WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

МОТОВИЛОВА

Наталия Олеговна

Значение иммунологических факторов
в прогнозе эффективности циклов ЭКО
у женщин репродуктивного возраста

14.01.01 – акушерство и гинекология

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

Научные консультанты:

доктор медицинских наук

Коган Игорь Юрьевич

член-корреспондент РАМН,
доктор медицинских наук, профессор

Тотолян Арег Артёмович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта» СЗО РАМН, руководитель гинекологического отделения с операционным блоком

Беженарь Виталий Фёдорович

доктор медицинских наук, профессор

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, директор

Симбирцев Андрей Семенович

Ведущая организация: Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Защита диссертации состоится «____» июня 2012 г. в ____ часов
на заседании диссертационного совета Д 001.021.01 при ФГБУ "НИИАГ им. Д.О. Отта" СЗО РАМН (199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта" СЗО РАМН.

Автореферат разослан "___"_________________2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук

Кузьминых Татьяна Ульяновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Разработка эффективных способов преодоления бесплодия является в настоящее время важнейшей государственной медико-социальной задачей. Это обусловлено высокой частотой бесплодия, его неблагоприятным влиянием на демографическую ситуацию в стране, психологический климат в семье и социальную адаптацию супружеской пары (Кулаков В.И., 2003). Одним из направлений лечения бесплодия является применение вспомогательных репродуктивных технологий, в том числе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), частота наступления беременности и родов после которого составляют соответственно 29,1% и 21,5% (данные Европейского общества репродукции человека, 2007 г.). Повышение эффективности ЭКО связано с исследованиями, направленными на изучение регуляторных механизмов репродуктивных процессов, прогнозирование их нарушений и определение подходов к коррекции. В этом плане одно из центральных мест занимает проблема иммунологической регуляции репродуктивной функции женщины. Известно, что иммунокомпетентные клетки (макрофаги, лимфоциты) и продуцируемые ими цитокины (интерлейкины, ростовые факторы, хемокины) принимают участие в механизмах фолликулогенеза, овуляции, формирования и функционирования жёлтого тела, циклических морфофункциональных изменений эндометрия, оплодотворении и имплантации (Gleicher N., 1988; Buculmez O., Arici A. , 2000; Bellver J., 2008). К настоящему времени получены данные об особенностях системной и локальной цитокиновой регуляции плацентации, родовой деятельности, осложнений беременности (гестоза, плацентарной недостаточности, невынашивания) (Соколов Д.И., Сельков С.А., 2012, Szekeres-BarthoJ., 2002). Короткодистантный (ауто- и паракринный) характер действия цитокинов определяет особую актуальность изучения локальных механизмов их влияния на физиологические и патофизиологические процессы, связанные с репродукцией женщины. Однако исследования, посвященные роли цитокинов в фолликулогенезе при стимуляции яичников гонадотропинами в циклах ЭКО и его эффективности, единичны, а их результаты часто противоречат друг другу. Это обусловлено как особенностями дизайна разных исследований, так и свойствами самих цитокинов: их многообразием, избыточностью и полифункциональностью (Aggarwal B.B., Pocsic E., 1992). В единичных работах показано, что содержание цитокинов в яичниках, эндометрии может быть информативным предиктором эффективности экстракорпорального оплодотворения (Bonetti T.C.S. и соавт., 2010) и его осложнений (Artini P.G., 2002).

Цель исследования: изучить значение цитокинов в эффективности гонадотропной стимуляции яичников в цикле ЭКО и его исходах у женщин репродуктивного возраста с сочетанными формами бесплодия.

