WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

В 63 наблюдениях ХГ проведено ИГХ исследование. В 39 этих случаях определяли экспрессию антигенов вируса гепатита В (HBsAg, HBcAg) и неструктурного белка вируса гепатита С (NS3) на парафиновых срезах толщиной 5 мкм стрептавидин-биотиновым иммунопероксидазным методом с использованием коммерческой ИГХ системы LSAB2 (DAKO, США). В качестве первичных антител использовались моноклональные мышиные антитела к HBsAg (Novocastra Lab., Великобритания) в разведении 1/100, поликлональные кроличьи антитела к HBcAg (DAKO, Великобритания) в разведении 1/700, моноклональные мышиные антитела к NS3HCV (Novocastra Lab., Великобритания) в разведении 1/50. Для демаскировки HBsAg проводилась предварительная обработка срезов ткани протеолитическими ферментами (Proteinasa K, DAKO, США). Для демаскировки NS3HCV в ткани производилась высокотемпературная обработка срезов в цитратном буфере (рН 6,0). В каждой серии ИГХ реакций проводилось негативное контрольное исследование (один из двух серийных срезов, помещенных на предметное стекло вместо первичных антител инкубировался с фосфатным буфером рН 7,4). После проведения ИГХ реакции (согласно рекомендациям фирмы-изготовителя) срезы докрашивались гематоксилином и заключались в полистирол. В остальных 24 биоптатах печени ИГХ этиологические маркеры (HBsAg, HCcorAg, NS4-HCV) определяли на замороженных срезах модифицированным нами (Насыров Р.А., 1995 ) непрямым иммунопероксидазным методом, где в качестве первых антител использовали моноклональные антитела к HBsAg, HCcorAg, NS4-HCV производства лаборатории клеточной инженерии (руководитель – проф. А.А. Кущ) Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва).

С учетом выраженности клинико-лабораторных и морфологических проявлений изученные наблюдения были отнесены к следующим вариантам течения ХГ вирусной этиологии по В.В. Горбакову (1996, 1998): латентный, малоактивный (вялотекущий) и активный.

Оценка диагностической значимости гистологических маркеров HBV- и HCV-инфекции проведена в 63 наблюдениях, которые были разделены на две группы: первую (группу сравнения) составили 32 наблюдения с положительными сывороточными маркерами гепатотропных вирусов. Во вторую (основную) группу включили 31 наблюдение ХГ с отрицательными результатами сывороточных тестов. В группе сравнения проводилось сопоставление сывороточных, гистологических и ИГХ маркеров HBV- и HCV-инфекции, в основной – соответствующих гистологических и ИГХ признаков.

Гистологическое, гистохимическое и результаты ИГХ исследования проведены при помощи светооптического микроскопа Микмед-1. Микрофотографирование гистологических препаратов проводили при помощи цифровой камеры Nikon и Leica.

Статистическая обpаботка матеpиала выполнялась на ПЭВМ с использованием стандаpтного пакета пpогpамм пpикладного статистического анализа (Statistica for Windows v. 6.0). Для дифференциальной диагностики между ХГ-В и ХГ-С использовали также линейный дискриминантный анализ (Ким Дж.-О., Мьюллер Ч.У., Клекка У.Р., 1989). Для оценки качества полученной модели и решающего диагностического правила рассчитывали чувствительность, специфичность методов, общую точность (Власов В.В., 1988, 2001). Кpитический уpовень достовеpности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых pазличий или фактоpных влияний) пpинимали pавным 0,05.

Результаты исследования и обсуждение.

Изучение 100 наблюдений ХГ у пациентов клиники кафедры внутренних болезней № 2 ГОУВПО Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова позволило выделить ряд клинико-морфологических особенностей заболевания. Подавляющее большинство больных обследовались впервые, анамнестические сведения, указывающие на предшествовавшее поражение печени, у них, как правило, отсутствовали.

У обследованных больных терапевтического стационара ХГ практически исключительно представлен латентным и малоактивным вариантами по В.В. Горбакову (1998), частота которых составила 41,0% и 50,0% соответственно. Предположение о латентном ХВГ основывалось на наличии сывороточных маркеров HBV и/или HCV-инфекции при отсутствии отчетливых клинико-лабораторных проявлений заболевания.

Группа больных с малоактивным (вялотекущим) ХГ была самая многочисленная – 50,0% изученных наблюдений. Ведущими клиническими синдромами у больных были астено-вегетативный (88,0%) в сочетании с болевым (78,0%). Активность АлАТ превышала норму в среднем в 1,8 раза, были изменены и другие функциональные пробы печени (средняя концентрация билирубина, активность щелочной фосфатазы, тимол-вероналовая проба). Маркеры HBV и HCV-инфекции выявлены в сыворотке крови 29 (58,0%) из 50 больных.

У 9 (9,0%) больных была выраженная клиническая картина заболевания с высокой активностью АлАТ, превышавшей нормальные значения в 5–10 раз. Показатели других функциональных проб печени также характеризовались значительными сдвигами. Маркеры HBV и HCV-инфекции обнаружены в сыворотке крови у 8 из 9 (88,8%) этих больных.

