WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

на правах рукописи

ПЛЮТИНСКАЯ АННА ДМИТРИЕВНА

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НОВЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ РАЗРАБОТАННЫХ МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ В СИСТЕМЕ IN VITRO

14.01.12 онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А.Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор – академик РАМН, профессор В.И.Чиссов).

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Якубовская Раиса Ивановна

Руководитель отделения модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии ФГБУ «МНИОИ им.П.А.Герцена» Минздрава РФ

Официальные оппоненты:

1. Доктор медицинских наук, профессор Герасимова Галина Константиновна, ведущий научный сотрудник лаборатории биотерапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН

2. Доктор биологических наук Страховская Марина Глебовна,  старший научный сотрудник кафедры биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « 20 » ноября 2012 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.047.01 при ФГБУ «МНИОИ им.П.А.Герцена» Минздрава РФ по адресу: 125284, Москва, 2-й Боткинский проезд, д.3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «МНИОИ им.П.А.Герцена» Минздрава РФ

Автореферат разослан « 19 » октября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Завалишина Лариса Эдуардовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Фотодинамическая терапия (ФДТ) - перспективное направление лечения злокачественных новообразований, основанное на разрушении структурных элементов опухоли активными формами кислорода и свободными радикалами, которые образуются при взаимодействии накопившегося в опухолевом узле фотосенсибилизатора со светом определенной длины волны [Красновский А.А., 2004, Гельфонд М.Л., 2007].

В онкологии ФДТ применяется при тяжелых дисплазиях, начальных поверхностно расположенных опухолях различной локализации, первичном раке у больных с тяжелой сопутствующей патологией, при лечении глубокорасположенных опухолей с применением интерстициального варианта метода, а также при местно распространенном и диссеминированном раке органов брюшной полости - интраоперационно.

Как за рубежом, так и в России создан ряд лекарственных средств для ФДТ злокачественных новообразований («Фотофрин» (США), «Фотогем» (Россия), «Фотосенс» (Россия), «Радахлорин» (Россия), «Фотолон» (Беларусь), «Фотодитазин» (Россия), «Фоскан» (Великобритания)), характеризующихся высокой противоопухолевой эффективностью. Однако используемые в настоящее время препараты имеют максимум поглощения в области 630 - 675 нм, где проницаемость биологических тканей незначительна и составляет несколько миллиметров, что ограничивает широкое использование метода ФДТ. Кроме того, наряду с высокой активностью, препараты на основе порфиринов и фталоцианинов обладают длительной кожной токсичностью. Поэтому в последние годы ведется направленный поиск новых фотосенсибилизаторов с улучшенными свойствами:  наличием интенсивной полосы поглощения в дальней красной и ближней инфракрасной областях спектра, высоким квантовым выходом синглетного кислорода и коэффициентом экстинкции, определяющим высокую эффективность ФДТ, устойчивостью в темновых условиях и при облучении, быстрой элиминацией из организма и, соответственно, низкой кожной токсичностью.

К настоящему времени синтезированы десятки веществ как природного, так и синтетического происхождения, относящихся к различным классам (хлоринов, бактериохлоринов, фталоцианинов и др.), которые, благодаря своим структурным особенностям, физико-химическим и фотофизическим свойствам, могут рассматриваться как перспективные фотосенсибилизаторы для диагностики и терапии онкологических заболеваний [LoP.C., HuangJ.D., 2007; DabrowskiJ.M., ArnautL.G., 2010;WangX., LiuW., 2011; HorneT., AbrahamseH., 2012]. Однако сравнение и выбор наиболее перспективных соединений представляют большие сложности вследствие отсутствия единой методологии их изучения в системе in vitro.

В связи с этим, актуальной задачей на сегодняшний день является не только поиск фотосенсибилизаторов с улучшенными свойствами, но и разработка системы скрининга новых субстанций для ФДТ, позволяющая адекватно оценивать свойства красителей, сравнивать их и отбирать наиболее перспективные соединения для дальнейшего исследования.