Задачи исследования

  1. Сравнить показатели гонадотропной стимуляции яичников и содержание гонадотропных, овариальных стероидных гормонов у больных с разными исходами циклов ЭКО.
  2. Изучить взаимосвязь гонадотропной стимуляции яичников с содержанием в них цитокинов, экспрессией хемокинов и их рецепторов в эндометрии у больных репродуктивного возраста.
  3. Выявить взаимосвязь эффективности цикла ЭКО с содержанием в фолликулярной жидкости яичников цитокинов, экспрессией хемокинов и их рецепторов в эндометрии.
  4. Разработать прогностические критерии эффективности цикла ЭКО у больных репродуктивного возраста с сочетанными формами бесплодия.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. В работе выявлена роль цитокинов в эффективности цикла ЭКО у больных репродуктивного возраста с сочетанными формами бесплодия. Впервые определено содержание широкого спектра про- и противовоспалительных цитокинов в фолликулярной жидкости яичников, а также экспрессия хемокинов и их рецепторов в эндометрии. Доказано, что большая эффективность стимуляции яичников у больных с наступившей после цикла ЭКО беременностью (количество фолликулов, ооцитов), по сравнению с таковой при неэффективном ЭКО, достигается меньшей курсовой дозой гонадотропинов. Установлено участие цитокинов в фолликулогенезе при гонадотропной стимуляции яичников. Так, выявлено, что количество растущих фолликулов, число полученных при пункции яичников ооцитов, в том числе зрелых, зависит от содержания в фолликулярной жидкости цитокинов IL-10 (интерлейкина 10), MIP-1 (макрофагального воспалительного протеина 1), RANTES (регулируемого активацией фактора, экспрессируемого и секретируемого нормальными Т-клетками), TNF (фактора некроза опухоли ), IFN (интерферона ) и GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора). Определено, что у больных с неэффективным циклом ЭКО исходное содержание IL-13 (интерлейкина 13) в фолликулярной жидкости яичников достоверно выше, чем у больных с эффективным циклом. Доказано, что с увеличением возраста больных закономерно снижается эффективность стимуляции яичников, что сопровождается усилением в них секреции провоспалительных цитокинов G-CSF (гранулоцитарного колониестимулирующего фактора), IL-1ra (рецепторного антагониста интерлейкина 1), IL-7 (интерлейкина 7), IL-9 (интерлейкина 9) и PDGF ВВ (фактора роста тромбоцитов). Определено, что с увеличением возраста больных происходит снижение биометрических показателей развития эндометрия во время переноса эмбрионов в полость матки и меняется чувствительность эндометрия к хемокинам, что проявляется увеличением экспрессии в нём рецептора хемокинов CCR1 (рецептор 1 хемокинов) и снижением – CCR3 (рецептор 3 хемокинов). Обнаружено, что усиление секреции в яичнике провоспалительных цитокинов (GМ-CSF, IFN, RANTES) может являться одним из механизмов неблагоприятного влияния стимуляции яичников гонадотропинами на процесс оплодотворения и показатели раннего развития эмбриона.

Практическая значимость работы. В исследовании определены клинические, гормональные и иммунологические факторы, позволяющие прогнозировать исход цикла ЭКО у больных репродуктивного возраста с сочетанными формами бесплодия. Установлено, что учёт возраста больной, наличия трубно-перитонеального фактора бесплодия, содержания в крови свободного тестостерона может быть использован для прогноза наступления беременности после цикла ЭКО. Доказано, что в прогнозе эффективности цикла ЭКО имеет значение содержание в фолликулярной жидкости стимулированных яичников цитокинов IL-2, IL-4, IL-9, IL-13, IL-1ra, TNF и GM-CSF.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Показатели гонадотропной стимуляции яичников в цикле ЭКО у больных с сочетанными формами бесплодия зависят от содержания в фолликулярной жидкости цитокинов: IL-4, IL-10, IL-15, эотаксина, MIP-1, RANTES, ТNF, IFN и GM-CSF.
  2. Увеличение возраста больных сопровождается снижением эффективности гонадотропной стимуляции яичников, усилением секреции в яичниках провоспалительных цитокинов, уменьшением толщины эндометрия во время переноса эмбрионов в полость матки и изменением его чувствительности к хемокинам.
  3. Эффективность цикла ЭКО зависит от продуктивности стимуляции яичников, толщины эндометрия во время переноса эмбрионов и содержания в фолликулярной жидкости яичников цитокина IL-13.

Апробация работы и внедрение в практику. Результаты исследования были представлены на научно-практической конференции «Репродуктивные технологии сегодня и завтра», Санкт–Петербург, сентябрь 2011; на научно-практическом семинаре «Актуальные вопросы гинекологической эндокринологии», Санкт-Петербург, ноябрь 2011 года. Основные положения диссертации внедрены в работу Центра планирования семьи и репродукции Пушкинского района при СПб ГБУЗ «Женская консультация № 44» и отделения ВРТ ГБУЗ «Мариинская больница», в учебный процесс кафедры акушерства и гинекологии СПб ГМУ им. акад. И.П. Павлова.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 4 – в рецензируемых научных журналах и изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, описания и обсуждения результатов собственных исследований, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 39 отечественных и 218 зарубежных источников. Материалы диссертации изложены на 161 странице машинописного текста, иллюстрированы 30 таблицами и 36 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Обследовано 79 женщин репродуктивного возраста, которые составили следующие группы: основную (n=36), сравнения (n=36) и контрольную (n=7). Исследование проводилось на базе Центра планирования и репродукции при СПб  ГБУЗ «Женская консультация № 44» Пушкинского района. Критериями включения в основную группу являлись: возраст 2538 лет; бесплодие (эндокринное, трубно-перитонеальное, сочетанное); программа ЭКО; стимуляция яичников препаратами гонадотропинов; наступление беременности после настоящей программы ЭКО (визуализация плодного яйца при ультразвуковом исследовании через 3 недели после переноса эмбрионов). Критерии включения в группу сравнения: возраст 25-38 лет; бесплодие (эндокринное, трубно-перитонеальное, сочетанное); программа ЭКО; отсутствие беременности после настоящей программы ЭКО. Критерии включения в контрольную группу: возраст 25-32 года; наличие беременности, закончившейся родами, в анамнезе. Контрольную группу составили пациентки, принимающие участие в программе «Донорство ооцитов». Критерии исключения для основной группы и группы сравнения были общими: гипер- и гипогонадотропная овариальная недостаточность; удаление одного или обоих яичников в анамнезе; тяжелые степени астенотератозооспермии, азооспермия; единственная причина бесплодия –мужской фактор; ожирение II-III степени.

