировали 1 : 4 в смеси 5% SDS и 5% NaOH, нагревали до полного растворения. Во фракции градиента сахарозы добавляли по 100 мкл лизирующей смеси и прогревали до полного растворения материала. Биологические жидкости использовали без подготовки. Концентрацию металлов определяли методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и зеемановской коррекцией неселективного поглощения на спектрометре фирмы «Perkin-Elmer», Model 4100ZL, США. Концентрацию белка определяли по методу Лоури или Брэдфорда. В качестве количественного стандарта использовали ВSА. Статистическую обработку данных проводили по программе ANOVA, значимыми различиями считали различия Р 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения связи между обменом меди и экспрессией генов медьтранспортных белков в мозгу при различных состояниях метаболизма меди в организме был использован общий подход. В тканях и биологических жидкостях определяли концентрацию меди и железа, транспорт которого связан с обменом меди. В качестве контроля измеряли концентрацию цинка, метаболизм которого не сопряжен ни с обменом меди, ни с обменом железа. Активность генов определяли методом полуколичественного ОТ-ПЦР анализа. В исследование были взяты гены медьтранспортных белков (CTR1, АТР7А и АТР7В), внеклеточные (ЦП и ГФИ-ЦП) и внутриклеточные купроэнзимы – СОД1 и СОХ. ЦП рассматривается также и как универсальный донор меди для клеток негепатоцитарных рядов. Для сравнения состояния антиоксидантной системы был определен также уровень экспрессии гена, кодирующего СОД2, ­ марганец зависимую супероксиддисмутазу, локализованную только в матриксе митохондрий. В ряде опытов измерена относительная концентрация зрелых транскриптов гена, кодирующего предшественник -амилоидного белка (АРР), который, возможно, осуществляет внеклеточное примембранное восстановление Cu(II) в Cu(I), необходимое для ее импорта в клетки. О содержании белковых продуктов генов ЦП, CTR1 и СОД1 судили по данным полуколичественного иммуноблотинга. Данные о содержании белка СОД1 и ЦП сопоставлены с ферментативной активностью названных купроэнзимов.

1. Онтогенетические изменения метаболизма меди в отделах мозга лабораторных крыс. Мониторинг постнатальных изменений метаболизма меди проведен в отделах мозга с относительно высоким (гипофиз и гипоталамус) и относительно низким (кора, мозжечок, миндалевидное тело, гиппокамп) уровнем обмена меди, а также в клетках эпендимы (сосудистое сплетение). Работа выполнена на 5-ти подгруппах крыс (в каждой не менее 5 животных), возраст которых соответствует различным типам метаболизма меди в печени. Первую группу (новорожденные) составили животные с эмбриональным типом метаболизма меди (подгруппы 5- и 10-суточные крысы). Вторую группу (детский период) также составили две подгруппы: 20- и 30-суточные животные. В этом возрасте у крыс в печени уже произошла смена эмбрионального типа метаболизма меди, но ее концентрация в мозгу еще не достигла уровня, соответствующего взрослым животным. Третью группу (взрослые) составили молодые половозрелые крысы (~120-суточные крысы).

1.1. Изменение концентрации меди в отделах мозга крыс в течение развития. Результаты измерения концентрации меди в отделах мозга с 5-дневного возраста до 4-месячного суммированы в таблице 1. Они показывают, что в коре и гиппокампе происходит увеличение концентрации меди. В миндалевидном теле она практически одинаковая на 5-е и 120-е сутки, но заметно увеличивается в течение первых 20 дней жизни, а затем снижается. В мозжечке концентрация меди достоверно возрастает примерно в два раза.

Таблица 1. Изменение концентрации меди в отделах мозга крыс в течение развития.

Отдел мозга

Концентрация меди (нг/мг белка) в дни после рождения

5-ый

10-ый

20-ый

30-ый

120-ый

Первая группа

Вторая группа

Взрослые

Кора

21.6±6.13

25.9±1.51

32.7±8.59

24.5±1.56

24.9±3.01

Мозжечок

17.5±1.14

25.5±0.51

23.7±1.17

25.3±1.02

32.3±3.56

Гиппокамп

24.3±0.7

21.0±0.49

35.2±3.52

28.1±2.52

32.8±3.21

Миндалина

10.5±1.2

32.0±8.1

30.7±7.27

18.9±1.56

11.8±0.51

Гипофиз

47.2±3.28

31.4±2.42

48.1±7.87

35.3±1.67

43.5±3.52

Гипоталамус

91.9±8.48

96.3±17.9

103.4±7.79

42.0±2.05

55.6±0.81

*Сосудистое сплетение

42.4±7.69

134.4±4.15

100.6±7.89

42.3±2.36

2.5±0.26

Приведены средние значения по измерениям у 5-ти крыс в каждой группе. *Измерения проведены в группе из 8 крыс.

Наименьшим изменениям подвергается содержание меди в гипофизе, однако, оно достоверно выше, чем в коре, гиппокампе, мозжечке и миндалевидном теле. У новорожденных крыс самая высокая концентрация меди определяется в гипоталамусе, но в нем она, в отличие от других отделов мозга, не повышается в течение развития, а, напротив, снижается почти в два раза.

Самые заметные изменения в содержании меди в течение развития обнаружены в сосудистом сплетении. Здесь концентрация меди при рождении почти в 20 раз выше, чем у взрослых, затем она повышается и начинает снижаться после 20-го дня жизни. У взрослых удельное содержание меди в сосудистом сплетении самое низкое по сравнению с другими структурами мозга. Эти изменения сходны с теми, которые имеют место в печени при эмбриональном типе метаболизма меди и его смене на взрослый тип. Данные однозначно показывают, что в течение постнатального развития в мозгу крыс происходят регион-специфические изменения содержания меди. Они приводят к повышению концентрации меди в нервной ткани и ее снижению в клетках эпендимы.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»