Цель исследования

Целью настоящей работы является сравнительное изучение и отбор активных экзогенных фотосенсибилизаторов в системе in vitro на основе разработанной методики скрининга.

Задачи исследования

1. Разработать методику скрининга, включающую анализ физико-химических, фотофизических и биологических свойств фотосенсибилизаторов.

2. Разработать мультипараметрическую систему адекватной оценки фотоиндуцированной противоопухолевой активности фотосенсибилизаторов относительно опухолевых клеток различного гистогенеза, используя официнальные препараты «Фотогем», «Фотосенс», «Радахлорин».

3. Изучить растворимость и стабильность (без светового воздействия и при облучении) соединений различных классов в бесклеточной среде с применением абсорбционного и флуоресцентного методов анализа.

4. Провести сравнительное исследование фотоиндуцированной активности новых производных природного хлорофилла а и бактериохлорофилла а, синтетических тетрагидро- и тетраазапорфиринов на опухолевых клетках человека в культуре. Оценить корреляцию между структурой фотосенсибилизаторов и их эффективностью при фотодинамическом воздействии (ФДВ).

5. По результатам изучения физико-химических, фотофизических и биологических свойств отобрать наиболее перспективные фотосенсибилизаторы для дальнейшего изучения in vivo.

6. Изучить внутриклеточную локализацию ряда красителей с целью выявления и идентификации внутриклеточных мишеней.

Научная новизна исследования

Разработана методика скрининга фотосенсибилизаторов, включающая оценку их физико-химических и фотофизических свойств, а также фотоиндуцированной противоопухолевой активности с использованием мультипараметрической системы, позволяющей выявлять зависимость выраженности фототоксического эффекта от различных параметров.

Впервые, с применением этой методики, проведено сравнительное изучение новых оригинальных соединений (n=61): производных природного хлорофилла а (пирофеофорбид а, хлорин е6 и хлорин р6, пурпуринимиды), бактериохлорофилла а (бактериопурпуринимиды), синтетических тетрагидро- и тетраазапорфиринов (фталоцианины) с различными боковыми заместителями и центральными атомами металлов, и выявлено их значительное преимущество по эффективности при ФДВ in vitro и физико-химическим свойствам перед немодифицированными аналогами. Показана вариабельность фотоиндуцированной цитотоксичности соединений в зависимости от природы боковых заместителей.

Впервые проведено сравнительное изучение внутриклеточной локализации производных хлорина р6 и фталоцианинов и показана ее зависимость от химической структуры и физико-химических свойств соединений.

Практическая значимость

Разработанная и апробированная многопараметрическая система оценки эффективности новых соединений in vitrо позволяет эффективно отбирать перспективные фотосенсибилизаторы и, таким образом, существенно снижать затраты на проведение дальнейших скрининговых исследований in vivo. С использованием данной системы по совокупности свойств и технологичности получения выбраны перспективные красители из классов хлорина р6, бактериохлорина и фталоцианина для дальнейшего изучения противоопухолевой эффективности в системе in vivo. Производные фталоцианина явились основой для создания препаратов «Фталосенс-лио» и «Холосенс-лио», предназначенных для ФДТ злокачественных новообразований, доклиническое изучение которых завершено к настоящему моменту.

Результаты исследований включены в «Методические указания по изучению фотоиндуцированных противоопухолевых свойств фармакологических веществ и лекарственных средств» для издания в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под редакцией Р.У.Хабриева.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанная система скрининга новых фотосенсибилизаторов, включающая оценку физико-химических и фотофизических свойств, а также фотоиндуцированной активности, с учетом ее вариабельности от множества параметров, позволила изучить 61 соединений на основе гидрированных порфиринов и тетраазапорфиринов и рекомендовать наиболее перспективные из них для дальнейшего изучения in vivo.