Всем женщинам проводили клиническое обследование, которое включало: сбор анамнеза, первичный осмотр, гинекологическое обследование. При гормональном исследовании радиоиммунным и иммуноферментным методами с использованием стандартных наборов производилось определение содержания в крови на 2-3 день менструального цикла гонадотропных гормонов (ФСГ, ЛГ), эстрадиола, пролактина, свободного тестостерона; на 19-23 день цикла – прогестерона; независимо от дня цикла – антимюллерова гормона. Ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза проводили на аппарате X8 (OLIMPUS, Япония) с использованием трансвагинального датчика с частотой 7,5 МГц. УЗИ проводили перед началом стимуляции яичников, в процессе мониторинга роста фолликулов при гонадотропной стимуляции яичников, пункции яичников и переноса эмбрионов в полость матки, а также через 3 недели после переноса эмбрионов с целью диагностики беременности. При УЗИ определяли биометрические параметры матки, состояние миометрия, толщину эндометрия, размеры яичников, количество и средний диаметр фолликулов. Всем больным в цикле, который предшествовал процедуре ЭКО, проводили биопсию эндометрия в лютеиновую фазу с последующим гистологическим исследованием полученного материала и определением в нём экспрессии хемокинов и их рецепторов. При микроскопическом исследовании оценивали показатели спермограммы, морфологические особенности ооцитов, качество оплодотворения и развитие эмбрионов (частоту дробления). Качественным оплодотворением считали визуализацию двух пронуклеусов в течение первых суток от его начала. За частоту дробления принимали долю зигот на 2 сутки развития. При оценке морфологии сперматозоидов придерживались критериев Крюгера (1986 г.). С помощью пункции фолликулов получали ооциты и фолликулярную жидкость для последующего определения в ней содержания цитокинов, хемокинов и факторов роста. При этом исключалась контаминация фолликулярной жидкости кровью. Перенос эмбрионов осуществлялся на 3-й или 5-й день развития эмбрионов.

Иммунологическое обследование пациенток включало определение уровня цитокинов в фолликулярной жидкости методом мультиплексного анализа белков (MCP-1 (моноцитарного хемотаксического протеина 1), MIP-1, MIP-1, RANTES, эотаксина, IP-10 (интерферон-индуцируемого протеина 10), IL-8, фракталкина, TNF, IL-1, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15, IL-10, IL-1ra) и определение методом PCR в биоптатах эндометрия экспрессии мРНК хемокинов (MCP-1, MIP-1, MIP-1, RANTES, эотаксина, IP-10, IL-8, фракталкина) и их рецепторов (CXCR1, 2, 3, 4; CX3CR1; CCR1, 3, 4, 5, 7).

Статистическая обработка данных выполнена на персональном компьютере с использованием программной системы STATISTICA for Windows 10.0. Использованы методы анализа средних тенденций и линейного корреляционного анализа; рассчитывались коэффициенты корреляции Спирмена как мера линейной зависимости признаков, проведен факторный анализ, сравнение групп с использованием критерия Манна-Уитни, метод Краскела-Уоллиса, а также дискриминантный анализ для выделения группы переменных, оказывающих максимальное влияние на результат лечения. Для исследования зависимости между качественными переменными были использованы таблицы сопряженности и точный критерий Фишера (в случае таблиц 22), -квадрат. Во всех случаях статистически значимыми считались различия при p<0,05.

