WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

ПОПОВЦЕВА АННА ВАЛЕНТИНОВНА

СВЯЗЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И НЕЙРОБИОХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ С ПРОГРЕССИРОВАНИЕМ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ

14.03.03 – патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Барнаул – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Барнаул) доктор биологических наук, профессор

Научный консультант:

ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Ельчанинова Светлана Александровна Научный консультант: кандидат медицинских наук, доцент ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Смагина Инна Вадимовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук КГБУЗ «Диагностический центр Алтайского края» Смирнова Юлия Викторовна кандидат медицинских наук, доцент ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Беспалов Андрей Григорьевич

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Томск).

Защита состоится «___» _____ 2012 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.002.03 при ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ (656038, г. Барнаул, пр. Ленина, 40).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ (656031, Россия, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126).

Автореферат разослан: «_____»____________ 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Е.В. Скударнов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы исследования. Актуальной проблемой патологической физиологии является раскрытие механизмов перехода обратимых повреждений в необратимые и их прогрессирования при хроническом течении болезни (Хитров Н.К., Саркисов Д.С., Пальцев М.А., 1999; Литвицкий П.Ф., 2009). Все большую социально-экономическую значимость решение этой проблемы приобретает в отношении рассеянного склероза (РС) – мультифакторного хронического демиелинизирующего заболевания центральной нервной системы, для которого характерно прогрессирование неврологического дефицита и инвалидизация преимущественно в трудоспособном возрасте (Фридман М.С., 2006; Гусев Е.И., Завалишин И.А., Бойко А.Н., 2011). Это обусловлено ростом заболеваемости РС во всем мире (Poser C.M., 1994;

Hutchinson M., 2009) и актуальностью разработки подходов к рациональному применению новых групп иммуномодулирующих препаратов, которые в ранний период течения РС могут предупреждать обострение и замедлять развитие инвалидизации (Polman C.H., 2006; Vollmer T., 2007).

Согласно современным представлениям основу патогенеза РС составляют аутоиммунное воспаление в центральной нервной системе с демиелинизацией аксонов в период обострения и частичной их ремиелинизацией в ремиссию, а также апоптоз олигодендроцитов, ведущий к гибели аксонов и необратимым нарушениям проведения нервных импульсов (Шмидт Т.Е., Яхно Н.Н., 2010). При наиболее распространенном ремитирующем типе течения РС в первые годы заболевания преобладает аутоиммунное воспаление с чередованием клинических обострений и ремиссий, часто неполных, в дальнейшем – нейродегенерация с быстрым и необратимым развитием рассеянной неврологической симптоматики (Столяров И.Д., Бойко А.Н., 2008).

Частота обострений и темпы прогрессирования РС широко варьируют (Stadelmann Ch., 2008; Tremlett H., 2008). Причины и закономерности этих различий в течении РС не раскрыты, хотя и составляют предмет наибольшего числа исследований последних лет, касающихся РС.

На современном этапе изучения механизмов, определяющих особенности течения РС, ведется выявление патогенетических детерминант обострений заболевания и прогрессирования неврологических нарушений. Предполагается, что на тип течения РС и ответ на терапию влияют генетические особенности пациента, которые, вероятнее всего, формируются полиморфными вариантами генов HLA-DRB1, TNF- и других, белковые продукты которых вовлечены в патогенез РС и в ряде популяций являются факторами риска развития этого заболевания (Смагина И.В., Ельчанинова С.А., Золовкина А.Г., 2011; Гусев Е.И., Завалишин И.А., Бойко А.Н., 2011; Bomprezzi R.

et al., 2003). Однако эта гипотеза пока убедительно не доказана, что может объясняться недостаточным объемом накопленных фактов с учетом генетической гетерогенности обследованных популяций больных и влияния на течение РС сочетания комплекса генов и факторов внешней среды (Фаворова О.О., Кулакова О.Г., Бойко А.Н., 2010; Yung Y., Whitacre C. C., 2004). Наиболее доказательны факты, указывающие на связь «мягкого» течения РС с женским полом (McDonald W., 2000; Minneboo A. et al., 2008; Mostert J. P., 2010).

Остается нерешенным вопрос о том, в какой степени выраженность повреждения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), воспаления в центральной нервной системе и сопровождающих его демиелинизации и глиоза определяют динамику накопления необратимых неврологических нарушений. Можно ли рассматривать какую-либо из этих патологических реакций, характерных для ранних этапов РС, в качестве детерминанты развития процессов нейродегенерации? Данные об ассоциации разных типов течения РС с показателями рассматриваемых патологических реакций противоречивы и получены преимущественно при исследовании крови, а не ликвора больных. Так, у больных ремитирующим РС в период обострения разными исследователями выявлены разнонаправленные изменения уровня стимулирующих воспалительную реакцию цитокинов – фактора некроза опухоли альфа TNF- и других (Бисага Г.Н., 2004;

Baraczka K. et al., 2004; Brandгo C.O. et al., 2005), матриксных металлопротеиназ и эндотелиальных адгезивных молекул, определяющих проникновение активированных Т-лимфоцитов через ГЭБ (Minagar A., Alexander J.S., 2003; Kalinowska A., 2006), компонента глии – белка S100 (Musse, A.A., 2006; Husted, C., 2006).

Разрешение этих противоречий – установление ведущих патогенетических, а также генетических факторов прогрессирования неврологического дефицита – может стать основой для раскрытия механизмов хронизации РС и варьирования его течения, разработки способа прогнозирования индивидуального риска быстрого прогрессирования РС и рекомендаций по особенностям лечения больных РС уже на ранних стадиях заболевания.

Все вышеизложенное определило цель настоящей работы.

Цель исследования. Выявить прогностически значимые в отношении прогрессирования неврологических нарушений при рассеянном склерозе генетические особенности и патобиохимические характеристики повреждения гематоэнцефалического барьера, воспаления, демиелинизации и глиоза.