Таким образом, скрытое или малосимптомное течение является характерной особенностью ХГ у больных терапевтического стационара, которые нередко госпитализируются и обследуются по поводу других заболеваний. Именно это обстоятельство служит основной причиной поздней диагностики заболевания. Подобной точки зрения придерживаются и другие исследователи (Радченко В.Г. и соавт., 2000, 2005; Никитин И.Г., Павлов Ч.С., 2001; Серов В.В., Апросина З.Г., 2004; Рахманова А.Г., 2005).

Проведенный клинико-морфологический анализ показал разницу между итоговой оценкой тяжести заболевания, полученной разными способами. Установлено, что в 31,0% наблюдений клинически латентного и малоактивного ХГ степень гистологической активности процесса варьировала от умеренной до тяжелой. В свою очередь, в 22,0% случаев клинически активного ХГ проявления гистологической активности были слабыми. Подобные несоответствия между клинической симптоматикой и тяжестью поражения печени отмечены и другими исследователями (Рогатчиков Ю.Е. и соавт., 2003; Трусова Л.А. и соавт., 2003; Скляр Л.Ф., 2004; Виноградова В.М. и соавт., 2004).

Причины подобных несовпадений результатов клинико-лабораторной и морфологической оценки тяжести ХГ изучены недостаточно. Во-первых, при их анализе необходимо учитывать общебиологические закономерности соотношений процессов повреждения и защитных реакций на разных стадиях и этапах развития болезни. Кроме того, хронические болезни, в том числе и ХГ, как правило, характеризуются волнообразным течением, в основе которого лежит чередование периодов преобладания то процессов повреждения, то защиты, что проявляется обострениями и ремиссиями заболевания (Непомнящих Д.Л., 1996; Абдурахманов Д.Т., 2002).

Во-вторых, при морфологической оценке тяжести ХГ необходимо учитывать ограничения биопсийного метода, обусловленные малым объемом пунктата печени, а также неравномерностью поражения разных отделов органа. Последнее обстоятельство было убедительно проиллюстрировано Ю.Н. Даркшевичем на гистотопографических срезах ткани печени (Комарова Д.В., Цинзерлинг В.А., 1999).

Несомненно, суждение о тяжести ХГ, основанное на учете комплекса клинико-лабораторных и морфологических проявлений заболевания, является наиболее информативным и точным. Особую ценность такой подход представляет при дифференциальной диагностике носительства HBV и HCV-инфекции и латентных форм ХГ-В и С. Понятно, что верификация ХВГ возможна только при наличии гистологических проявлений активности патологического процесса в печени. Однако при этом нельзя не учитывать ограничения биопсийной диагностики, которые обсуждались выше. Что же касается пациентов с малоактивным течением ХГ, то изучение пункционного биоптата печени приобретает еще и важное прогностическое значение, так как нередко степень повреждения ткани печени оказывается у них более значительной, чем это можно полагать на основании функциональных проб органа.

При оценке гистологической стадии ХГ установлено, что у большинства пациентов выраженность фиброза нарастала параллельно с увеличением тяжести заболевания. Однако при латентном и малоактивном течении заболевания спектр фиброзных изменений варьировал в широких пределах – от отсутствия (11,0%) до умеренного (12,0) и тяжелого фиброза (7,0%), и даже цирроза печени (4,0%). Данное обстоятельство заслуживает особого внимания, так как, по мнению В.В. Горбакова (1998), именно пациенты со скрытым и малоактивным течением ХВГ по всей вероятности являются основными «поставщиками» циррозов и ГЦК.

Несмотря на то, что сывороточные и молекулярные маркеры фиброза активно изучаются (Шапиро И.Я. и соавт., 2004; Павлов Ч.С., 2005), в повседневной клинической практике они широко не используются. Современные неинвазивные методы визуализации (УЗИ, МРТ, КТ) не дают четких критериев оценки фиброза печени, особенно на ранних этапах его развития (Павлов Ч.С., 2005). Вместе с тем, и здесь необходимо учитывать ограничения биопсийного метода диагностики, связанные с малым объемом исследуемого материала (Пинцани М., 2002). Таким образом, в настоящее время наиболее объективное представление об активности (тяжести) и стадии ХГ можно получить только в ходе комплексных клинико-лабораторных и морфологических сопоставлений.

Наличие этиологических маркеров вирусного поражения при гистологическом исследовании биоптатов печени имеет большое диагностическое значение, так как полученные данные согласуются с результатами сывороточных и ИГХ тестов в 90,6% (28 из 32) случаев.