Результаты исследования

Клиническая характеристика больных

Средний возраст женщин в основной группе составил 32±4,3 года,  длительность бесплодия – 6,2±3,7 года. 47,2% больных данной группы имели в прошлом беременности (13,9% – роды, 30,5% – искусственные аборты, 2,8% – самопроизвольные аборты, 2,8% – неразвивающиеся беременности). В структуре сопутствующей гинекологической заболеваемости у пациенток основной группы выявлены: хронический сальпингоофорит (36,1%), миома матки (11,1%), наружный генитальный эндометриоз I-II cтепени тяжести (22,2%), аденомиоз (5,5%). 36,1% пациенток основной группы перенесли в анамнезе диагностическую и/или операционную лапароскопию, 27,8% – диагностическую и/или операционную гистероскопию.

Средний возраст женщин в группе сравнения составил 33,7±4,2 лет, длительность бесплодия – 5,7±3,2 года. 61,1% больных данной группы в прошлом имели беременности (27,8% – срочные роды, 16,7% – эктопическую беременность, 44,4% – искусственный аборт, 8,3% – самопроизвольный аборт, 16,7% – неразвивающуюся беременность). В структуре сопутствующей гинекологической заболеваемости у пациенток группы сравнения выявлены: хронический сальпингоофорит (58,3%), миома матки (16,4%), наружный генитальный эндометриоз I-II степени тяжести (25,0%), аденомиоз (13,9%). 47,2% пациенток группы сравнения перенесли в анамнезе диагностическую и/или операционную лапароскопию, 55,5% – диагностическую и/или операционную гистероскопию.

Контрольную группу составили здоровые женщины, принявшие участие в программе «Донорство ооцитов». Все они состояли в браке, в анамнезе имели роды, закончившиеся рождением здорового ребёнка. Средний возраст пациенток составил 29,7±3,9 лет.

Эффективность стимуляции яичников
у больных основной группы и группы сравнения

У пациенток основной группы (положительный результат ЭКО) общая курсовая доза гонадотропинов была в 1,2 раза меньше таковой у больных группы сравнения (отрицательный результат ЭКО): 1903±613 МЕ и 2204±634 МЕ соответственно (р<0,05). Стимуляция яичников гонадотропинами у больных основной группы была более эффективной – количество растущих фолликулов, ооцитов, полученных при пункции яичников, в том числе зрелых, достоверно превышало таковые у больных группы сравнения: 14,3±5,8 и 10,1±7,1 (р<0,01); 13,6±5,6 и 9,1±6,9 (р<0,01); 11,6±4,6 и 7,9±5,7 (р<0,01) соответственно. Толщина эндометрия во время переноса эмбрионов у больных основной группы была выше таковой у больных группы сравнения: 11,3±1,2 мм и 8,8±3,7 мм соответственно (р<0,01). Полученные нами результаты свидетельствуют о прогностическом значении показателей эффективности стимуляции яичников, а также развития эндометрия на эффективность цикла ЭКО.

Содержание гипофизарных и яичниковых гормонов в крови
у больных обследованных групп

У больных основной группы (эффективный цикл ЭКО) концентрация в крови гонадотропных гормонов, пролактина и эстрадиола не отличалась от таковой у больных группы сравнения (неэффективный цикл): ФСГ – 6,36±1,64 мМЕ/л и 7,3±2,73 мМЕ/л соответственно, ЛГ – 5,01±2,72 мМЕ/л и 5,86±2,79 мМЕ/л соответственно, пролактин – 284,2 мМЕ/л и 203,8 мМЕ/л соответственно, эстрадиол – 90,8±66,2 и 82,4±78,9 пмоль/л соответственно.

Содержание свободного тестостерона в крови у больных с бесплодием и эффективным циклом ЭКО (2,3±1,7 нмоль/л) было в 1,4 раза выше такового при неэффективном цикле ЭКО (1,61±1,5 нмоль/л), p<0,05. Уровень свободного тестостерона в крови больных положительно коррелирует с количеством зрелых ооцитов, полученных при пункции яичников (Rс=0,30; p<0,05).

Полученные результаты обусловлены важным значением андрогенов в стероидо- и фолликулогенезе.  Андрогены, продуцируемые тека-клетками и клетками стромы яичника, являются субстратом для синтеза эстрогенов, вовлечены в процесс роста преантральных и малых антральных фолликулов, способствуя увеличению ФСГ-чувствительности их клеток (Hiller S., 1999). Низкий уровень тестостерона в крови у больных ассоциируется в программах ЭКО с увеличением курсовой дозы гонадотропинов, с продолжительностью стимуляции, с уменьшением числа ооцитов, полученных при пункции яичников, с нарушением оплодотворения и снижением частоты наступления беременности (Мassin N., 2004; Kim C.H., 2007). По данным некоторых исследований (Краснопольская К.В., 2010), включение андроген-содержащих препаратов в протоколы стимуляции яичников в циклах ЭКО у больных со сниженным содержанием тестостерона в крови, приводит к увеличению её эффективности.