Задачи исследования:

1. Оценить ассоциацию пола, полиморфных локусов генов HLA-DRB1, TNF- (rs1800629), KIF1B (rs10492972), CD40 (rs6074022) с частотой обострений и скоростью прогрессирования рассеянного склероза.

2. Исследовать взаимосвязь ликворных показателей воспаления и активации аутоиммунных процессов в центральной нервной системе – плеоцитоза, С-реактивного белка, интерлейкина 1 бета и фактора некроза опухолей альфа – с частотой обострений и скоростью прогрессирования рассеянного склероза.

3. Исследовать взаимосвязь ликворных показателей демиелинизации и глиоза – основного белка миелина и белка S100 – с частотой обострений и скоростью прогрессирования рассеянного склероза.

4. Исследовать взаимосвязь ликворных показателей повреждения ГЭБ – тромбомодулина, фактора Виллебранда, VE-кадгерина, молекулы адгезии сосудистого эндотелия 1 типа (sPECAM-1), тромбоцитарноэндотелиальной молекулы адгезии 1 типа (sVCAM-1), матриксной металлопротеиназы 2-го типа (MMP-2) – с частотой обострений и скоростью прогрессирования рассеянного склероза.

5. Оценить чувствительность и специфичность патобиохимических показателей ликвора, ассоциированных с высокой скоростью прогрессирования и частотой обострений рассеянного склероза, как прогностических биомаркеров течения этого заболевания Научная новизна. Установлено, что полиморфизм генов HLA-DRB1, TNF- (rs1800629), KIF1B (rs10492972), CD40 (rs6074022) не ассоциируется с частотой обострений и высокой скоростью прогрессирования неврологических нарушений у русских при ремитирующем рассеянном склерозе. Показано, что мужской пол является фактором риска быстрого развития неврологического дефицита независимо от его сочетания с генотипом HLA-DRB1, TNF- (rs1800629), KIF1B (rs10492972), CD40 (rs6074022). У больных рассеянным склерозом по комплексу ликворных показателей количественно оценены патологические реакции в центральной нервной системе – повреждение и проницаемость ГЭБ, воспаление, демиелинизация и глиоз. Установлено, что прогностически значимыми патобиохимическими характеристиками течения рассеянного склероза являются уровень в ликворе TNF-, а также маркеров повреждения ГЭБ – MMP-2, sPECAM-1 и sVCAM-1.

Теоретическая и практическая значимость работы. Выявлены особенности патогенетических процессов в центральной нервной системе, характерных для ранних этапов РС, влияющие на динамику накопления неврологических нарушений. Установлено, что гиперэргичность патологических реакций, проявляющихся повреждением ГЭБ и продукцией TNF-, является фактором быстрого прогрессирования РС. При этом гиперэргичность этих реакций не связана с такими индивидуальными особенностями, как полиморфизм гена TNF- и мужской пол. Обоснована возможность индивидуального прогнозирования риска обострения в ближайшие три года и быстрого прогрессирования неврологических нарушений при рассеянном склерозе с использованием в качестве лабораторных биомаркеров ликворных уровней TNF-, MMP-2, sPECAM-1 и sVCAM-Положения, выносимые на защиту.

1. Фактором риска высокой скорости прогрессирования рассеянного склероза является мужской пол независимо от его сочетания с генотипами полиморфных локусов генов HLA-DRB1, TNF- (rs1800629), CD40 (rs6074022) и KIF1B (rs10492972).

2. Независящая от пола гиперэргичность патологических реакций, проявляющихся признаками усиления повреждения ГЭБ и продукции TNF- при обострении рассеянного склероза, является фактором быстрого прогрессирования и экзацербации заболевания.





3. Прогностически неблагоприятными патобиохимическими характеристиками течения рассеянного склероза являются высокие концентрации в ликворе TNF-, MMP-2, sPECAM-1 и sVCAM-1 в период обострения заболевания.

Внедрение результатов работы. Результаты исследования внедрены в практику оказания медицинской помощи больным рассеянным склерозом в КГБУЗ «Краевая клиническая больница» (г. Барнаул). Основные положения диссертационной работы используются в образовательном процессе ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Лично автором проведены анализ отечественной и зарубежной литературы по рассматриваемой проблеме, анализ медицинской документации больных рассеянным склерозом, выполнены лабораторные исследования, статистическая обработка и научный анализ полученных данных, их обсуждение, написана настоящая работа.

Апробация результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на IV Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Рассеянный склероз: трудности диагностики и курации» (Новосибирск, 2009), научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009), XI городской научно-практической конференции «Молодежь – Барнаулу» (Барнаул, 2010), научно-практической конференции неврологов «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 2011), 11 межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы неврологии» (Новосибирск, 2011), расширенном межкафедральном заседании кафедр биохимии и клинической лабораторной диагностики, патофизиологии, ультразвуковой и функциональной диагностики, нервных болезней с курсом неврологии и рефлексотерапии ФПК и ППС ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Барнаул, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 4 статьи – в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора медицинских наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, трех глав с результатами собственного исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 142 страницах, иллюстрирована 14 рисунками и 34 таблицами. Список литературы включает 270 литературных источников, из них 38 – на русском языке и 232 – на иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Участники исследования. Для исследования факторов, влияющих на течение РС, была сформирована группа из 100 больных РС. Критериями включения в группу были: ремитирующий тип течения РС; длительность заболевания не менее 5 лет; инвалидизация не более 6,5 балла по расширенной шкале инвалидизации (Expanded Disability Status Scale, EDSS). Критерии исключения: предшествующие включению в исследование прием препаратов, изменяющих течение рассеянного склероза (ПИТРС), лечение стволовыми клетками, аутоиммунные заболевания соединительной ткани.