В биоптатах печени достоверно чаще обнаруживали свидетельства наличия HBV- и смешанной HBV+HCV-инфекции, чем признаки моно-HCV-инфекции. Наиболее информативными оказались гистологические маркеры HBV-инфекции, так как они всегда подтверждались сывороточными тестами. Несовпадение в 2 (6,8%) и отсутствие в 3 (9,3%) наблюдениях гистологических маркеров HCV-инфекции выявило некоторые ограничения морфологического исследования биоптата в диагностике моно-HCV-инфекции. Эти ограничения могут быть связаны с репликацией вируса преимущественно в сыворотке крови, клетках и тканях других органов, а также мононуклеарах периферической крови (Ющук Н.Д. и соавт., 2000; Бушуева Н.В. и соавт., 2005; Zibert A. et al., 2005).

Гистологические признаки двух возбудителей обнаруживались в 2 раза чаще, чем сывороточные маркеры (32,7% и 15,6% – соответственно), причем совпадение гистологических и ИГХ маркеров отмечено в 84,6% наблюдений. Отсутствие одного из двух маркеров в сыворотке крови возможно является закономерностью в условиях взаимодействия нескольких вирусов (Радченко В.Г. и соавт., 2005; Сюткин В.Е. и соавт. 2000).

Проведенное нами дополнительное ИГХ исследование выявило, что у пациентов группы сравнения частота обнаружения смешанной инфекции в ткани печени в 3 раза выше, чем в сыворотке крови, тем самым, подтвердило значение гистологического исследования, которое оказалось более информативным в диагностике смешанной HBV+HCV-инфекции по сравнению с результатами серологического исследования.

В основной группе исследования, с отрицательными результатами сывороточных тестов в 19 из 31 (61,2%) наблюдений обнаружены гистологические признаки поражения печени гепатотропными вирусами. Однако гистологических и иммуногистохимических маркеров моно-HCV-инфекции не обнаружено. Данный факт подтверждает мнение З.Г. Апросиной (1996) о возможности серонегативности в части случаев при микст-инфекции, из-за того, что на молекулярном уровне два вируса могут ингибировать друг друга и это сопровождается нарастанием степени поражения гепатоцитов. По результатам нашего исследования тяжесть течения заболевания коррелировала с наличием гистологических признаков смешанной инфекции HBV+HCV у пациентов старших возрастных групп.

Проявления HBV-инфекции имелись в биоптатах у 48,3% больных и HBV+HCV-инфекции – у 12,9% пациентов. Экспрессию маркеров HBV-инфекции в ткани с помощью ИГХ метода в основной группе наблюдали в 38,0% случаях и HBV+HCV-инфекции – в 9,0%, что подтверждает данные гистологического исследования в 78,9% наблюдений. Некоторую гипердиагностику ХГ-В и С при исследовании биоптатов печени можно объяснить неспецифичностью большинства гистологических маркеров HBV и HCV-инфекции. Несмотря на это, в случаях отрицательных сывороточных тестов наличие даже непрямых гистологических признаков вирусного поражения является основанием для дальнейшего поиска этиологического агента.

По многочисленным данным литературы, трудности выявления маркеров гепатотропных инфекций в сыворотке крови обусловлены многими причинами, например, мутациями в геноме вируса, ведущими к изменению структуры антигенов, что препятствует их выявлению в крови стандартными тест-системами (Weiner A., 1992; Carman W.F., 1997; Koziel M., 1997; Ferrari C., 1999). Большое значение имеют низкий уровень и транзиторный характер виремии (Ющук Н.Д. и соавт., 2000; Серов В.В., Апросина З.Г., 2004; Ferau C., Schmidt M.V., 1997; Calvin Q.P., Zhang J., 2005; Chih-Lin I., Li- Ying I., Chaur-Shine W. et al., 2005), особенности иммунного ответа хозяина, а также чувствительность тест-системы и качество ее исполнения (Апросина З.Г., Игнатова Т.М., 2001). Перечисленные особенности течения ХВГ объясняют значительную частоту так называемого ХГ неясной (неустановленной) этиологии в клинической практике.

Гистологические признаки HBV-инфекции достоверно чаще определялись у пациентов с положительными сывороточными маркерами инфекции и характеризовались довольно высокой специфичностью – 91,9% и предсказательной ценностью положительного результата – 87,5%.

У больных с активной репликацией вируса (HBV ДНК в сыворотке крови) и у пациентов с отсутствием нуклеиновых кислот, различия по морфологической картине в биоптатах печени не выразительны. При этом у пациентов с отрицательными сывороточными маркерами достоверно чаще определялись гистологические признаки HBV-инфекции в ткани печени. Наличие гистологических и ИГХ признаков HBV-инфекции в сочетании с минимальной тяжестью течения заболевания и отрицательными результатами сывороточных тестов позволяет считать, что латентное течение является весьма характерной особенностью ХГ-В. Гистологические неспецифические признаки HCV-инфекции достоверно чаще сочетались с наличием HCV РНК в сыворотке, а точность предсказания HCV-инфекции по результатам гистологического исследования достигала 76,5%. Отсутствие морфологических проявлений заболевания у пациентов с маркерами HCV в сыворотке крови соответствуют данным литературы о возможной репликации HCV преимущественно вне печени (Апросина З.Г. и соавт., 2005; Ющук Н.Д. и соавт., 2000).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»