2. Фотоиндуцированная противоопухолевая активность фотосенсибилизаторов зависит от их химической структуры, природы боковых заместителей и центральных атомов металла. Охарактеризованные и переданные для экспериментов на животных 7 наиболее активных соединений, обладали высокой фотоиндуцированной цитотоксичностью, которая возрастала в ряду: производные фталоцианина (max= 690 нм) синтетические тетрагидропорфирины (max= 740-760 нм) << пурпуриниимиды (max= 710-740 нм) бактериопурпуринимиды (max= 780-830 нм).

3. Локализация фотосенсибилизаторов в опухолевых клетках зависела от их химической структуры и физико-химических свойств. Гидрофобные и амфифильные соединения (пурпуринимиды) преимущественно накапливались в клеточных органеллах (аппарат Гольджи, митохондрии, липидные капли), а гидрофильные (производные фталоцианина) – диффузно распределялись по цитоплазме. Выявлено, что накопление фотосенсибилизаторов в аппарате Гольджи и митохондриях ассоциировано с высокой фотоиндуцированной активностью in vitro.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на межотделенческой конференции ФГБУ «МНИОИ им. П.А.Герцена» Минздравсоцразвития России 6 сентября 2012г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 8 в журналах, рекомендованных ВАК. По теме диссертации получен патент РФ: «Фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии» (№ 2282646, рег. 27.08.2006), поданы заявки на патенты № 2012105449 и № 2012105450 от 17.02.2012.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 163 источника. Работа содержит 49 рисунков, 25 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Материалы и методы

Фотосенсибилизаторы

Официнальные препараты

«Фотогем» (ООО «ФОТОГЕМ») - смесь мономерных, димерных и олигомерных порфиринов - 76-78%, хлорида натрия - 18-20% и воды. Содержит 200 мг активного вещества, легко растворим в дистиллированной воде и физиологическом растворе, λmax =  630 нм. Диапазон концентраций препарата в экспериментах составлял от 0,6 до 80 мкг/мл.

«Фотосенс» (ФГУП ГНЦ «НИОПИК») - смесь определенного состава натриевых солей сульфированного фталоцианина алюминия (от ди- до тетразамещенного) в дистиллированной воде. Раствор «Фотосенса» 0,2% для инъекций, прозрачный, интенсивного сине-бирюзового цвета, без запаха, λmax = 670 нм.  Диапазон концентраций фотосенсибилизатора составлял от 0,6 до 80 мкг/мл.

«Радахлорин» (ООО «РАДА-ФАРМ») - композиция из трех циклических тетрапирролов хлориновой природы, основной из которых (80-90%) - хлорин е6. Раствор «Радахлорина» 0,35% для инъекций, прозрачный, темно-зеленого цвета с характерным запахом. Вспомогательные вещества: N-метил-D-глюкамин - 0,20 г, вода для инъекций - до 100 мл, λmax = 660 нм. Диапазон концентраций фотосенсибилизатора составлял от 0,6 до 60 мкг/мл.

Новые соединения

В работе изучено 70 соединений разных классов. Однако при оценке их физико-химических свойств выявлено, что 9 субстанций плохо растворялись в биосовместимых средах, вследствие чего эти соединения были исключены из дальнейшего исследования.

Производные пирофеофорбида а, хлорина е6, хлорина р6, бактериохлорина р синтезированы на кафедре химии и технологии биологически активных соединений МИТХТ им. М.В.Ломоносова под руководством д.х.н., проф. А.Ф. Миронова и д.х.н., проф. М.А. Грина. Для растворения использовали 5-7 мкл 100% Кремофора EL, доводя до концентрации 1 мг/мл дистиллированной водой (содержание кремофора в растворе составляло 10%). Диапазон концентраций соединений варьировали для физико-химических исследований – от 2 до 20 мкМ, для биологических исследований – от 5 нМ до 2 мкМ.