Включение в исследование больных с длительностью заболевания не менее 5 лет связано с тем, что в первые годы развития РС нарастание неврологических нарушений, как правило, не выражено и имеет широкое внутрииндивидуальное варьирование. С другой стороны, после развития тяжелых необратимых неврологических нарушений (EDSS свыше 6,5 баллов), которые, как правило, сохраняются на протяжении последующих лет жизни больного, низкая скорость инвалидизации не является показателем благоприятного течения болезни.

Клиническая характеристика больных представлена в таблице 1. Возраст и клинические проявления дебюта заболевания, половой состав группы были характерными для РС (соотношение мужчины/женщины составило 1:2,3). Все включенные в исследование пациенты по этнической принадлежности – русские (по данным анкетирования), по фенотипическим признакам – европеоиды.

Таблица Клиническая характеристика группы больных РС, принявших участие в исследовании (n=100) Показатель Возраст, годы 36,5 ± 11,Мужчины : женщины, абс. число 24 : Возраст дебюта, годы 27,4 ± 9,Инвалидизация по EDSS, баллы 3,4 ± 1,Скорость прогрессирования, баллов/год 0,56 ± 0,Длительность заболевания, годы 7,5 ± 1,Длительность первой ремиссии, месяцы 38,8 ± 24, В проспективном исследовании по оценке ликворных патобиохимических показателей РС приняли участие 60 пациентов из числа всех участников исследования. Клиническая характеристика этой группы пациентов представлена в таблице 2.

Больных включали в исследование в стадии обострения РС. Ликвор забирали до начала лечения. В период обострения в соответствии со стандартами лечения проводился 3-7-дневный пульс-курс препаратами кортикостероидов в суточной дозировке 1,0 г в пересчете на метилпреднизолон. Повторное исследование ликвора проводили в период ремиссии, не ранее чем через 3 месяца после прекращения лечения.

Таблица Клиническая характеристика группы больных РС, принявших участие в исследовании связи патобиохимических показателей ликвора с частотой обострений и скоростью прогрессирования рассеянного склероза (n=60) Показатель Возраст, годы 37,3 ± 10,Мужчины : женщины, абс. число 18 : Возраст дебюта, годы 28,8 ± 8,Инвалидизация по EDSS, баллы 3,5 ± 1,Скорость прогрессирования, баллов/год 0,57 ± 0,Длительность заболевания, годы 7,2 ± 1,Длительность первой ремиссии, месяцы 37,8 ± 23,Связь генетических особенностей и патобиохимических ликворных показателей с частотой обострений оценивали в трехлетнем проспективном наблюдении больных, со скоростью развития неврологических нарушений – по результатам ретроспективного и проспективного анализа.

Диагноз РС ставили по критериям Макдональда (Polman C.H. et al., 2005). Магнитно-резонансную томографию проводили на томографе Impact (Siemens-Magnetom, Япония) с напряженностью магнитного поля 1Т с использованием Т1- и Т2-изображений, а также режима TIRM. Для контрастирования вводили гадолинийсодержащие препараты Гадовист (Bayer Schering Pharma, ФРГ) и Омнискан (Nycomed, Норвегия) в стандартной дозе 0,1-0,3 ммоль/кг массы тела. Выраженность неврологических нарушений (степень инвалидизации) оценивали по расширенной шкале инвалидизации (Expanded Disability Status Scale – EDSS) (Kurtzke J.F., 1983).

Скорость прогрессирования РС рассчитывали по отношению EDSS на момент обследования к длительности болезни и расценивали как медленную при увеличении EDSS 0,25 балла/год, среднюю при увеличении EDSS в диапазоне 0,25-0,75 балла/год, высокую при нарастании EDSS > 0,75 балла/год (Малкова Н.А., 1988, 2006; Verians E. et al., 1983).

Ликвор забирали при люмбальной пункции. Общий клинический анализ ликвора проводили стандартными методами (Миронова И.И., Романова Л.А., 2005). Концентрацию альбумина в сыворотке крови измеряли унифицирован ным колориметрическим методом реагентами фирмы «Витал» «Альбумин02» (Россия, кат № 21.02), в ликворе – иммунотурбидиметрическим методом реагентами фирмы «Витал» «Микроальбумин-Витал» (Россия, кат. № В 41.22). Концентрацию других биохимических компонентов ликвора измеряли методом иммуноферментного анализа в микропланшетном варианте с использованием и по протоколам наборов реагентов перечисленных производителей: фактор Виллебранда – «Axis-Shield» (Великобритания, кат.

№ FVWF200), sVE-кадгерин – «Bender MedSystems» (США, кат. № BMS253), растворимая тромбоцитарно-эндотелиальная молекула адгезии 1 типа (sPECAM-1) – «Bender MedSystems» (США, кат. № BMS229), растворимая молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа (sVCAM-1) – «Bender MedSystems» (США, кат. № BMS232), матриксная металлопротеиназа 2 (MMP-2) – «R&D» (Швейцария, кат. № DMP232), С-реактивный белок – «DRG» (США, кат. № EIA-3954), IL-1в – «Biosource Europe S.A» (Бельгия, кат. № KHC0011), фактор некроза опухоли альфа (TNF- ) – «Biosource Europe S.A» (Бельгия, кат.№ KHC3011), основной белок миелина – «Diagnostics System Laboratories» (США, кат. № 449 – 5820), белок S100, суммарно формы S100А1В и S100ВВ – «CanAg Diagnostics» (США, кат. № 708-10), sCD1(тромбомодулин) – «Diaclone» (США, кат. № 850-7201).