Содержание свободного тестостерона коррелирует положительно – с экспрессией в эндометрии CXCR2 (одного из специфических рецепторов для IL-8) (Rc=0,39, р<0,05) и отрицательно – с содержанием в фолликулярной жидкости IL-4 (Rc=-0,29, р<0,05). Обнаруженные взаимосвязи обусловлены влиянием стероидных гормонов на функцию иммунокомпетентных клеток (ИКК), в частности макрофагов, и продукцию ими провоспалительных цитокинов. Считается, что гормональный контроль может осуществляться как при непосредственном связывании гормона с соответствующим рецептором, так и быть опосредованным аутокринной и паракринной продукцией цитокинов и ростовых факторов (Hunt и соавт., 1998; Zhang и соавт., 2003; Das и соавт., 2007). Полученные нами данные подтвердили представления о гормональной регуляции синтеза аутокринных и паракринных иммунологических факторов.

Зависимость эффективности стимуляции яичников гонадотропинами от уровня цитокинов в фолликулярной жидкости

С помощью корреляционного анализа определено, что количество растущих при гонадотропной стимуляции фолликулов имеет достоверную прямую корреляционную зависимость от содержания в фолликулярной жидкости цитокинов: IL-10 (Rс=0,31; р<0,05), IFN (Rс=0,32; р<0,05), MIP-1 (Rс=0,32; р<0,05), RANTES (Rс=0,38; р<0,01) и TNF (Rс=0,27; р<0,05). Выявлено, что имеется прямая корреляционная зависимость между количеством ооцитов, полученных при пункции яичников, и содержанием в них цитокинов IL-10, IFN, GM-CSF, MIP-1, RANTES и TNF (табл. 1). У больных с отрицательным результатом цикла ЭКО уровень IL-13 в фолликулярной жидкости яичников во время стимуляции в 2 раза выше такового у больных с наступившей после ЭКО беременностью (рис. 1).

Таблица 1

Корреляционная зависимость между количеством ооцитов, полученных при пункции яичников, и содержанием в фолликулярной жидкости цитокинов

Количество

ооцитов

Цитокин

Rc

Р

IL-10

0,27

<0,05

IFN

0,28

<0,05

GM-CSF

0,28

<0,05

MIP-1

0,29

<0,05

RANTES

0,35

<0,01

TNF

0,28

<0,05

С помощью корреляционного анализа была выявлена достоверная взаимосвязь между уровнями цитокинов в фолликулярной жидкости. Так, содержание IL-10 коррелировало с концентрацией IL-6 (Rc=0,76; р<0,0001), эотаксина (Rc=0,62, р<0,0001), MCP-1 (Rc=0,62, р<0,0001) и G-CSF (Rc=0,56; р<0,0001), а содержание IL-2 – с GM-CSF (Rc=0,59; р<0,0001) и IL-15 (Rc=0,78; р<0,0001), что может свидетельствовать о сходных клеточных источниках синтеза указанных факторов в тканях яичника.

Рис. 1. Содержание IL-13 в фолликулярной жидкости яичников у обследованных лиц

* – р<0,05 по сравнению с содержанием в основной группе

Полифункциональные цитокины IL-10, IL-4, IL-13 относят к цитокинам, характерным для так называемого Th-2 иммунного ответа, доминирующего при нормальном течении беременности. IL-10 и IL-4 обладают выраженным противовоспалительным эффектом, регуляторными свойствами в отношении цитотоксических и хелперных Т-лимфоцитов, NK-клеток, В-лимфоцитов и дендритных клеток. IL-10 способен также ингибировать апоптоз клеток, индуцированный ТNF или IFN (Moore и соавт., 2001). IL-13 продуцируется преимущественно активированными Т-клетками и является мощным модулятором активности моноцитов и В-клеток, не оказывая, в отличие от IL-4, прямого биологического влияния на Т-клетки. Кроме этого существуют данные о способности IL-13 оказывать ингибирующий эффект на продукцию других цитокинов, стимулирующих начало воспалительного процесса (Yamauchi A., Bloom E.T., 1995).

