WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ЕПИМАХОВА

Елена Викторовна

ВЛИЯНИЕ  НЕЙРОМЕТАБОЛИЧЕСКОГО  ПРОТЕКТОРА

НА АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

БОЛЬНЫХ  АЛКОГОЛИЗМОМ И  ЗДОРОВЫХ  ЛИЦ

14.03.06-Фармакология, клиническая фармакология

14.03.03-Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Томск–2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт психического здоровья» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН

Бохан Николай Александрович

доктор медицинских наук,

профессор

Иванова Светлана Александровна

Официальные оппоненты:

Чердынцева Надежда Викторовна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория иммунологии, заместитель директора по научной работе, руководитель лаборатории.

Данилец Марина Григорьевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследо-вательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, отдел экспериментальных биологических моделей, руководитель отдела.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук.

Защита состоится «___»________________ 2012 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, Томск, пр. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан «_____» октября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук

Амосова Евдокия Наумовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Алкоголизм – одна из актуальнейших социальных и медицинских проблем, стоящих перед современным обществом [Бохан Н. А., Семке В. Я., Мандель А. И., 2006; Иванец Н. Н., Анохина И. П., Винникова М. А., 2008]. Количество публикаций, посвященных изучению различных аспектов злоупотребления алкоголем, не уменьшается; напротив, исследования в этой области в последние годы расширились и ведутся по различным направлениям с использованием междисциплинарных методов и подходов.

В патологический процесс формирования алкогольной зависимости вовлечены различные механизмы, связанные с нарушением функционирования в основных гомеостатических системах организма [Анохина И. П. и др., 1998; Панченко л. Ф. и др., 2008; Adinoff B. et al., 1998; Fernandez-Sol J., 2007]. На сегодняшний день представлено множество работ, доказывающих роль апоптоза – запрограммированной клеточной гибели – в  патогенезе алкоголь-индуцированного поражения органов [Brooks P. J., 2000; Spirodopolous I. et al., 2001; Reed D. J., 2004; Rodriguez D. A., 2004; Haorah J. et al., 2008; Antonio A. et al., 2008; Szuster-Ciesielska A. et al., 2008; Sheth D. S. et al., 2009; Yan D. et al., 2010]. Исследования, выполненные на моделях животных, показали, что этанол повреждает развивающуюся ЦНС за счет сокращения нейронов в коре головного мозга, мозжечке, гиппокампе, спинном и среднем швах [Tajuddin N. F., 1999; Chen W. J. et al., 2001; Jacobs J. S. et al., 2001; Moulder K. L. et al., 2002]. Имеются данные, свидетельствующие о том, что этанол усиливает апоптотическую нейродегенерацию в мозге эмбрионов крыс и в гепатоцитах взрослых особей [Ikonomidou C. et al., 2000]. Нейробиологические исследования показали, что мозг людей, злоупотребляющих этиловым спиртом, обеднен как белым, так и серым веществом [Brooks P. J., 2000]. Этанол-индуцированная клеточная гибель лежит в основе развития коморбидных расстройств, выявляемых у больных алкоголизмом, в том числе печеночной и сердечной недостаточности, миопатии, нейродегенеративных расстройств и др. [Wu D. et al., 2006]. Однако вне поля зрения остаются вопросы программированной клеточной гибели лимфоцитов периферической крови при алкоголизме, в то время как изменение уровня апоптоза мононуклеаров может приводить к серьезным патологическим нарушениям.

Несовершенство лекарственной терапии аддиктивных расстройств делает необходимым изыскание и разработку новых, более эффективных фармакологических средств профилактики и лечения аддикций. В последние годы показана перспективность использования препаратов, обладающих разносторонними спектрами действия [Эпштейн О. И. и др., 2003; Ветлугина Т. П. др., 2005; Бишева И. В. др., 2007; Беленичев И. Ф. др., 2009; Воронина Т. А., 2009 и др.]. Одним из возможных таких препаратов является нейропротектор кортексин (полипептидный препарат, выделенный из мозга телят), который обладает тканеспецифическим, регуляторным и восстановительным действиями [Скоромец Т. А, 2004; Лебедев А. А. и др., 2009], повышает эффективность энергетического метаболизма нейронов, регулирует процесс метаболизма нейромедиаторов и перекисного окисления в коре головного мозга, препятствует образованию избыточного количества свободных радикалов [Скороходов А. П. и др., 2003]. Препарат успешно применяется в терапии различных неврологических и психических расстройств. Имеются единичные исследования, показывающие, что включение кортексина в схему терапии аддиктивных расстройств приводит к снижению уровня невротизации и тревоги, улучшению самочувствия пациентов [Востриков В. В. и др., 2011]. В литературе отсутствуют данные по оценке влияния исследуемого метаболического протектора на биологические показатели, в том числе запрограммированную клеточную гибель у больных алкоголизмом. В то время как изучение параметров основных гомеостатических систем несет важную биологическую информацию и является целесообразным для более полной характеристики лекарственных средств и механизма их действия. В связи с вышеизложенным были сформулированы цель и задачи диссертационной работы.

Цель исследования: изучить влияние нейрометаболического протектора на показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных алкоголизмом и здоровых лиц.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови на клеточном и рецепторном уровнях у больных алкоголизмом.

2. Исследовать влияние этанола, гипертермии и преднизолона на показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови больных алкоголизмом и здоровых лиц в нагрузочных пробах in vitro.

3. Оценить влияние кортексина на показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и на модели клеток нейробластомы в экспериментальных условиях in vitro при действии этанола и  индуцированного окислительного стресса.

4. Изучить влияние нейропротектора кортексина на запрограммированную гибель клеток периферической крови у больных алкоголизмом в  процессе фармакотерапии постабстинентного синдрома.

Научная новизна исследования

В результате проведенного комплексного исследования показано, что у лиц, больных алкоголизмом, наблюдается повышенная апоптотическая активность лимфоцитов на рецепторном и клеточном уровнях, проявляющаяся в усилении экспрессии СD95, увеличении Annexin V+-клеток и повышении содержания лимфоцитов с морфологическими признаками фрагментации ядра. У лиц с алкогольной зависимостью выявлена корреляция экспрессии маркера апоптоза СD95 с концентрацией стресс-реализующего гормона кортизола.

Впервые оценено влияние модуляторов (гипертермии, преднизолона) на реализацию апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных алкоголизмом в нагрузочных пробах in vitro. Показано, что индукторы апоптоза (гипертермия и преднизолон) in vitro вызывают усиление клеточной гибели лимфоцитов здоровых лиц и не оказывают выраженного действия на лимфоциты больных алкоголизмом.

Получены новые данные фундаментального характера о влиянии лекарственного препарата кортексина на показатели апоптоза при действии этанола и индуктора окислительного стресса гидроперекиси третичного бутила в экспериментальных культурах клеток на модели мононуклеаров периферической крови и нейробластомы.

Получены сведения об эффективности препарата метаболического типа действия кортексина на клеточную гибель и ее регуляцию в процессе фармакотерапии постабстинентных расстройств у больных алкоголизмом. Включение кортексина в терапевтические программы у больных алкоголизмом приводит к улучшению эмоционального состояния и когнитивных функций, положительной динамике экспрессии рецептора CD95 и к достоверному снижению числа связанных с аннексином клеток.