Для молекулярно-генетических исследований ДНК получали из венозной крови стандартной процедурой, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК фенол-хлороформом и осаждение ДНК этанолом. Генотипирование проводили технологией TaqMan-зондов на амплификаторе iCycler iQ5 (Bio-Rad, США). При генотипировании HLA-DRB1 секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК после их обессоливания методом гель-фильтрации на акрилекс п-(Reanal, Венгрия) проводили по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, США) согласно рекомендациям производителя. Реакцию Сэнгера проводили на амплификаторе Eppendorf Mastercycler gradient (Eppendorf, США). Молекулярногенетические исследования выполнены в ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН» (г. Новосибирск).

Проведение исследований разрешено этическими комитетами КГБУЗ «Краевая клиническая больница» и ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Статистический анализ данных выполнен в программах SigmaPlot (v.11.0) и Statistica (v. 6.0) методами анализа таблиц сопряжённости (критерий хи-квадрат и точный критерий Фишера), оценки корреляций (коэффициент Спирмена), сравнения групп в зависимости от типа распределения и дизайна исследования по критериям Стьюдента, Ньюмена – Кейлса, Манна – Уитни. Соответствие распределения аллелей и генотипов равновесию Харди – Вайнберга оценивали с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, ФРГ). Результаты анализа ассоциации отдельных аллелей с РС приведены для аддитивной модели наследования как наиболее соответствующей полученным данным по величине коэффициента Акаике. Клиническую информативность тестов (чувствительность, специфичность) рассчитывали методом ROC-анализа (receiver operating characteristic analysis) в программе JMP (v. 5.1). Относительный риск оценивали по величине отношения шансов (ОШ), рассчитанной методом логистического регрессионного анализа.

Для количественных переменных результаты представлены в виде выборочного среднего (М) с указанием стандартного отклонения (±SD), в ряде случаев – 95% доверительного интервала (ДИ). Для всех использованных статистических критериев принят критический уровень значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование ассоциации пола, полиморфных локусов генов HLA-DRB1, TNF- (rs1800629), KIF1B (rs10492972), CD40 (rs6074022) с частотой обострений и скоростью прогрессирования рассеянного склероза Анализ гендерных особенностей динамики инвалидизации больных РС показал, что СП у мужчин в 2 раза выше, чем у женщин (0,76±0,24 и 0,38±0,06 балла в год, соответственно, р=0,009). Мужской пол положительно коррелировал со СП (rs=0,41, р=0,004) и ассоциировался с повышенным риском высокой скорости прогрессирования РС (ОШ=2,13; ДИ 1,94-2,35; р=0,015).

У мужчин по сравнению с женщинами выявлены такие особенности течения РС, как более короткий период первой ремиссии (24,2±18,3 и 38,7±29,0 месяцев соответственно, р=0,041), меньшая частота моноочагового дебюта (54,2% и 72,4% соответственно, р=0,013), более редкое клиническое проявление дебюта оптическим невритом (53,8% и 21,0% соответственно, р<0,001). Это согласуется с данными других исследователей о взаимосвязи пола, клинических характеристик дебюта РС с быстрым прогрессированием неврологических нарушений (Малкова Н.А., Иерусалимский А.П., 2006) и указывает на формирование пол-детерминированных особенностей РС уже на ранних этапах его развития.

Была исследована связь СП РС с генами, ассоциированными в разных популяциях с риском РС (Судомоина М.А., Фаворова О.О., 2000; Гусев Е.И., Завалишин И.А., Бойко А.Н., 2011; Walt A. et. al., 2011). Белки, кодируемые этими генами, вовлечены в патогенез РС. Так, антигены HLA, включая HLA-DRB1, опосредуют взаимодействие аутоагрессивных Т-лимфоцитов с клеточными структурами мозга (Banwell B. et аl., 2011). Цитокин TNF- и его рецептор (CD40) участвуют в регуляции аутоиммунного воспаления и дегенерации аксонов (Duran I. et al., 1999; Selmaj K. et al., 1997). Белок kif1b из семейства кинезинов необходим для роста аксонов и процесса их миелинизации (Kurtzke J.F., 1983; Benveniste E.N. et al., 2004).

По результатам генотипирования установлено, что распределение генотипов исследованных полиморфных локусов генов DRB1, TNF- (rs1800629), CD40 (rs6074022), KIF1B (rs10492972) соответствовало распределению Харди – Вайнберга (p=0,81; p=0,77; p=0,86; p=0,90 соответственно). Как показал логистический регрессионный анализ с поправкой на пол, с высокой СП не ассоциирован ни один из генотипов, также как аллелей HLA-DRB1.

Сочетание мужского или женского пола с генотипами или аллелями HLA-DRB1, которые, как установлено, являются факторами риска развития РС в Алтайском крае (Смагина И.В., Ельчанинова С.А., Золовкина А.Г., 2011), также не ассоциировалось с быстрым прогрессированием РС (табл. 3).

Таблица Относительный риск высокой скорости прогрессирования рассеянного склероза в зависимости от носительства аллелей и генотипа HLA-DRB1, повышающих риск развития рассеянного склероза в Алтайском крае Аллель Отношение Уровень Отношение Уровень или генотип шансов, среднее значимости, шансов, среднее значимости, риска РС значение (ДИ) р значение (ДИ) р Мужской пол Женский пол DRB1*15 1,10 (0,41-1,78) 0,656 1,17 (0,56-2,42) 0,4DRB1*3 1,29 (0,59-2,82) 0,528 0,77 (0,35-1,70) 0,7DRB1*15+13 1,58 (0,51-4.93) 0,417 0,63 (0,20-1,98) 0,8С высокой СП РС не ассоциирован ни один из генотипов TNF- (rs1800629), CD40 (rs6074022), KIF1B (rs10492972) (табл. 4), также как сочетание аллелей риска РС с мужским или женским полом (табл. 5).

Ни одна из аллелей риска РС исследованных генов не ассоциирована с частотой обострений этого заболевания (табл. 6).