Возрастание продукции цитокинов, хемокинов и ростовых факторов в яичниках при их стимуляции, вероятно, обеспечивается высоким содержанием и активацией в них ИКК. Кроме этого, секреция цитокинов обеспечивается гранулезными клетками растущих фолликулов. TNF, IFN, GM-CSF вовлечены в развитие и рост фолликула, сигнальное взаимодействие между ооцитом и окружающими его соматическими (гранулезными) клетками, баланс процессов пролиферации и апоптоза клеток фолликула, регулируют ангиогенез и синтез стероидных гормонов в яичнике (Kaipiaand, Hsuen, 1997; Bornstein и соавт., 2004; Knightand, Glister, 2006; Wu и соавт., 2004). ТNF и IFN через активацию проапоптотических Bax-белков, протеинкиназы  С или каспаз могут индуцировать апоптоз клеток фолликула. Синтезируемые в яичниках хемокины (RANTES, эотаксин, MIP-1), обладая хемоаттрактивным эффектом, привлекают в ткани яичника и активируют ИКК, которые, в свою очередь, секретируют цитокины, хемокины и факторы роста, обеспечивая избыточность цитокиновой регуляции фолликулогенеза.

Изученные в исследовании цитокины могут регулировать процесс ангиогенеза в яичнике. Так, ТNF и GM-CSF, непосредственно или посредством индукции VEGF (сосудисто-эндотелиальный фактор роста), принимают участие в миграции, пролиферации эндотелиальных клеток, формировании капиллярных трубок и базальной мембраны. При этом ТNF, IL-10 могут оказывать и антиангиогенный эффект (Соколов Д.И., Сельков С.А., 2012 г., Choi и соавт., 2002).

Таким образом, стимуляция яичников гонадотропинами сопровождается ростом фолликулов, рекрутированием и активацией иммунокомпетентных клеток с индукцией противовоспалительных (IL-4, IL-10, IL-13), провоспалительных цитокинов (IFN; GM-CSF; TNF) и хемокинов (MIP-1; RANTES), что, вероятно, необходимо для поддержания баланса апоптоза и пролиферации клеток гранулезы, регуляции ангиогенеза и стероидогенеза в яичниках.

Зависимость эффективности стимуляции яичников гонадотропинами от возраста больных

С увеличением возраста больных закономерно снижается количество растущих фолликулов (Rс=-0,32; р<0,05); полученных во время пункции яичников ооцитов (Rс=-0,33; р<0,01), в том числе зрелых (Rс=-0,31; р<0,05). Это согласуется с данными других исследователей о снижении активности процессов фолликуло- и оогенеза, частоты наступления беременности с увеличением возраста женщин (Назаренко Т.А., Мишиева Н.Г., 2010). Данные процессы обусловлены морфофункциональными изменениями яичников у женщин старшего возраста, снижением их овариального резерва, увеличением частоты анеуплоидии ооцитов, что может явиться одной из причин низкой частоты имплантации (Plachot M. и соавт., 1988). Кроме физиологического увеличения частоты элиминации примордиальных фолликулов в старшем репродуктивном возрасте, факторами, приводящими к снижению эффективности гонадотропной стимуляции яичников у обследованных больных, могли являться сопутствующие гинекологические заболевания (хронический сальпингоофорит, наружный генитальный эндометриоз), перенесённые оперативные вмешательства на органах репродуктивной системы.

Одним из механизмов нарушения фолликуло- и оогенеза является изменение цитокиновой регуляции этих процессов. С увеличением возраста пациенток происходит увеличение содержания в фолликулярной жидкости яичников провоспалительных цитокинов: IL-1ra, IL-7, IL-9, G-CSF и РDGF BB (табл. 2). Возможно, что увеличение содержания провоспалительных цитокинов оказывает негативное влияние на гранулёзные клетки, комплекс ооцит-кумулюс, качество ооцита и является одним из механизмов снижения эффективности циклов ЭКО. Действительно, согласно некоторым исследованиям, уменьшение овариального резерва, ассоциированное с возрастом женщины, сопровождается активацией апоптоза гранулёзных клеток фолликула (Seifer D.B. и соавт, 1996). Выявленное нами усиление экспрессии тромбоцитарного фактора роста в яичнике может быть обусловлено активацией синтеза провоспалительных цитокинов. W. Freidman  и соавт. (1997) также обнаружили повышение содержания ангиогенного протеина (фактора роста эндотелия) в фолликулярной жидкости яичников у женщин со сниженным овариальным резервом.

С увеличением возраста больных наблюдалось достоверное снижение толщины эндометрия во время переноса эмбрионов (Rс=-0,33; р<0,05 ). Это может быть обусловлено как увеличением частоты переноса эмбрионов на 3й день развития, так и возрастными морфофункциональными изменениями эндометрия.  С увеличением возраста больных изменяется чувствительность эндометрия к хемокинам, что проявлялось в увеличении в нём экспрессии рецептора хемокинов CCR1 и снижении – рецептора CCR3 (табл. 2).