Практическая значимость. Полученные данные об особенностях процессов апоптоза лимфоцитов периферической крови и его регуляции у больных алкоголизмом могут быть использованы для научно обоснованных рекомендаций по оценке адаптационных возможностей организма. Результаты исследования по клинической и биологической эффективности отечественного препарата метаболического типа действия на процессы апоптоза лимфоцитов периферической крови и новые экспериментальные данные позволяют дать патогенетическое обоснование к применению нейропептидов в комплексных программах терапии алкоголизма.

Разработанная и апробированная математическая модель прогнозирования ремиссии у больных алкоголизмом позволяет повысить точность оценки эффективности результатов лечения. Применение этой модели в практическом здравоохранении будет способствовать правильному выбору терапевтических мероприятий и улучшению качества оказания специализированной наркологической помощи.

Результаты исследования представлены в учебно-методическом пособии «Оценка апоптоза клеток периферической крови при фармакотерапии психических расстройств» и пособии для врачей «Новые подходы к терапии аддиктивных расстройств с включением иммуномодуляторов и антиоксидантов».

Основные результаты диссертационной работы включены в программу обучения врачей-ординаторов и аспирантов ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН, в учебные программы студентов, интернов, клинических ординаторов и врачей-психиатров кафедры психиатрии, наркологии и психотерапии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России. Результаты внедрены в клиническую практику и используются в клиниках ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН.

Положения, выносимые на защиту:

1. Хроническое употребление этанола у больных алкоголизмом приводит к усилению апоптоза лимфоцитов периферической крови, проявляющейся на рецепторном и клеточном уровнях на фоне повышения кортизола.

2. На клеточных моделях в эксперименте in vitro этанол является индуктором ранних этапов апоптоза: приводит к экспрессии рецепторов апоптоза, выходу фосфотидилсерина на поверхность клеточной мембраны и снижению уровня антиапоптотического фермента Bcl-2, не оказывая непосредственно прямого токсического действия на морфологические изменения ядра клеток.

3. Механизм протективного действия кортексина на апоптоз клеток in vitro связан с восстановлением баланса про- и антиапоптотических белков.

4. Включение кортексина в комплексные программы терапии алкоголизма является клинически эффективным и патогенетически обоснованным.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на научной студенческой конференции «Старт в науку» (Томск, 2008); на региональной конференции молодых ученых и специалистов «Современные проблемы психических и соматических расстройств: грани соприкосновения» (Томск, 2008); на X конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008); на 9th World Congress of Biological Psychiatry (Paris, France, 2009); на 22nd ECNP Congress (Istanbul, Turkey, 2009); на II региональной конференции молодых ученых и специалистов «Современные проблемы психических и соматических расстройств: грани соприкосновения» (Томск, 2010); на XI Российском конгрессе с международным участием молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010); на XV съезде психиатров России (Москва, 2010); на 11th ECNP Regional Meeting (St. Petersburg, 2011); на пятой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011); на III региональной конференции молодых ученых и специалистов «Современные проблемы психических и соматических расстройств: грани соприкосновения» (Томск, 2012).

Исследования поддержаны грантом РФФИ Сибирь № 11-04-98054-р (2011—2012) «Разработка научных основ технологии прогнозирования риска асоциального поведения в регионе Сибири» и государственными контрактами № К-16-НИР/46-8 (2010) «Разработка методов оценки качества оказания специализированной медицинской помощи больным психическими расстройствами на основе применения клинико-иммунофизиологических и биохимических критериев» и «Разработка моделей диагностики, прогноза и оценки эффективности терапии аффективных и аддиктивных расстройств на основе иммунофизиологических, молекулярно-биологических и молекулярно-генетических подходов» (2011) в рамках подпрограммы «Психические расстройства» Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (2007—2011 гг.)».

Публикация результатов исследования. По теме диссертационного исследования опубликовано 24 печатных работы, в том числе 6 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК, 1 учебно-методическое пособие, 1 пособие для врачей.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на ___ страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, приложений. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 11 рисунками. Библиографический указатель включает 223 источника: 95 отечественных и 128 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве экспериментального материала использованы лимфоциты и сыворотка периферической крови больных алкоголизмом и психически и соматически здоровых лиц, а также клетки нейробластомы, клеточной линии С-1300.

Проведенное исследование включало следующие этапы:

- исследование показателей запрограммированной клеточной гибели лимфоцитов периферической крови и определение ряда стероидных регуляторных гормонов у больных алкоголизмом в сравнении со здоровыми донорами;

- изучение влияния кортексина в экспериментальных условиях in vitro при действии индуктора окислительного стресса и этанола (на модели лимфоцитов периферической крови здоровых лиц и клеток нейробластомы C-1300);

- исследование влияние нейропротектора кортексина на психологический статус и показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных алкоголизмом в динамике терапии.

Исследование выполнено на базе лаборатории клеточных и молекулярно-биологических исследований (руководитель лаборатории – д-р мед. наук, профессор С. А. Иванова) и отделения аддиктивных состояний клиник ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН (руководитель отделения – профессор, д-р мед. наук, Заслуженный деятель науки РФ, член-корр. РАМН Н. А. Бохан). Фрагмент исследования на модели нейробластомы частично выполнен на базе ФГБУ «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН (Новосибирск), в рамках договора о научном сотрудничестве.

Характеристика клинического материала. Материал исследования – лимфоциты, сыворотка периферической крови 150 мужчин, больных алкоголизмом от 25 до 59 лет (средний возраст – 43,40±1,31 года) и 50 соматически и психически здоровых мужчин от 24 до 58 лет. Все пациенты проходили курс реабилитации в отделении аддиктивных состояний клиник ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН. Забор крови проводился при поступлении пациентов в клинику, до назначения фармакотерапии. Диагностическая оценка и клиническая квалификация аддиктивных расстройств проводилась врачами-наркологами в соответствии с МКБ-10 (шифр F10 «Психические и поведенческие расстройства, вызванные употреблением алкоголя»). У наблюдаемых пациентов полностью сформировались первичное патологическое влечение к алкоголю, утрата количественного контроля, максимальная толерантность к алкоголю (составлявшая на момент обследования от 0,5 до 1,0 л водки в сутки), развернутый абстинентный синдром, длительность которого составляла от 3—4 до 5—7 дней. Степень тяжести квалифицировалась как средняя.





Исследование проводилось в строгом соответствии с биоэтическими нормами. Протокол исследования, информация для обследуемых лиц и форма информированного согласия были одобрены локальным этическим комитетом.

С целью изучения влияния кортексина на показатели запрограммированной гибели клеток периферической крови больных алкоголизмом были сформированы группы из обследованных лиц: основная группа – 20 чел., получавших в дополнение к стандартной терапии нейропротектор кортексин; группа сравнения – 20 чел., получавших стандартную медикаментозную терапию (психотропные препараты, вегетостабилизаторы, витамины). Кортексин производится отечественной компанией «Герофарм» (Санкт-Петербург), представляет собой комплекс полипептидных фракций, выделенных из головного мозга крупного рогатого скота. Препарат вводился внутримышечно по 10 мг с 4-го дня пребывания в стационаре, 10 дней. Эффективность препарата оценивалась с учётом динамики картины постабстинентного состояния, клинические проявления которого выражались в виде астенического (психическая истощаемость, эмоциональная неустойчивость, раздражительность), психовегетативного (вегетососудистые нарушения, лабильность аффекта, диссомнические расстройства), гипотимического (депрессивные реакции, снижение эмоционального фона, дисфорические эпизоды) симптомокомплексов, когнитивных нарушений. Комплексная оценка биологических показателей у больных алкоголизмом проводилась в динамике: при поступлении пациента (острая фаза абстинентного синдрома) и на 10-й день после начала терапии (фаза постабстинентных расстройств).