Таблица Относительный риск высокой скорости прогрессирования рассеянного склероза в зависимости от генотипа TNF- (rs1800629), CD40 (rs6074022), KIF1B (rs10492972) Полиморфный Отношение Уровень Частоты локус гена/Скорость шансов, среднее значимости, генотипов, % прогрессирования РС значение (ДИ) р TNF- (rs1800629) G/G G/A A/A Низкая СП 27 9 0 0,88 (0,39-1,96) 0,7Умеренная СП 29 6 0 0,58 (0,23-1,46) 0,6Высокая СП 21 7 1 1,74 (0,69-4,39) 0,3KIF1B (rs10492972) T/T T/C C/C Низкая СП 17 15 4 0,83 (0,47-1,48) 0,7Умеренная СП 14 19 2 0,87 (0,49-1,55) 0,7Высокая СП 16 10 3 0,68 (0,36-1,29) 0,6CD40 (rs6074022) T/T T/C C/C Низкая СП 22 13 1 0,69 (0,36-1,33) 0,6Умеренная СП 16 18 1 0,95 (0,52-1,74) 0,5Высокая СП 14 15 0 0,92 (0,47-1,79) 0,5 Таблица Относительный риск высокой скорости прогрессирования рассеянного склероза в зависимости от сочетания пола и аллелей риска этого заболевания TNF-a (rs1800629), CD40 (rs6074022), KIF1B (rs10492972) Сочетание аллеля Отношение Уровень полиморфного локуса гена и пола шансов, среднее значимости, значение (ДИ) р TNF- (rs1800629), аллель А и мужской пол 1,15 (0,45-2,90) 0,6TNF- (rs1800629), аллель А и женский пол 0,85 (0,34-2,12) 0,7KIF1B (rs10492972), аллель С и мужской пол 0,61 (0,29-1,31) 0,8KIF1B (rs10492972), аллель С и женский пол 1,63 (0,76-3,50) 0,2CD40 (rs6074022), аллель С и мужской пол 0,64 (0,28-1,46) 0,8CD40 (rs6074022), аллель С и женский пол 1,57 (0,69-3,58) 0,4Таблица Взаимосвязь аллелей риска TNF-a (rs1800629), CD40 (rs6074022), KIF1B (rs10492972), HLA-DRB1 с частотой обострений рассеянного склероза Аллель риска РС Коэффициент Уровень полиморфного локуса гена корреляции Спирмена значимости, р TNF- (rs1800629), аллель А -0,130 0,5KIF1B (rs10492972), аллель С -0,106 0,4CD40 (rs6074022), аллель С 0,076 0,5HLA-DRB1, аллель 15 0,097 0,7HLA-DRB1, аллель 3 0,107 0,7Таким образом, исследованные полиморфные локусы генов, предрасполагающие к развитию РС в различных популяциях (Drulovic J. et al., 2003, Смагина И.В., Ельчанинова С.А., Золовкина А.Г., 2011) и кодирующие структуру белков, вовлеченных в патогенез РС, не ассоциируются с высокой СП РС, также как с частотой обострений. Относительным фактором риска высокой СП РС является мужской пол независимо от его сочетания с генотипом DRB1, TNF- (rs1800629), CD40 (rs6074022), KIF1B (rs10492972).

Взаимосвязь показателей воспаления и активации аутоиммунных процессов в центральной нервной системе с частотой обострений и скоростью прогрессирования рассеянного склероза Установлено, что в период обострения плеоцитоз был слабо выраженным и практически отсутствовал в период ремиссии РС (11,3±1,8 млн клеток/л и 1,8±0,2 млн клеток/л соответственно, р=0,012; в норме менее 5 млн клеток/л). Доля лимфоцитов в лейкограмме ликвора варьировала от 58 до 100%. Концентрация белка была невысокой и не изменялась при экзацербации заболевания (356±187 мг/л и 352±131 мг/л в обострение и ремиссию соответственно, р=0,739; в норме – менее 450 мг/л). Эти изменения в показателях клинического анализа ликвора характерны для РС (Миронова И.И., Романова Л.А., 2005).

При обострении по сравнению с периодом ремиссии была повышена в 5,2 раза концентрация TNF (р=0,031), отмечалась тенденция к увеличению уровня IL-1в (11,9±5,3 пг/мл и 9,6±3,7 нг/мл соответственно, р=0,094). Это соответствует представлениям об активации воспалительной компоненты патологического процесса в центральной нервной системе при обострении РС (Hohlfeld R., et al., 2007). Возможно, из-за широкого внутригруппового варьирования не выявлено значимого изменения уровня С-реактивного белка (при обострении 18,2±14,3 нг/л, в ремиссию 12,6±10,8 нг/л, р=0,099).

Ни по одному из исследованных показателей воспаления в головном мозге не выявлено различий в характере реагирования мужчин и женщин на экзацербацию заболевания.

Не обнаружено связи носительства аллеля А в полиморфном локусе rs1800629 гена TNF- с ликворным уровнем этого цитокина в ремиссию или обострение (rs=0,08, p=0,714).

Выявлена положительная корреляционная связь между количеством обострений за три года и уровнем TNF- (rs=0,58, p=0,041). Из показателей воспаления и активации аутоиммунных процессов только ликворный уровень TNF был ассоциирован с повышенным риском обострений РС в ближайшие три года (ОШ=3,05; ДИ 1,91-6,88; р=0,023). Ни один из этих показателей не увеличивает риск высокой СП РС, судя по величине отношения шансов.

Взаимосвязь показателей демиелинизации и глиоза с частотой обострений и скоростью прогрессирования рассеянного склероза При обострении РС по сравнению с периодом ремиссии в ликворе был повышен уровень компонента миелиновой оболочки аксонов – основного белка миелина (4,8±1,9 нг/мл и 1,2±0,4 нг/мл соответственно, р=0,029). При этом отмечалась лишь тенденция к повышению уровня внутриклеточного глиального компонента – белка S100 (82,1±27,0 нг/мл от 46,2±20,4 нг/мл, р=0,123). Это, вероятно, отражает более выраженное повреждение миелиновых структур по сравнению с глиозом при обострении РС.