Таблица 2

Корреляционная зависимость содержания цитокинов
в фолликулярной жидкости яичников и экспрессии рецепторов хемокинов
в эндометрии от возраста больных с бесплодием

Возраст

больных

Цитокин (фолликулярная жидкость)

Р

IL-1ra

0,31

<0,01

IL-7

0,33

<0,01

IL-9

0,28

<0,05

G-CSF

0,33

<0,01

РDGF-BB

0,41

<0,01

мРНК (эндометрий)

CCR1

0,41

<0,05

CCR3

-0,42

<0,05

Результаты анализа взаимосвязи между содержанием цитокинов
в фолликулярной жидкости яичников, качеством ооцитов и показателями раннего развития эмбриона

Выявлена достоверная отрицательная корреляционная зависимость между качеством оплодотворения, частотой дробления эмбрионов с содержанием в фолликулярной жидкости цитокинов GM-CSF, IFN и RANTES и положительная – между количеством перенесенных эмбрионов и содержанием в фолликулярной жидкости IL-15 (табл. 3).

Таблица 3

Зависимость между качеством оплодотворения, показателями раннего развития эмбриона и содержанием в фолликулярной жидкости цитокинов

Показатель

Цитокин

Rc

Р

Качество оплодотворения, %

GM-CSF

-0,29

<0,05

Частота дробления, %

IFN

-0,28

<0,05

RANTES

-0,26

<0,05

Количество перенесенных
в полость матки эмбрионов

IL-15

0,26

<0,05

Полученные данные свидетельствуют о том, что усиление секреции в яичнике провоспалительных цитокинов может быть одним из механизмов неблагоприятного влияния стимуляции яичников гонадотропинами на ооцит. В настоящее время предполагается, что стимуляция яичников, её режимы влияют на «качество» ооцита, потенции его к оплодотворению и темпы раннего развития эмбриона (Mehta R.H., 2001; Canto M.B., 2006). Негативную роль могут играть высокие концентрации в крови эстрадиола, а также фармакологические препараты, использующиеся во время стимуляции яичников (гонадотропины, агонисты и антагонисты гонадотропин-рилизинг гормона) (Gordon U.D., 2001; Lisi F., 2005). Полученные результаты подтвердили имеющиеся фундаментальные представления о том, что взаимодействие между ооцитом и соматическими клетками яичника являются критическим для нормального течения оогенеза, оплодотворения и раннего развития эмбриона.

Заключительным этапом работы была разработка с помощью дискриминантного анализа критериев прогнозирования эффективности цикла ЭКО. Были выявлены 3 группы факторов, позволяющие прогнозировать наступление беременности после цикла ЭКО. К 1-й группе факторов относятся клинические (возраст, индекс массы тела больных, наличие трубно-перитонеального фактора бесплодия), ко 2-й – гормональные (содержание в крови свободного тестостерона и прогестерона), к 3-й – иммунологические (содержание в фолликулярной жидкости яичников цитокинов IL-2, IL-4, IL-9, IL-13, IL-1ra, TNF и GM-CSF), причем наиболее важным прогностическим значением обладает уровень IL-13.

Таким образом, в ходе настоящего исследования выявлено значение цитокинов в эффективности цикла ЭКО у больных репродуктивного возраста с сочетанными формами бесплодия и определены клинические, гормональные и иммунологические факторы, позволяющие прогнозировать его исход.