В качестве контрольной группы использовались образцы крови 50 соматически и психически здоровых мужчин от 24 до 58 лет, не имеющих хронических заболеваний, не состоящих на диспансерном учете, без признаков перенесенных острых инфекционных заболеваний на момент обследования. Отбор здоровых проводили, используя углубленный опрос с помощью специальной анкеты, разработанной в лаборатории клеточных и молекулярно-биологических исследований ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН.

Клинико-психологическое обследование. Тестирование пациентов проводилось дважды: на 4-й день терапии и на 14-й день (10-й день терапии кортексином) пребывания пациента в клинике. Исследование личностных характеристик и эмоционального состояния больных проводилось с помощью Миннесотского многофазного личностного теста (ММPI). Для оценки состояния памяти пациентов, утомляемости, активного внимания использовались тесты на непосредственное и опосредованное воспроизведение с заучиванием серии слов по методике А. Р. Лурия (1962).

У здоровых лиц и пациентов, больных алкоголизмом, кровь для биологических исследований брали из локтевой вены, утром, натощак. Использовали комплекс методов, характеризующих показатели апоптоза иммунокомпетентных клеток:

Выделение мононуклеаров. Мононуклеарные лейкоциты выделяли из цельной венозной крови путем центрифугирования на градиенте плотности Ficoll-Paque (=1,077 г/см3, «Pharmacia», Швеция) [Gondal M. et al., 1972].

Определение лимфоцитов с маркером апоптоза CD95. Оценку содержания клеток с маркером апоптоза проводили непрямым иммунофлуоресцентным методом [Барбан П. С., 1988] с использованием моноклональных антител фирмы «Сорбент» (Москва, Россия). Исследование проводили с помощью люминесцентного микроскопа фирмы «Micros» (Австрия).

Определение Annexin V+-лимфоцитов. Для определения процентной доли клеток, подвергшихся апоптозу, использован метод проточной цитофлуориметрии. Анализ мононуклеаров проводили на проточном цитофлуориметре FACS Callibur фирмы «BD» (США) с применением набора Annexin V-FITC Kit фирмы «Beckman Coulter» (Франция). Согласно инструкции, прилагаемой к набору, в образце оценивали показатели прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния клеток, интенсивность флуоресценции Annexin V-FITС (FL1) и PI (FL2). После исключения дебриса (по показателям прямого и бокового светорассеяния) и выделения лимфоцитарного гейта определяли количество Annexin+- и PI+-клеток в режиме DotPlot (двумерная гистограмма). Количество апоптотических Annexin+-клеток определяли в нижнем правом квадранте. Сбор данных и компьютерную обработку осуществляли с использованием программы Cell Quest Pro.

Определение морфологических признаков апоптоза. Оценку морфологических признаков апоптоза проводили методом световой микроскопии мазков крови, окрашенных по Романовскому [Фильченков А. А и др., 2000]. Для оценки спонтанного апоптоза мазки готовили сразу после забора крови. Для исследования апоптоза лимфоцитов, индуцированного действием гипертермии, синтетического глюкокортикоида преднизолона и этанола в нагрузочных пробах in vitro образцы крови инкубировали 4 часа при комнатной температуре или при 41оС в отсутствии или с 10 мкМ преднизолона, а также с 0,5 % этанолом [Черных Е. И., 2002].

Определение уровня белков апоптоза Bcl-2 и caspase-3. Концентрацию антиапоптотического белка Bcl-2 и проапоптотического белка caspase-3 определяли в лизате лимфоцитов методом иммуноферментного анализа с использованием наборов Human Caspase-3 instant ELISA и Human Bcl-2 ELISA фирмы «Bender MedSystems GmbH» (Вена, Австрия). Исследование проводили в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Результаты ИФА оценивали на автоматическом микропланшетном спектрофотометре «Epoch BioTek Instruments» (США) при длине волны 450 нм.

Определение уровня кортизола и дегидроэпиандростерона сульфата (ДГЭАС). Определение концентрации гормонов дегидроэпиандростерона сульфата (ДГЭАС) и кортизола проводили в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа. Уровень стероидных гормонов определяли с использованием наборов фирмы ЗАО «Алкор Био» (Санкт-Петербург) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к наборам. Конечные результаты выражали в единицах, рекомендованных фирмой-изготовителем для построения калибровочных графиков, из стандартных навесок определяемых веществ (кортизол – нмоль/л, ДГЭАС – мкмоль/л).

Культивирование лимфоцитов периферической крови in vitro. Культивирование лимфоцитов проводили в СО2-инкубаторе при температуре 37С, абсолютной влажности и 5 % содержании СО2 в полной культуральной среде, состоящей из RPMI-1640 с L-глутамином, 25 мМ HEPES («Invitrogen», США), 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург). Для выяснения эффекта кортексина лимфоциты периферической крови здоровых доноров инкубировали с препаратом в концентрации 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл или 10 мкг/мл в течение 16 часов, а затем действовали индукторами окислительного стресса (140 мкМ ГПТБ в течение 4 часов) или 0,5 % этанолом. Далее оценивали уровень caspase-3, Bcl-2, долю Annexin+-мононуклеаров, количество клеток с фрагментированным ядром.

Культивирование клеток нейробластомы in vitro. Клетки нейробластомы С-1300 культивировали в СО2-инкубаторе при 37оС, 5 % СО2 и 95 % воздуха, в среде DMEM с добавлением 5 % ЭТС, 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. В эксперимент входила дифференцированная культура нейробластомы, имеющая не менее 30—35 % дифференцированных клеток, которые имеют более 3 отростков или 2 отростка длиннее 2 диаметров клетки.

Для выявления эффекта кортексина клетки нейробластомы инкубировали с препаратом в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 16 часов, а затем действовали индукторами окислительного стресса (140 мкМ ГПТБ в течение 4 часов) или 0,5 % этанолом. Далее оценивали концентрацию проапоптотического белка caspase-3 и антиапоптотическго белка Bcl-2.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов производили с помощью программ STATISTICA, версия 8.0 для Windows и SPSS, версия 11.0.

Для проверки исследуемых совокупностей на нормальность распределения выборок использовали критерий Шапиро-Уилкса. Поскольку исследуемые биологические показатели не подчинялись нормальному закону распределения, производили расчеты медианы (Ме) и межквартильного интервала (Qu, Qd). Достоверность различий определяли с использованием критериев Манна-Уитни, Колмагорова-Смирнова и метода Уилкоксона. Для оценки связей внутри исследуемых показателей применяли корреляционный анализ Спирмана. Для построения математической модели прогноза развития ремиссии в исследуемой совокупности применяли метод логистической регрессии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование показателей апоптоза и регуляторных

гормональных факторов  у больных алкоголизмом

Анализ апоптотической гибели лимфоцитов периферической крови больных алкоголизмом: При комплексном исследовании процессов апоптоза лимфоцитов периферической крови 150 мужчин, больных алкоголизмом выявлено достоверное, по сравнению с психически и соматически здоровыми лицами, повышение экспрессии рецептора CD95 (16,00 (13,00—20,00) % и 10,49 (10,00—13,68) %, p<0,001).

Наряду с оценкой готовности к апоптозу проведен анализ начальных стадий клеточной гибели методом проточной цитофлуориметрии (рис. 1).

Рис. 1. Распределение апоптотических и жизнеспособных клеток

в режиме DotPlot (двумерная гистограмма). По оси абсцисс

интенсивность флуоресценции аннексина V FITC.