Не обнаружено половых особенностей динамики ликворного содержания исследованных показателей демиелинизации и глиоза при экзацербации РС.

Выявлена положительная корреляционная связь уровня основного белка миелина в ликворе и степени инвалидизации по шкале EDSS (rs=0,544, p=0,037). Установлено, что ликворный уровень ни основного белка миелина, ни белка S100 не могут рассматриваться в качестве факторов риска быстрого прогрессирования РС (ОШ=2,12, ДИ 1,47-4,35, р=0,074; ОШ=0,56, ДИ 0,28-1,23, р=0,841 соответственно). Установлено также, что эти показатели демиелинизации и глиоза не ассоциированы с риском обострений РС в ближайшие три года после последнего обострения (ОШ=2,12, ДИ 1,47-4,35, р=0,074; ОШ=0,56, ДИ 0,28-1,23, р=0,841 соответственно).

Взаимосвязь показателей повреждения и проницаемости гемато-энцефалического барьера с частотой обострений и скоростью прогрессирования рассеянного склероза Динамика ликворных показателей повреждения и проницаемости ГЭБ при экзацербации РС приведена в таблице 7. При обострении относительно периода ремиссии был повышен уровень растворимых форм двух молекул адгезии – sPECAM-1 в 4,4 раза и sVCAM-1 – в 3,7 раза. Это согласуется с данными о выявлении в ликворе больных РС отсутствующих в норме мембранных компонентов эндотелия (De Vries H. E., Kuiper J., 1997, Kalinowska A., Losy J., 2006). Изменение концентрации sPECAM-1 и sVCAM-1, скорее всего, связано с более выраженным повреждением эндотелиоцитов ГЭБ в период обострения и подтверждает сложившееся мнение о роли этих адгезивных молекул в опосредовании проникновения лейкоцитов в ЦНС при РС (Noseworthy J.H., 2000, Hemmer B., Archelos J.J., 2002, Frohman E.M., 2006).

Отсутствие при экзацербации РС изменения уровня других специфичных для эндотелия адгезивных молекул – sCD141 (тромбомодулин), фактора Виллебранда и sVE-кадгерина, может быть связано с их меньшей экспрессией на эндотелиоцитах при РС по сравнению с sPECAM и sVCAM-1. Это логично с учетом функций этих молекул в нарушениях, не характерных для патологических процессов в ЦНС при РС. Рецептор тромбина – тромбомодулин и лиганд рецепторов тромбоцитов – фактор Виллебранда, как известно, участвуют в активации свертывания крови (Лупинская З.А., 2003; Долгов В.В., Свирин П.В., 2005; Kohriyama T., 1997), тогда как sVE-кадгерин опосредует формирование гомофильных межклеточных контактов эндотелиоцитов в основном при ангиогенезе (Рубина К.А. и др., 2007; Zhong Y. et al., 2004). Биохимические признаки усиления повреждения эндотелия ГЭБ в период обострения сочетались с повышением относительно периода ремиссии концентрации ММР-2 – сериновой протеазы, участвующей в деградации коллагена и других структурных белков соединительной ткани (Anthony D.C., 1997; Avolioa C., Reqqierib M., 2003).

Таблица Ликворные паттерны показателей повреждения и проницаемости ГЭБ у больных рассеянным склерозом в периоды обострения и ремиссии (M ± SD) Показатель Обострение Ремиссия Уровень n=60 n=60 значимости различий, р sPECAM-1, нг/мл 4,8 ± 0,9 1,1 ± 0,3 0,0sVCAM-1, нг/мл 29,5 ± 8,1 7,9 ± 4,6 0,0sCD141 (тромбомодулин), нг/мл 0,24 ± 0,14 0,21 ± 0,11 0,4sVE-кадгерин, нг/мл 3,2 ± 1,9 2,9 ± 1,8 0,4Фактор Виллебранда, Ед/мл 1,8 ± 0,6 2,1 ± 1,0 0,4ММР-2, нг/мл 48,3 ± 9,4 20,5 ± 8,8 0,0Соотношение альбумин ликвора/ 0,010 ± 0,001 0,004 ± 0,001 0,0альбумин плазмы крови (норма:

менее 0,007) Вероятно, следствием повреждения основных элементов ГЭБ – эндотелия и соединительной ткани – было увеличение его проницаемости, о которой свидетельствовало повышение соотношения альбумин ликвора/альбумин плазмы крови в период обострения РС до патологических значений. Ликворные паттерны показателей повреждения и проницаемости ГЭБ у мужчин и женщин, как в период обострения, так и в период ремиссии, статистически не различались.

В период обострения РС выявлена положительная связь между концентрацией TNF- и концентрацией sVCAM-1 (rs=0,342 p=0,039), а также между концентрацией основного белка миелина и содержанием в ликворе лимфоцитов (rs=0,310, p=0,041). Это соответствует представлениям о патогенетических связях активации/повреждения эндотелия ГЭБ с лимфоцитарной инфильтрацией, активностью воспаления и демиелинизации в тканях головного мозга при РС (Гусев Е.И., Завалишин И.А., 2004). Выявлена положительная корреляция СП РС с уровнем sVCAM-1 (rs=0,351, p=0,018) и sPECAM-1 (rs=0,642, p<0,001). Расчеты показали, что концентрации в ликворе sPECAM-1, sVCAM-1 и MMP-2 могут служить прогностическими маркерами быстрого прогрессирования неврологических нарушений (табл. 8).