Производные фталоцианина и синтетические тетрагидропорфирины синтезированы в лаборатории отдела функциональных красителей ФГУП ГНЦ «НИОПИК» под руководством д.х.н., проф. Е.А.Лукьянца. Для их растворения использовали 0,9% раствор NaCl. Концентрация растворов составляла 1 мг/мл. Диапазон концентраций фотосенсибилизаторов варьировали для физико-химических исследований – от 5 до 40 мкМ, для биологических исследований – от 20 до 300 мкМ.

Биологические объекты

       Культуры опухолевых клеток человека: Raji (лимфома Беркитта), НЕр2 (эпидермоидная карцинома гортаноглотки), А549 (карцинома легкого), НТ29 (карцинома толстой кишки), Т24 (карцинома мочевого пузыря). Культуры клеток получены из НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. В работе использовали клеточные линии от 3 до 18 пассажей.

Аппаратура

- спектрофотометр «Genesys 2» (Thermo Spectronic, США);

- лазерная электронно-спектральная установка «ЛЭСА-06» (ТОО «Биоспек», Москва, Россия);

- планшетный фотометр Multiskan ex Thermo (Labsystem, Finland);

- источник оптического излучения - галогеновая лампа мощностью 500 Вт (диаметр светового пятна 70 мм) с набором фильтров: водный (толщина 5 см,  оснащенный системой циркуляции жидкости, λ≥900 нм) и кварцевые, пропускание которых максимально соответствовало спектральному диапазону поглощения сенсибилизатора (λ≥600, 640, 720 нм).

- измеритель плотности мощности ИПМО (НПО «Полюс», Россия).

Методики исследований

Регистрацию спектров поглощения новых соединений в растворах проводили в диапазоне длин волн от 450 до 850 нм сразу после приготовления растворов, через  2, 4 и 24 часа в кварцевых кюветах для спектрофотометров с длиной оптического пути – 10 мм. В качестве растворителя использовали среду Игла, содержащую 7% ЭТС, 1% и 10% водные растворы Кремофора EL и Тритона Х-100. В ходе исследования оценивали изменения оптической плотности и характера спектра в выбранном временном диапазоне.

Регистрацию флуоресценции новых фотосенсибилизаторов в растворах проводили контактным способом на лазерном анализаторе «ЛЭСА-06». Флуоресценцию возбуждали He-Ne лазером (длина волны генерации 632,8 нм, спектральный диапазон от 640 до 800 нм). Измерение флуоресценции проводили сразу после приготовления растворов фотосенсибилизаторов, через 2, 4 и 24 часа в стеклянных пробирках (d=10 мм). В качестве растворителей использовали среду Игла, содержащую 7% ЭТС, 1% и 10% водные растворы Кремофора EL и Тритона Х-100. С каждого образца регистрировали по 3-4 спектра. При их математической обработке определяли интегральную интенсивность флуоресценции в пределах ±10 нм от спектрального максимума. Оценивали изменения в интенсивности флуоресценции и характере спектра в динамике.

Фотоустойчивость фотосенсибилизаторов оценивали по изменению характера и интенсивности спектра флуоресценции в растворе до и после облучения светом. Исследование осуществляли следующим образом: в лунки плоскодонного 96-луночного микропланшета (Corning, США) вносили по 150 мкл раствора фотосенсибилизатора выбранной концентрации в полной культуральной среде. Затем раствор облучали полихроматическим светом (доза света 5 и 10 Дж/см2). Спектры регистрировали до воздействия светом, через 5 и 10 минут после начала облучения. Время облучения рассчитывали исходя из плотности мощности и заданной плотности энергии по формуле: Ws=Pst, где Ws - заданная плотность энергии (Дж/см2), Ps-заданная плотность мощности (Вт/см2), t - время воздействия (сек).