По оси ординат интенсивность флуоресценции PI

а – здоровый мужчина

б – больной алкоголизмом

В мазках крови пациентов, больных алкоголизмом, и здоровых лиц были зафиксированы лимфоциты с морфологическими признаками, характерными для клеток, подвергшихся апоптозу. У таких клеток наблюдалась деградация ядерного материала, происходила фрагментация хроматина на несколько частей (рис. 2).

Рис. 2. Лимфоциты с морфологическими признаками апоптоза

а – нормальный лимфоцит

Б, в – лимфоциты с фрагментированным ядром

Лимфоциты с фрагментированным ядром в мазках крови больных алкоголизмом выявлены в 4,44 (3,27—5,61) %, что более чем в 2 раза выше данного показателя у здоровых доноров – 1,87 (1,48—2,10) % (p<0,001). Нами рассчитан индекс реализации апоптоза, т. е. доля клеток с морфологическими признаками апоптоза в процентах от общего числа клеток, экспрессирующих рецепторы готовности к апоптозу. Индекс реализации апоптоза лимфоцитов у здоровых мужчин составил 17,01 (14,88—21,13) %. У больных алкоголизмом данный показатель достоверно выше контрольных значений и составляет 25,81 (19,34—33,77) %.

Таким образом, в результате проведенного исследования у пациентов, больных алкоголизмом, выявлено увеличение содержания в кровотоке лимфоцитов, несущих на поверхности маркер апоптоза CD95, увеличение доли Annexin V+-клеток, достоверное увеличение лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза и статистически значимое увеличение индекса реализации апоптоза. Полученные результаты согласуются с данными других авторов о нарушениях процессов апоптоза различных типов клеток при алкоголизме [Nagata J., 2000].

Определение содержания гормонов – основных физиологических регуляторов апоптоза – в сыворотке крови больных алкоголизмом. Согласно литературным данным, при хроническом злоупотреблении алкоголем характерны сдвиг гормонального баланса и длительное повышение уровня глюкокортикоидов. В результате проведенного нами исследования в группе больных алкоголизмом выявлено статистически значимое увеличение уровня кортизола в сыворотке крови по сравнению со здоровыми донорами – 686,74 (566,49—808,01) нмоль/л и 519,5 (396,00—571,00) нмоль/л (p<0,05). При определении содержания в сыворотке крови ДГЭА-сульфата у больных алкоголизмом не обнаружено существенных отличий от показателей в группе психически и соматически здоровых лиц – 3,63 (2,42—4,41) и 3,10 (2,50—3,49) мкг/мл.

Для характеристики взаимосвязей исследуемых показателей использовали корреляционный анализ между параметрами апоптоза, уровнем кортизола и уровнем ДГЭАС (табл. 1). За достоверные принимались корреляционные связи при значениях коэффициента корреляции r=0,5—1,0 при достоверности уровня различий p<0,05.

Таблица 1

Корреляционная матрица биологических показателей

лиц с алкогольной зависимостью

Показатель

Кортизол

ДГЭАС

CD95

Кортизол

1,00

0,10

0,74*

ДГЭАС

0,10

1,00

0,48

CD95

0,74*

0,48

1,00

Примечание. * – Достоверность уровня различия p<0,05 при значениях коэффициента корреляции r=0,5—1,0.

Выявлена положительная корреляция «кортизол – СD95», подтверждающая роль кортикостероидов в регуляции экспрессии маркера апоптоза на лимфоцитах периферической крови.

Таким образом, у больных алкоголизмом обнаружено достоверное увеличение концентрации кортизола по сравнению с контрольной группой. Повышение уровня кортизола обусловлено  хронической интоксикацией и может быть приравнено к состоянию длительного сильного стресса. В ходе исследования выявлены корреляции экспрессии маркера апоптоза с концентрацией кортизола при алкоголизме.

На основе катамнестического обследования 51 пациента, проведенного через 2—3 года после курса терапии, и анализа биологических показателей разработана математическая модель прогнозирования ремиссии у больных с аддиктивной зависимостью. Наиболее информативными показателями для прогнозирования ремиссии являются концентрации кортизола и нейростероида дегидроэпиандростерона сульфата. Данная модель позволяет повысить точность оценки эффективности результатов лечения.

Влияние этанола и других факторов на показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови больных алкоголизмом в нагрузочных пробах in vitro. Для исследования регуляции апоптоза проведена оценка стимулированной клеточной гибели лимфоцитов in vitro c использованием модуляторов апоптоза: гипертермии и синтетического глюкокортикоида преднизолона. Также проведена оценка действия этанола на показатели апоптоза больных алкоголизмом. Исследование влияния 0,5 % этанола в нагрузочных пробах in vitro на экспрессию рецептора CD95 показало, что в клетках периферической крови у здоровых доноров происходит статистически значимое изменение исследуемого показателя – 18,04 (16,41—19,44) % и 10,49 (10,00—13,68) % (p<0,001). Для больных алкоголизмом выявлено усиление экспрессии рецептора CD95 до 20,82 (18,00—29,17) % при добавлении в инкубационную среду этанола, однако различия не были статистически достоверны (табл. 2).

Цитологический анализ мазков крови показал, что инкубация образцов крови здоровых доноров при комнатной температуре вызвала увеличение числа клеток, подвергшихся апоптотическим изменениям. Длительное нагревание приводило к дальнейшему росту числа апоптотических лимфоцитов. Добавление в культуральную среду преднизолона в различных температурных условиях не приводило к значимым изменениям в содержании лимфоцитов с гранулированным хроматином ядра в мазках крови здоровых доноров (табл. 3).

Таблица 2

Влияние этанола на экспрессию рецептора CD95 у больных алкоголизмом и здоровых лиц в нагрузочных пробах in vitro (%), Me (Qu, Qd)

Условия инкубации

Здоровые лица

Больные алкоголизмом

Инкубация

без 0,5 % этанола (контроль)

10,49

(10,00—13,68)

16,00

(13,00—20,00), р1=0,0002

Инкубация

с 0,5 % этанолом

18,04

(16,41—19,44), р2=0,0003

20,82

(18,00—29,17)

Примечание. р1  – уровень статистической значимости различий по сравнению со здоровыми лицами; р2 – уровень статистической значимости различий по сравнению с контролем.

Таблица 3

Действие гипертермии, преднизолона и этанола на апоптоз лейкоцитов у больных алкоголизмом и здоровых лиц in vitro (%), Me (Qu, Qd)

Условия опыта

Доля лимфоцитов

с фрагментированным ядром, %

Здоровые лица

Больные алкоголизмом

Без инкубации

1,87 (1,48—2,10)

4,44 (3,27—5,61)*

Инкубация при 20оС

2,98 (2,86—3,27) +

5,41 (3,02—9,26) *

Инкубация при 20оС + преднизолон

3,28 (2,27—5,08) +

7,40 (4,28—12,5) *

Инкубация при 41оС

5,56 (3,34—8,95) + #

7,19 (2,89—10,26)

Инкубация при 41оС + преднизолон

4,54 (1,41—9,09)

6,38 (3,84—7,04)

Инкубация при 20оС + этанол

4,17 (2,61—7,02) +

3,21 (2,11— 4,80)

Примечание. * – р<0,05 по сравнению с клетками здоровых лиц; # – p<0,05 по сравнению с инкубацией в тех же условиях при 20оС; + – p<0,05 по сравнению со спонтанным апоптозом (без инкубации).