Таблица Относительный риск высокой скорости прогрессирования рассеянного склероза при уровне показателей повреждения и проницаемости ГЭБ ликвора в период обострения выше медианы Показатель Медиана Отношение Уровень шансов, среднее значимости, значение (ДИ) р sPECAM-1, нг/мл 4,6 4,16 (1,22-8,91) 0,0sVCAM-1, нг/мл 28,6 3,30 (1,04-7,38) 0,0sCD141 (тромбомодулин), нг/мл 0,22 0,63 (0,38-1,31) 0,3sVE-кадгерин, нг/мл 3,4 0,68 (0,34-1,41) 0,2Фактор Виллебранда, Ед/мл 1,8 0,74 (0,28-1,46) 0,2ММР-2, нг/мл 49,0 3,08 (2,33-4,41) 0,0Соотношение альбумин ликво- 0,010 1,57 (0,69-3,58) 0,3ра/альбумин плазмы крови Норма: менее 0,0Обнаружена положительная корреляционная связь между количеством обострений РС за три года и концентрацией MMP-2 (rs=0,841, p=0,033). При оценке относительного риска обострений РС установлено, что из всех исследованных показателей повреждения и проницаемости ГЭБ только уровень MMP-2 может служить прогностическим маркером течения заболевания (ОШ=2,28; ДИ 1,86-4,55; р=0,029).

В трехлетнем проспективном наблюдении, по данным обследования в ремиссию, выявлено нарастание неврологического дефицита у 25 пациентов (10 мужчин, 15 женщин), составивших 41,7% от числа больных, включенных в исследование. Из числа этих пациентов у двух мужчин (3,3%) произошел переход во вторично-прогредиентное течение РС.

Неврологические нарушения по шкале EDSS прогрессировали от 3,1±0,3 баллов до 4,7±0,5 балла (р=0,031). Скорость прогрессирования РС составила 0,53±0,19 балла/год и не изменилась по сравнению с периодом до включения в исследование (0,50±0,15, р=0,312).

Выявлена положительная связь СП РС с уровнем sPECAM-1 (rs=0,440, p=0,036), sVCAM-1 (rs=0,349, p=0,045) и MMP-2 (rs=0,378, p=0,041). Относительный риск высокой СПРС для sPECAM-1 составил 3,49 (ДИ 1,71-8,57, р=0,034), для sVCAM-1 – 3,85 (ДИ 1,62-8,16, р=0,041), для MMP-2 – 2,95 (ДИ 1,48-6,02, р=0,048). Это согласуется с данными о прогностическом значении ликворных уровней этих белков, полученными нами в ретроспективном исследовании.

Клиническая информативность патобиохимических показателей ликвора как прогностических биомаркеров течения рассеянного склероза Для оценки клинической информативности прогностически значимых патобиохимических показателей течения РС был проведен ROC-анализ (receiver operating characteristic analysis), результаты которого представлены в таблице 9.

Таблица Клиническая информативность биомаркеров течения рассеянного склероза по результатам ROC-анализа Пороговый Чувствительность, Специфичность, + ОП -ОП Площадь уровень в % % под ROCликворе кривой sPECAM-1 при прогнозе высокой скорости прогрессирования > 5 нг/мл 73,7 95,4 16,2 0,2 0,(56,9-86,6) (77,1-99,8) (0,72-0,93) sVCAM-1 при прогнозе высокой скорости прогрессирования > 29 нг/мл 79,1 70,0 3,3 0,5 0,(57,9-92,9) (45,7-88,1) (0,65-0,93) MMP-2 при прогнозе высокой скорости прогрессирования > 49 нг/мл 69,1 70,4 4,1 0,5 0,(44,5-86,7) (43,8-86,3) (0,59-0,89) MMP-2 при прогнозе обострения в течение ближайших трех лет > 49 нг/мл 70,0 75,0 8,0 0,5 0,(45,7-88,1) (47,6-92,7) (0,60-0,93) TNF- при прогнозе обострения в течение ближайших трех лет > 23 пг/мл 72,2 77,8 10,0 0,5 0,(46,5-90,3) (52,4-93,6) (0,65-0,96) Примечание: +ОП и -ОП – положительное и отрицательное отношение правдоподобия (отношение вероятности получения соответственно положительного или отрицательного результата теста при наличии указанного события в течении заболевания к вероятности получения такого же результата теста в отсутствии указанного события в течении заболевания); в скобках – 95% доверительный интервал.

Установлено, что исследованные биомаркеры имели чувствительность от 69% до 79% и специфичность от 70% до 95%.

Судя по отношению правдоподобия, наилучшие сочетания чувствительности и специфичности имеет sPECAM-1 – как детерминанта быстрого прогрессирования и TNF- – как показатель вероятности обострения в ближайшие три года. Для этих маркеров была наибольшей и величина базового интегрального показателя клинической информативности – площадь под характеристической кривой (receiver operating characteristic curve).

Таким образом, приемлемую для практики клиническую информативность в отношении прогноза обострения РС в ближайшие три года имеют концентрации в ликворе TNF- и MMP-2, в отношении вероятности быстрого прогрессирования заболевания sPECAM-1 и sVCAM-1.

Проведенные исследования позволяют заключить, что выраженность повреждения ГЭБ и нарастания ликворного уровня триггера аутоиммунного воспаления – TNF- у больных РС в значительной степени влияет на СП неврологических нарушений. В аспекте разработки новых подходов к управлению течением РС можно считать перспективным исследование механизмов, которые могут ослабить эти патогенетические процессы в центральной нервной системе.

ВЫВОДЫ 1. С высокой скоростью прогрессирования рассеянного склероза, также как с частотой обострений этого заболевания, не ассоциированы полиморфные локусы генов HLA-DRB1, TNF- (rs1800629), CD(rs6074022) и KIF1B (rs10492972).

2. Фактором риска высокой скорости прогрессирования рассеянного склероза является мужской пол независимо от его сочетания с генотипами полиморфных локусов генов HLA-DRB1, TNF- (rs1800629), CD40 (rs6074022) и KIF1B (rs10492972).