ВЫВОДЫ

  1. У больных 19-38 лет с сочетанными формами бесплодия, у которых цикл ЭКО завершился наступлением беременности, при гонадотропной стимуляции яичников количество растущих фолликулов и ооцитов в 1,5 раза, а толщина эндометрия во время переноса эмбрионов в полость матки в 1,3 раза больше по сравнению с таковыми у больных с неэффективным циклом.
  2. У больных с эффективным циклом ЭКО содержание в крови свободного тестостерона в 1,4 раза выше такового при неэффективном цикле ЭКО (2,3±1,7 и 1,6±1,5 нмоль/л соответственно, p<0,05); при этом уровень свободного тестостерона коррелирует положительно – с количеством зрелых ооцитов, полученных при пункции яичников; экспрессией в эндометрии CXCR2 и CCR3; отрицательно – с содержанием в фолликулярной жидкости IL-4.
  3. Эффективность стимуляции яичников гонадотропинами зависит от концентрации цитокинов в фолликулярной жидкости; между количеством растущих фолликулов, ооцитов и содержанием в фолликулярной жидкости IL-10, IL-15, эотаксина, MIP-1, RANTES, ТNF, IFN и GM-CSF имеется прямая взаимосвязь.
  4. Увеличение возраста больных с бесплодием сопровождается снижением эффективности стимуляции яичников гонадотропинами; возрастанием содержания в фолликулярной жидкости цитокинов G-CSF, IL-1ra, IL-7, IL-9, тромбоцитарного фактора роста (PDGF ВВ) и изменением чувствительности эндометрия к хемокинам (повышением экспрессии рецепторов ССR1 и снижением – ССR3).
  5. У больных с отрицательным результатом цикла ЭКО уровень IL-13 в фолликулярной жидкости яичников во время стимуляции в 2 раза выше такового у больных с наступившей после ЭКО беременностью.
  6. Качество оплодотворения отрицательно коррелирует с уровнем IFN, RANTES и GM-CSF в фолликулярной жидкости яичников.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. К информативным клинико-анамнестическим и гормональным факторам, определяющим исход цикла ЭКО у больных репродуктивного возраста с сочетанными формами бесплодия, относят: а) возраст больной; б) индекс массы тела; в) наличие трубно-перитонеального фактора бесплодия; г) уровень свободного тестостерона в крови; д) содержание прогестерона в крови на 20-22 день менструального цикла, предшествующего ЭКО.
  2. Для определения прогноза исхода цикла ЭКО рекомендуется определение в фолликулярной жидкости яичников цитокинов IL-2, IL-4, IL-9, IL-13, IL-1ra, TNF и GM-CSF.
  3. С целью определения вероятности наступления беременности после цикла ЭКО рекомендуется рассчитывать следующий прогностический индекс:

D0=-0,81494Возраст+0,146218(процент дробления)–0,24226G-CSF+ +0,188225прогестерон+0,40203IL-9+20,47004IL-4–0,17025IL-13+1,775071 IL-2–1,70697TNF–4,13941GM-CSF+0,920219свободный тестостерон+ 7,771985,

где G-CSF – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, IL – интерлейкин, TNF – фактор некроза опухолей, GM-CSF – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор. При D>0 – прогнозируется наступление беременности после цикла ЭКО; при D<0 – прогнозируется отрицательный результат лечения. Чувствительность теста – 93%; специфичность – 89%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Роль иммунных факторов в функционировании репродуктивной системы женщины / Н.О. Мотовилова, А.Н. Буйнова, А.А. Доценко, А.Ю. Грязнов // Вестник уральской медицинской академической науки. 2010. № 2/1. С. 57-58.
  2. Мотовилова, Н.О. Роль иммунных факторов в функционировании репродуктивной системы / Н.О. Мотовилова, И.Ю. Коган, Арег А. Тотолян // Уральский медицинский журнал. 2010. № 4. С. 117-121.
  3. Исследование клинически значимых генетических полиморфизмов у пациенток с неудачными попытками ЭКО / А.В. Иванов, А.Н. Буйнова, Н.О. Мотовилова, А.В. Куренков // Материалы XXI Международной конференции РАРЧ « Репродуктивные технологии сегодня и завтра». – СПб, 2011. – С. 29-30.
  4. Мотовилова, Н.О. Секреция колониестимулирующих факторов в яичниках у больных с бесплодием в цикле ЭКО / Н.О. Мотовилова, И.Ю. Коган, Арег А. Тотолян // Журнал акушерства и женских болезней. 2012. вып. 3. С. 36-40.
  5. Роль некоторых цитокинов в эффективности лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения / Н.О. Мотовилова, И.Ю. Коган, К.А. Сысоев, А.Н. Буйнова, А.Ю. Грязнов, Арег А. Тотолян // Медицинская иммунология. 2012. Т. 14, № 4-5. С. З73-382.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВРТ – вспомогательные репродуктивные технологии

ИКК – иммунокомпетентные клетки

ЛГ – лютеинизирующий гормон

мРНК – митохондриальная рибонуклеиновая кислота

ФСГ – фолликулостимулирующий гормон

ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение

CXC – -хемокины

СХ3С - -хемокины

СС – -хемокины

CXCR – рецепторы -хемокинов

CX3CR - рецепторы -хемокинов

ССR – рецепторы -хемокинов

G-CSF – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

GM-CSF – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

Ig - иммуноглобулин

IFN –интерферон

IL – интерлейкин

IL 1ra – рецепторный антагонист интерлейкина 1

IP-10 – интерферон-индуцируемый протеин 10

MCP 1 – моноцитарный хемотаксический протеин 1

MIP 1 – макрофагальный воспалительный протеин 1

PDGF BB – фактор роста тромбоцитов

RANTES – регулируемый активацией фактор, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками

Rс - коэффициент Спирмена

TNF – фактор некроза опухоли

VEGF – сосудисто-эндотелиальный фактор роста




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.