Число лимфоцитов, подвергшихся апоптозу под действием этанола, в крови здоровых доноров составило 4,17 (2,61—7,02) %, что достоверно выше контрольных значений – 1,87 (1,48—2,10) %. В то же время инкубация в аналогичных условиях образцов крови пациентов, страдающих алкоголизмом, не вызывала достоверных изменений морфологических признаков запрограммированной клеточной гибели в популяции лимфоцитов.

Таким образом, в экспериментальных пробах in vitro при действии 0,5 % этанола показано достоверное увеличение уровня экспрессии рецептора CD95 и морфологических признаков апоптоза лимфоцитов в образцах крови здоровых доноров. Тогда как у больных алкоголизмом не происходило значимых изменений исследуемых параметров. Возможно, данный факт свидетельствует об определенной десенсибилизации лимфоцитов к этанолу в организме в условиях хронической алкоголизации.

Влияние метаболического протектора кортексина

в экспериментальных условиях при действии этанола на модели

лимфоцитов периферической крови и нейробластомы С-1300

Эффект кортексина на нейробластому С-1300. Использование нервных клеток пациентов невозможно для биологических исследований, поэтому нами в качестве удобной и доступной альтернативы исследовано действие кортексина на процессы запрограммированной гибели клеточной линии нейробластомы. Относительная простота перевивки и высокая скорость роста нейробластомы позволяют в короткие сроки на небольшом количестве клеток моделировать действие различных эффекторов, вызывающих апоптоз.

В качестве индукторов апоптоза наряду с этанолом использовалась гидроперекись третичного бутила (ГПТБ) как модель окислительного стресса. Поскольку один из механизмов, благодаря которому этанол приводит к повреждению центральной нервной системы, осуществляется через генерацию окислительного стресса [Heaton M. D. et al., 2002; Ramachandran V. et al., 2003; Watts L. T. et al., 2005; Lee et al., 2007].

По результатам эксперимента инкубация in vitro нейробластомы с гидроперекисью третичного бутила или с этанолом приводила к достоверному снижению уровня антиапоптотического белка Bcl-2 (14,48 (13,10—16,20) нг/мл – инкубация с ГПТБ, 15,55 (11,73—17,61) нг/мл – инкубация с этанолом, 20,20 (17,77—23,50) нг/мл – контроль) (табл. 4).

Таблица 4

Влияние кортексина на уровень Bcl-2 в нервных клетках

нейробластомы (нг/мл), Me (QL-QU)

Условия

инкубации

Интактные клетки

Интактные клетки

+ 140 мкМ ГПТБ

Интактные клетки

+ 0,5 % этанол

Инкубация

без кортексина

20,20

(17,77—23,50)

14,58

(13,10—16,20)*

15,55

(11,73—17,61)*

Инкубация с кортексином (0,1 мкг/мл)

17,56

(14,40—21,64)

18,24

(15,49—22,17)#

19,56

(18,44—21,05)#

Примечание. * – р<0,05 по сравнению с интактными клетками (контроль); # – p<0,05 по сравнению с инкубацией в тех же условиях без протектора.

Выявленные эффекты хорошо согласуются с данными других авторов о нарушениях процессов апоптоза различных типов клеток в условиях окислительного стресса [Лущак В. И., 2007; Hortelano S. et al., 1997]. Так, J. C. Tejedo et al. [1999] доказали, что при действии оксида азота на клетку сильно понижается уровень внутриклеточного Bcl-2 белка. Инкубация с этанолом в концентрации 100 мМ в течение 16 часов приводит к двукратному увеличению экспрессии Bax и снижению экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 в Jarkat-клетках, а также перемещению цитохрома С в цитозоль [Kapasi A. A., 2003].

Кортексин существенно повышал концентрацию антиапоптотического белка в клеточной культуре нейробластомы, инкубированной с ГПТБ и 0,5 % этанолом, по сравнению с инкубацией в тех же условиях без добавления протектора.

Количество caspase-3 в контрольных культурах нейробластомы составило 2,61 (2,43—3,47) мкг/мл. Добавление в инкубационную среду этанола не приводило к значимым изменениям исследуемого параметра – 2,40 (1,82—3,92) мкг/мл, однако в условиях экспериментального окислительного стресса наблюдалось увеличение уровня проапоптотического белка – 3,95 (3,53—4,02) мкг/мл и 2,61 (2,43—3,47) мкг/мл в контроле (p<0,05) (табл. 5). Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что в организме в условиях хронической алкоголизации на клетки может оказывать токсическое действие не столько сам этанол, а его активные метаболиты, в частности активные формы кислорода.

Таблица 5

Влияние кортексина на уровень caspase-3 в нервных клетках

нейробластомы (мкг/мл), Me (QL-QU)

Условия инкубации

Интактные

клетки

Интактные клетки

+ 140 мкМ ГПТБ

Интактные клетки

+ 0,5 % этанол

Инкубация

без кортексина

2,61

(2,43—3,47)

3,95

(3,53—4,02) *

2,40

(1,82—3,92)

Инкубация с кортексином (0,1 мкг/мл)

1,1

(0,75—1,92)*

2,21

(1,85—2,65)

2,24

(1,56—3,02)

Примечание. *- р<0,05 по сравнению с интактными клетками (контроль).

Долгосрочная прединкубация с кортексином приводила к снижению количества белка в нервных клетках нейробластомы по сравнению с инкубацией без добавления протектора. В условиях экспериментального окислительного стресса наблюдали тенденцию к снижению уровня caspase-3.

Эффект кортексина на лимфоциты периферической крови здоровых людей. Уровень Bcl-2 в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров составил 10,01 (8,56—11,75) нг/мл. Добавление в культуральную среду 0,5 % этанола или гидроперекиси третичного бутила приводило к достоверному снижению количества антиапоптотического белка – 6,99 нг/мл (4,95—8,9) и 7,59 (6,72—9,53) нг/мл (рис. 2).

Рис. 3. Уровень Bcl-2 в лимфоцитах при инкубации

со 140 мкМ ГПТБ и 0,5 % этанолом

Примечание. * – р<0,05 по сравнению с интактными клетками (контроль)

В работе Yu. Yan et al. (2011) показано, что этанол индуцирует повреждения ДНК в лимфоцитах периферической крови человека. Длительный прием алкоголя вызывает снижение экспрессии Bcl-2 и активацию проапоптотического белка caspase-3 в Т-лимфоцитах пациентов [Kapasi A. A., 2003].

Предварительное культивирование клеток с кортексином приводило к нормализации количества антиапоптотического белка в лимфоцитах, подвергшихся воздействию этанола. Согласно полученным результатам, максимальный эффект оказывала концентрация препарата 0,1 мкг/мл. Данная концентрация вызывала достоверное увеличение уровня антиапоптотического белка по сравнению с инкубацией в тех же условиях без протектора (рис. 4а). В соответствии с литературными данными именно эта концентрация соответствует терапевтическому диапазону препарата (Гарманчук л В. и др., 2011). Аналогичный эффект препарата был отмечен в культуре лимфоцитов, подвергшихся экспериментальному окислительному стрессу. Наблюдали достоверные изменения количества Bcl-2 при инкубации с кортексином в концентрациях 0,1 мкг/мл и 10 мкг/мл (рис. 4б).

А

Б

Рис. 4. Влияние кортексина на уровень Bcl-2 в лимфоцитах

периферической крови человека под действием этанола (а)

и в условиях окислительного стресса (б)

Примечание. * – р<0,05 по сравнению с интактными клетками (контроль); # – p<0,05 по сравнению с инкубацией в тех же условиях без протектора.