3. Обострение рассеянного склероза характеризуется комплексом независимых от пола патобиохимических признаков усиления воспаления в центральной нервной системе, демиелинизации и повреждения гематоэнцефалического барьера: слабовыраженным плеоцитозом с лимфоцитозом, повышением в ликворе концентрации TNF-, основного белка миелина, ММР-2, адгезивных молекул – sPECAM-1 и sVCAM-1, увеличением соотношения альбумин ликвора/альбумин плазмы крови.

4. Гиперэргичность патологических реакций, проявляющихся повреждением гематоэнцефалического барьера и повышением ликворного уровня TNF-, степень которого не связана с полиморфизмом гена TNF- (rs1800629), является фактором экзацербации и ускоренного развития необратимых неврологических нарушений при рассеянном склерозе.

5. Прогностическими биомаркерами быстрого прогрессирования рассеянного склероза являются уровни в ликворе sPECAM-1, sVCAM-1 и ММР-2, прогностическими биомаркерами обострения в течение ближайших трех лет – концентрация в ликворе TNF- и ММР-2.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ При выборе тактики терапии рассеянного склероза рекомендуется учитывать факторы, влияющие на течение этого заболевания:

1) риск высокой скорости прогрессирования повышен в 4,2 раза при концентрации в ликворе sPECAM-1 выше 5 нг/мл (чувствительность – 74%, специфичность – 95%), в 3,3 раза при концентрации sVCAM-выше 29 нг/мл (чувствительность – 79%, специфичность – 70%), в 3,раза при концентрации MMP-2 выше 49 нг/мл (чувствительность – 69%, специфичность – 70%);

2) риск обострения рассеянного склероза в ближайшие три года повышен в 3,3 раза при концентрации в ликворе TNF- выше 23 пг/мл (чувствительность – 72%, специфичность – 78%), в 2,9 раза при концентрации в ликворе ММР-2 выше 49 нг/мл (чувствительность – 70%, специфичность – 75%).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК 1. Ельчанинова С.А., Смагина И.В., Сидоренко В.А., Личенко Ю.Н., Поповцева А.В., Федянин А.С. Молекулы адгезии и провоспалительные цитокины в спинномозговой жидкости больных рассеянным склерозом // Бюлл. Сиб. мед. – 2009. – Т. 8, № 1 (2), тематический выпуск. – С. 23-26.

2. Игнатова Ю.Н., Смагина И.В., Гридина А.О., Сидоренко В.А., Поповцева А.В., Смирнова О.В., Ельчанинова С.А., Федянин А.С. Ретробульбарный неврит у больных рассеянным склерозом // Бюлл. Сиб.

мед. – 2009. – Т. 8, № 3 (2). – С. 115-117.

3. Смагина И.В., Ельчанинова С.А., Поповцева А.В., Игнатова Ю.Н., Золовкина А.Г., Гридина А.О. Клинические и лабораторные предикторы высокой скорости прогрессирования рассеянного склероза // Кремлевская медицина. Клинический вестник. – 2010. – № 4. – С. 16-18.

4. Смагина И.В., Ельчанинова С.А, Поповцева А.В., Игнатова Ю.Н., Гридина А.О., Федянин С.А. Перспективы лабораторной оценки риска обострения и прогрессирования рассеянного склероза // Бюлл. Сиб.

мед. – 2010. – Т. 9, № 4. – С. 152-156.

Прочие публикации в научных журналах, материалах конференций и съездов, сборниках статей:

5. Ельчанинова С.А., Смагина И.В., Поповцева А.В., Сидоренко В.А., Личенко Ю.Н., Плотникова О.И. Маркеры повреждения нервной ткани в спинномозговой жидкости больных рассеянным склерозом в период обострения и ремиссии // Труды научн.-практ. конф.. Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 20года. – 2009. – С. 400.

6. Ельчанинова С.А., Федянин С.А., Смагина И.В., Игнатова Ю.Н., Гридина А.О., Поповцева А.В. Конвекционные и генетические факторы риска рассеянного склероза в Алтайском крае // Вестник Алтайской науки. – 2010. – № 1(8). – С. 5-7.

7. Ельчанинова С.А., Смагина И.В., Поповцева А.В., Золовкина А.Г. Лабораторная оценка риска высокой скорости прогрессирования рассеянного склероза // Клиническая лабораторная диагностика. – 2010. – № 9. – С. 50-51.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ГЭБ - гематоэнцефалический барьер ДИ - 95% доверительный интервал ОБМ - основной белок миелина ОШ - отношение шансов РС - рассеянный склероз СП РС - скорость прогрессирования рассеянного склероза EDSS - расширенная шкала инвалидизации (Expanded Disability Status Scale) HLA - антигены лейкоцитов человека (Human Leukocyte Antigen) IL-1в - интерлейкин-1бета (interleukin-1beta) MMP-2 - матриксная металлопротеиназа 2-го типа (matrix metalloproteinase-2) PECAM-1 - тромбоцитарно-эндотелиальная молекула адгезии 1 типа (platelet endothelial cell adhesion molecule – 1) TNF- - фактор некроза опухолей альфа (tumor necrosis factor б) VCAM-1 - молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа (vascular cell adhesion molecule – 1) Соискатель На правах рукописи ПОПОВЦЕВА АННА ВАЛЕНТИНОВНА СВЯЗЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И НЕЙРОБИОХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ С ПРОГРЕССИРОВАНИЕМ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ 14.03.03 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Барнаул – 20_____________________________________________________________________________ Подписано в печать 14.04.20Формат 60х90/16. Бумага офсетная.

Печать ризографическая.

Гарнитура Таймс Нью Роман.

Тираж 100 экз. Объем 1,0 п. л. Заказ № Алтайский государственный медицинский университет г. Барнаул, пр. Ленина,






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.