Количество caspase-3 в лимфоцитах здоровых доноров составило 3,76 (3,59—4,11) мкг/мл. Инкубация клеток с гидроперекисью приводила к достоверному увеличению уровня проапоптотического белка – 5,02 (4,33—5,74) мкг/мл (табл. 6).

Таблица 6

Влияние кортексина на уровень caspase-3 в лимфоцитах

здоровых (мкг/мл), Me (QL-QU)

Условия инкубации

Интактные клетки

Интактные клетки + 140 мкМ ГПТБ

Интактные клетки

+ 0,5 % этанол

Инкубация без кортексина

3,76

(3,59—4,11)

5,02

(4,33—5,74)*

4,54

(3,81— 4,79)

Инкубация с кортексином (0,1 мкг/мл)

3,43

(2,17—4,60)

3,93

(3,25—4,51) #

4,35

(1,8—4,54)

Инкубация с кортексином

(1 мкг/мл)

3,97

(2,24—4,17)

4,49

(1,3—4,78)

4,27

(1,3—4,55)

Инкубация с кортексином

(10 мкг/мл)

3,69

(2,14—4,66)

4,3

(1,79—4,54)

3,73

(2,8—4,48)

Примечание. * – р<0,05 по сравнению с интактными клетками (контроль); # – p<0,05 по сравнению с инкубацией в тех же условиях без кортексина.

Выявленные нами данные свидетельствуют о том, что в условиях окислительного стресса наблюдается индукция апоптоза лимфоцитов, что выражается в значительном увеличении уровня caspase-3. Обнаружены защитные свойства препарата в концентрации 0,1 мкг/мл по отношению к экспериментальному окислительному стрессу: уровень проапоптотического белка caspase-3 достоверно снижался до 3,93 мкг/мл, под действием кортексина – 5,02 (4,33—5,74) мкг/мл без добавления протектора. При инкубации клеток с этанолом статистически достоверных изменений в концентрации исследуемого белка не обнаружено – 4,54 (3,81—4,79) мкг/мл, в контроле – 3,76 (3,59—4,11) мкг/мл.

В условиях индуцированного окислительного стресса наблюдается достоверное увеличение доли Annexin V+-лимфоцитов по сравнению с контрольными значениями – 17,71 (16,80—17,80) %, 12,8 (10,5—13,5) % (р<0,05). Аналогичный эффект выявлен при добавлении в культуральную среду этанола.

Таблица 7

Влияние кортексина на уровень Annexin V+-лимфоцитов

здоровых (%), Me (QL-QU)

Условия инкубации

Интактные клетки

Интактные клетки

+ 140 мкМ ГПТБ

Интактные клетки

+ 0,5 % этанол

Инкубация без кортексина

12,8

(10,5—13,5)

17,71

(16,80—17,80)*

18,15

(15,55—18,00)*

Инкубация с кортексином

(0,1 мкг/мл)

12,6

(10,65—14,76)

16,8

(15,41—18. 90)

14,61

(12,6—16,35) #

Инкубация с кортексином

(1 мкг/мл)

13,3

(12,70—14,52)

17,36

(15,51—19,60)

13,5

(11,05—16,15) #

Инкубация с кортексином

(10 мкг/мл)

11. 9

(10,65—12,50)

14,5

(14,3—16,80)

16,9

(15,65—17,75)

Примечание. * – р<0,05 по сравнению с интактными клетками (контроль); # – p<0,05 по сравнению с инкубацией в тех же условиях без кортексина.

Как показано в таблице 7, количество лимфоцитов на ранней стадии апоптоза составило 18,15 (15,55—18,00) %, что достоверно выше значений в контроле.

Добавление в культуральную среду нейрометаболического протектора в различных концентрациях не приводило к значимым изменениям количества Annexin V+-лимфоцитов. Не было обнаружено статистически значимого протективного действия препарата по отношению к индуцированному окислительному стрессу. Однако в культурах, подвергнутых действию 0,5 % этанола, кортексин в концентрациях 0,1 мкг/мл и 1 мкг/мл существенно снижал долю Annexin V+-лимфоцитов по сравнению с инкубацией в тех же условиях без добавления протектора.

Цитологический анализ мазков крови показал, что инкубация мононуклеаров с ГПТБ приводила к снижению жизнестойкости клеток, что выражалось в достоверном увеличение количества апоптотических лимфоцитов по сравнению с контролем – 8,2 (7,41—9,43) % и 6,66 (5,00—8,19) %. Число лимфоцитов, подвергшихся апоптозу под действием 0,5 % этанола, составило 7,12 (4,05—8,45) %. При долгосрочной преинкубации клеток с кортексином (в 3 концентрациях) и с добавлением этанола доля клеток с гранулированным хроматином ядра уменьшалась по сравнению с контрольным значением, что показывает антиапоптотическое действие исследуемого препарата, достоверное снижение выявлено при инкубации с кортексином в концентрации 0,1 и 10 мкг/мл (табл. 8). Количество лимфоцитов с фрагментированным ядром снижалось и при инкубации с ГПТБ.

Таблица 8

Влияние кортексина на содержание лимфоцитов с фрагментированным ядром при культивировании in vitro (%), Me (QL-QU)

Условия инкубации

Интактные клетки

Интактные клетки

+ 140 мкМ ГПТБ

Интактные клетки

+ 0,5 % этанол

Без кортексина

6,66

(5,00—8,19)

8,2*

(7,41—9,43)

7,12

(4,05—8,45)

Инкубация с кортексином (0,1 мкг/мл)

1,51

(1,21—1,85)*

2,61

(1,1—4,76) #*

3,51

(1,2—5,05) #*

Инкубация с кортексином (1 мкг/мл)

5,94

(2,02—9,93)

3,62

(1,61—3,84) #*

5,41

(1,6—6,55)

Инкубация с кортексином (10 мкг/мл)

1,86

(1,43—4,16)*

3,53

(2,78—5,88)

2,7

(1,2—3,82) #*

Примечание. * – р<0,05 по сравнению с интактными клетками (контроль); # – p<0,05 по сравнению с инкубацией в тех же условиях без кортексина.

Таким образом, представленные выше экспериментальные данные демонстрируют протекторные свойства кортексина в отношении клеточной гибели лимфоцитов под влиянием этанола и в условиях окислительного стресса.

Влияние кортексина на динамику клинических  показателей

и параметры  апоптоза лимфоцитов периферической крови

у  пациентов, страдающих алкоголизмом

Основную группу составили 20 мужчин, больных алкоголизмом, получавших в дополнение к стандартной терапии нейропротектор кортексин. Группу сравнения составили 20 чел., получавших стандартную медикаментозную терапию. Эффективность терапии оценивалась с учётом динамики картины постабстинентного состояния, клинические проявления которого выражались в виде соматовегетативных, аффективных, поведенческих, диссомнических расстройств. В качестве контрольной группы использовались образцы крови 50 соматически и психически здоровых мужчин.

Проведенное исследование показало, что для пациентов основной группы была характерна более выраженная положительная динамика психического и соматического состояния на начальных этапах терапии, что проявлялось в редукции клинической симптоматики. У данных пациентов отмечались быстрая и полная редукция астенического, психовегетативного, гипотимического симптомокомплексов, повышение переносимости умственных и физических нагрузок и продуктивности умственной работы. В группе пациентов, получающих стандартную медикаментозную терапию, аналогичная динамика наблюдалась в меньшей степени, улучшение носило менее устойчивый характер.

В результате исследования эмоционального состояния пациентов основной группы, получавших полипептидный препарат кортексин, с помощью теста MMPI выявлено достоверное снижение по шкалам «реализации эмоциональной напряженности», «аутизации», «депрессии», «тревожности» и повышение значений шкал «коррекции» и «уровня активности и оптимизма» (рис. 5).

Рис. 5. Личностный профиль MMPI больных алкоголизмом

до и после завершения курса терапии кортексином

С использованием теста на непосредственное и опосредованное воспроизведение с заучиванием серии слов по методике А. Р. Лурия было установлено: до применения кортексина возможности оперативной памяти пациентов были снижены, воспроизведение было неполным. После предъявления испытуемым 10 слов до начала терапии усредненная кривая запоминания носила следующий характер: 5,3; 5,8; 6,4; 6,7; 6,8. После проведения лечения при повторном обследовании динамика воспроизведения 10 слов изменилась, воспроизведение 10 слов в среднем происходило к 4-му повторению: 7,2; 8; 8,4; 9,6; 9,8 (рис. 6).

Рис. 6. Диаграмма запоминания у больных основной группы

и в группе сравнения до и после завершения курса терапии

Клиническая эффективность препарата подтверждается биологическими исследованиями терапевтических возможностей кортексина. В ходе проведенного исследования уровня Annexin V+-лимфоцитов выявлено, что количество клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза у больных алкоголизмом до проведения курса терапии кортексином статистически значимо выше соответствующих значений в группе здоровых – 22,80 (14,70—24,96) % и 15,93 (15,10—17,49) % (p<0,05). После фармакотерапии нейрометаболическим препаратом доля Annexin V+-лимфоцитов достоверно снижалась до 18,97 (17,46—24,03) %.

В группе сравнения количество Annexin V+-лимфоцитов также достоверно выше контрольных значений – 21,66 (18,29—25,17) % и 15,93 (15,10—17,49) % (p<0,05), стандартная схема терапии не приводила к положительному результату (табл. 9).

У пациентов основной группы наблюдалось достоверно значимое увеличение экспрессии рецептора CD95 по сравнению с группой здоровых мужчин – 13,00 (10,00—18,00) % и 10,49 (10,00—13,68) % (p<0,05). Включение кортексина в программы терапии пациентов приводило к статистически значимому снижению уровня CD95 до значений нормы, и этот показатель составил 9,00 (6,20—10,00) %. У пациентов из группы сравнения экспрессия FAS-рецептора также превышала контрольные значения – 16,21 (14,60—19,00) % и 10,49 (10,00—13,68) % (p<0,05). После проведения стандартной медикаментозной терапии достоверных изменений исследуемого показателя отмечено не было (рис. 7).

Таблица 9

Динамика Annexin V+-лимфоцитов у пациентов, получающих

кортексин и стандартную медикаментозную терапию (%), Me (QL-QU)

Основная группа

Группа сравнения

До терапии

22,80 (14,70—24,96)*

21,66 (18,29—25,17)*

После терапии

18,97 (17,46—24,03)#

21,58 (17,60—24,75)

Контроль

15,93 (15,10—17,49)

15,93 (15,10—17,49)

Примечание. * – p<0,05 по сравнению с контролем (здоровыми лицами); # – p<0,05 достоверность уровня различий результатов в группе пациентов до и после терапии.

Рис. 7. Динамика экспрессии рецептора CD95 у больных

алкоголизмом в  зависимости от проводимой терапии

Примечание. * – p<0,05 по сравнению с контролем (здоровыми лицами); # – p<0,05 достоверность уровня различий результатов в группе пациентов до и после терапии.

Цитологический анализ мазков крови показал, что у больных алкоголизмом из основной группы до лечения уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов достоверно отличался от значений, наблюдаемых у здоровых – 4,96 (4,27—8,12) % и 1,87 (1,48—2,10) % (p<0,05). После проведенного курса лечения кортексином не наблюдалось изменений содержания в крови мононуклеарных клеток с морфологическими признаками апоптоза (табл. 10). Аналогичный результат зафиксирован в группе сравнения. У больных алкоголизмом до терапии количество лимфоцитов с фрагментированным ядром статистически значимо превышает значения в группе контроля – 4,08 (3,36—5,54) % и 1,87 (1,48—2,10) % (p<0,05). Курс проведенной стандартной фармакотерапии не привел к изменению исследуемого параметра.

Таблица 10

Динамика апоптоза лимфоцитов у пациентов, получающих кортексин,

и в группе лиц, получающих стандартную медикаментозную терапию (%) ,Me (QL-QU)

Основная группа

Группа сравнения

До терапии

4,96 (4,27—8,12)*

4,08 (3,36—5,54)*

После терапии

4,23 (3,67—5,08)

5,47 (2,77—7,62)

Контроль

1,87 (1,48—2,10)

1,87 (1,48—2,10)

Примечание. * – р<0,05 по сравнению с контролем (здоровыми лицами).

Таким образом, включение кортексина в терапевтический процесс больных алкоголизмом приводит к улучшению эмоционального состояния и когнитивных функций, положительной динамике экспрессии рецептора CD95 и к достоверному снижению количества клеток, связанных с аннексином. Учитывая эффективность препарата в клинической практике и его биологическую активность в отношении нормализации процессов апоптоза, кортексин может быть рекомендован для использования в терапии постабстинентных расстройств.

ВЫВОДЫ

1. У больных алкоголизмом выявлены достоверное по сравнению со здоровыми лицами усиление экспрессии рецептора CD95, увеличение доли Annexin V+-клеток и статистически значимое повышение количества лимфоцитов с морфологическими признаками фрагментации ядра. Усиление показателей клеточной гибели лимфоцитов у больных алкоголизмом наблюдается на фоне повышения концентрации кортизола в сыворотке крови.

2. В экспериментальных пробах in vitro показано усиление клеточной гибели лимфоцитов здоровых лиц при действии этанола и различных температурных режимов культивирования. Инкубация лимфоцитов периферической крови больных алкоголизмом с модуляторами апоптоза и этанолом не приводила к значимым изменениям исследуемых параметров.

3. В условиях окислительного стресса в культуре лимфоцитов здоровых доноров выявлены увеличение уровня проапоптотического белка caspase-3, повышение доли клеток с морфологическими признаками апоптоза, усиление выхода фосфотидилсерина на поверхность клеточных мембран и снижение уровня антиапоптотического белка Bcl-2. При инкубации клеток с этанолом выявлены увеличение доли Annexin V+-клеток и снижение концентрации Bcl-2 по сравнению с интактными клетками. Клетки нейробластомы С-1300 в присутствии этанола и индуктора окислительного стресса реагировали снижением уровня Bcl-2.

4. Прединкубация лимфоцитов периферической крови здоровых лиц in vitro с кортексином приводила к сдерживанию апоптотического действия гидроперекиси и этанола: снижению уровня caspase-3, увеличению уровня Bcl-2 и нормализации числа клеток с морфологическими признаками апоптоза.

5. Включение в комплексные программы терапии аддиктивных расстройств нейрометаболического препарата кортексин приводит к положительной динамике эмоционального состояния и когнитивных функций больных алкоголизмом и нормализации показателей апоптоза (экспрессии рецептора CD95 и количества Annexin V+-клеток).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Показатели запрограммированной гибели лимфоцитов и нейтрофилов у лиц с алкогольной интоксикацией в динамике терапии препаратом с антиоксидантными свойствами / Е. В. Жернова, Н. М. Вялова, Н. А. Бохан, С. А. Иванова // Вестник ТГПУ. – 2009. – № 3 (81). – С. 59—62.
  2. Спонтанный и индуцированный in vitro апоптоз лимфоцитов и нейтрофилов у лиц с алкогольной зависимостью / С. А. Иванова, Н. М. Вялова, Е. В. Жернова, Н. А. Бохан // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т. 149. – № 2. – С. 209—212.
  3. Кортизол, дегидроэпиандростерон сульфат и их соотношение у больных алкоголизмом / В. А. Стояк, Е. В. Жернова, Н. А. Бохан, С. А. Иванова // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. – 2010. – № 4 (61). – С. 88—90.
  4. Протективный эффект кортексина в условиях индуцированного окислительного стресса и под влиянием этанола на модели лимфоцитов периферической крови здоровых лиц / Е. В. Жернова, И. С. Лосенков, Н. М. Вялова, С. А. Иванова // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 7. – С. 314—318.
  5. Эффекты дегидроэпиандростерона сульфата на индуцированный апоптоз лимфоцитов здоровых людей / Е. В. Жернова, С. А. Иванова // Физиология человека. – 2012. – Т. 38. – № 5. – С. 97—101.
  6. Когнитивные функции и процессы апоптоза у больных алкоголизмом: эффекты нейрометаболической коррекции / Н. А. Бохан, С. А. Иванова, А. И. Мандель, Е. В. Жернова, Н. И. Кисель // Наркология. – 2012. – № 7 (127). – С. 51—55.
  7. Оценка апоптоза клеток периферической крови при фармакотерапии психических расстройств / С. А. Иванова, Н. М. Вялова, Е. В. Жернова – Учебно-методическое пособие. – Томск, 2009. – 46 с.
  8. Новые подходы к терапии аддиктивных расстройств с включением иммуномодуляторов и антиоксидантов / Т. П. Ветлугина, С. А. Иванова, Н. А. Бохан, Т. И. Невидимова, В. Б. Никитина, А. И. Мандель, Г. П. Ляшенко, А. Ф. Аболонин, Е. В. Жернова – Пособие для врачей. – Томск, 2011. – С. 28.
  9. Influence of ethanol on apoptosis of lymphocytes and neutrophils / E. V. Zhernova, N. M. Vyalova, S. A. Ivanova // 17th European Congress of Psychiatry, European Psychiatrists Association (Lisbon. Portugal. January 24—28). – 2009. – Р01-87.
  10. Апоптоз лейкоцитов периферической крови у лиц с аддиктивными расстройствами в динамике терапии / Е. В Жернова // Науки о человеке: материалы X конгресса молодых ученых и специалистов. – Томск: СибГМУ, 2009. – С. 80–81.
  11. Apoptosis of immunocompetent cells in patients with alcoholism in dynamic of therapy / N. A. Bokhan, E. V. Zhernova, N. M. Vyalova, S. A. Ivanova // 22nd ECNP Congress (Istanbul, Turkey, September 12–16). – 2009. – Р. 6.b.004.
  12. Apoptosis of immune competent cells in alcoholic patients / N. A. Bokhan, N. M. Vyalova, E. V. Zhernova, S. A. Ivanova // 9th World Congress of Biological Psychiatry (Paris, France, 28th June – 2 July). – 2009. – P. 199.
  13. Гормональный статус и апоптоз лимфоцитов у больных алкоголизмом / E. B. Жернова, Н. И. Кисель // Современные проблемы психических и соматических расстройств: грани соприкосновения: сборник тезисов II региональной конференции молодых ученых и специалистов (Томск, 1 июня 2010 г.) – Томск: Изд-во «Иван Федоров», 2008. – С. 49—50.
  14. Индуцированный окислительный стресс на моделях лимфоцитов и нейробластомы С-1300 / Н. С. Старновская, E. B. Жернова, Т. М. Панкова, М. В. Старостина, Л. П. Смирнова // Современные проблемы психических и соматических расстройств: грани соприкосновения: сборник тезисов II региональной конференции молодых ученых и специалистов (Томск, 1 июня 2010 г.) – Томск: Изд-во «Иван Федоров», 2010. – С. 100—101.
  15. Эффект дегидроэпиандростерона сульфата на процессы апоптоза лимфоцитов периферической крови человека / Е. В. Жернова, Н. М. Вялова // Актуальные вопросы психиатрии и наркологии: тезисы докладов XIV науч. отчет. сессии НИИ психического здоровья СО РАМН (Томск, 7 октября 2009 г.). – Томск: Изд-во «Иван Федоров», 2009. – Вып. 14. – С. 45—47.
  16. Апоптоз лимфоцитов периферической крови у больных алкоголизмом / С. А. Иванова, Е. В. Жернова, Н. М. Вялова, Н. А. Бохан // Материалы I Российского национального конгресса по наркологии с международным участием (24—27 ноября 2009 г.). – М., 2009. – С. 30—31.
  17. Особенности апоптоза лейкоцитов у больных алкоголизмом в динамике терапии кортексином / Е. В. Жернова, Н. М. Вялова, А. И. Мандель, С. А. Иванова // Сборник материалов XVII российского национального конгресса «Человек и лекарство» (12—16 апреля 2010 г.). – М., 2010. – С. 323.
  18. Influence of neuroactive peptidic preparations on apoptosis of immunocompetent cell in alcoholic patients / N. Bokhan, E. V. Zhernova, S. A. Ivanova // The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. – 2010. – Vol. 20. – Suppl. 3. – P. S574.
  19. Эффект дегидроэпиандростерона сульфата на процессы апоптоза нервных и иммунокомпетентных клеток / Е. В. Жернова, л. П. Смирнова, Н. А. Бохан, С. А. Иванова // Сборник материалов 7-й конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». – М., 2010. – С. 78—79.
  20. Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на морфологические изменения и уровень белков апоптоза лимфоцитов / Е. В. Жернова, С. И. Иванова // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Материалы Пятой Всероссийской научно-практической конференции – Новосибирск, 2011. – С. 68—69.
  21. Влияние гипертермии и преднизолона на уровень апоптоза иммунокомпетентных клеток у больных алкоголизмом / Е. В. Жернова // Фундаментальная наука и клиническая медицина – Человек и его здоровье. – СПб., 2011. – С. 92—93.
  22. Neuropeptide in treatment of alcoholism effect on psychological functions and lymphocyte apoptosis / S. Ivanova, E. Zhernova, A. Mandel, N. Bokhan // 11 th ECNP Regional Meeting. – St. Petersburg, 2011. – V. 21. – Suppl. 2. – P. S164.
  23. Протективные эффекты кортексина и апоптоз клеток нейробластомы / Е. В. Жернова, М. В. Старостина, л. П. Смирнова, Т. М. Панкова, С. А. Иванова, Н. А. Бохан // Сборник материалов XVIII российского национального конгресса «Человек и лекарство» (11—15 апреля 2011 г.). – М., 2011. – С. 311.
  24. Влияние нейрометаболического протектора кортексина на процессы апоптоза лимфоцитов больных алкоголизмом и здоровых лиц / Е. В. Жернова // Современные проблемы психических и соматических расстройств: грани соприкосновения: сборник тезисов III региональной конференции молодых ученых и специалистов (Томск, 20—21 июня 2012 г.) – Томск: Изд-во «Иван Федоров», 2012. – С. 83—85.

Список сокращений

CD95

– Cluster of differentiation 95

FITC

– Флуоресцеинизотиоцианат

PBS

– Натрий-фосфатный буфер

ФР

– Физиологический раствор

ГПТБ

– Гидроперекись третичного бутила

ДГЭАС

– Дегидроэпиандростерон сульфат

ИФА

– Иммуноферментный анализ

ЭТС

– Эмбриональная телячья сыворотка






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.