Методика проведения фотодинамического воздействия на опухолевые клетки

Клетки рассевали в 96-луночные культуральные планшеты, инкубировали в течение 28 часов при 37оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода (стандартные условия). Посевная концентрация клеток устанавливалась для каждой культуры с таким расчетом, чтобы воздействие проходило в экспоненциальной (логарифмической) фазе роста клеток. Далее в планшеты вносили фотосенсибилизаторы в различных концентрациях (при двух- или трехкратных последовательных разведениях в дуплетах) и проводили облучение галогеновой лампой с набором фильтров, режим облучения - непрерывный. После воздействия светом клетки инкубировали в стандартных условиях 24-28 часов. Оценку выживаемости клеток проводили с использованием МТТ – теста. Уровень ингибирования пролиферации клеток вычисляли по формуле: ИП (%) = [(ODк - ODо)/ ODк ] х 100%, где: ИП - уровень ингибирования пролиферации клеток в культуре;  ODо - оптическая плотность раствора формазана в опытных лунках; ODк - оптическая плотность раствора формазана в контрольных лунках (без фотосенсибилизатора), λ =  550 нм. В качестве критерия эффективности соединений при ФДВ использовали величину ИК50, для ее расчета строили кривую зависимости ингибирования пролиферации от концентраций исследованного фотосенсибилизатора.

       Статистический анализ полученных данных проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel, OriginPro 5,0. Линейные величины сравнивали по методу Стьюдента. Достоверными считали отличия при р<0,05.

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Разработка методических подходов к изучению новых экзогенных ФС в системе in vitro на опухолевых клетках человека.

К настоящему моменту доклиническое изучение фотосенсибилизаторов, как фармакологических средств для онкологии, не приобрело соответствующей методической базы, что приводит к произвольному использованию разнообразных методик в работе. Отсутствие единой системы оценки эффективности красителей в биологической системе влечет за собой получение неадекватных результатов в исследованиях, а также трудности при их сравнении и выборе наиболее перспективных соединений. Поэтому одной из первоочередных задач диссертационной работы являлась разработка методики скрининга красителей с учетом их физико-химических, фотофизических и биологических свойств, где наиболее сложной и неизученной являлась задача адекватной оценки фотоиндуцированной активности соединений относительно опухолевых клеток с учетом вариабельности эффективности ФДВ от множества параметров.

При разработке многопараметрической системы оценки фотоиндуцированной цитотоксичности фотосенсибилизаторов при ФДВ использовали официнальные препараты «Фотогем», «Фотосенс» и «Радахлорин». На первом этапе исследований проводили стандартизацию биологической модели. В нашей работе мы использовали культуры опухолевых клеток различного эпителиального происхождения, что обусловлено спецификой проведения ФДТ в клинике. Нами были выбраны монослойные культуры опухолевых клеток человека: НЕр2, А549, НТ29 и Т24, определены их кинетические параметры роста и посевная концентрация, при которой клетки на момент воздействия находились в экспоненциальной фазе роста (60х104 кл/мл). Второй этап включал оценку фотоиндуцированной цитотоксичности фотосенсибилизаторов в мультипараметрической системе в зависимости от их концентрации в среде инкубации, дозы света при воздействии, временного интервала после внесения красителя до облучения, проведения облучения в присутствие красителей и с их удалением непосредственно перед облучением.

Поскольку одним из составляющих ФДВ in vitro является световое воздействие, которое можно избрать постоянным для всех экспериментов, сначала определяли оптимальную дозу света, используя одну клеточную линию (НЕр2) и время инкубации 2 часа, при варьировании концентрации соединений и плотности энергии. Результаты этих экспериментов показали, что плотность энергии 2,5 и 5 Дж/см2 была недостаточной для полной реализации фототоксического эффекта для всех трех фотосенсибилизаторов, в то время как эффективность ФДВ при 10 и 20 Дж/см2 оказалась сопоставимой. Поэтому в дальнейших исследованиях плотность энергии составляла 10 Дж/см2 (таблица 1).

Таблица 1.

Фотоиндуцированная активность Фотогема, Фотосенса и Радахлорина в зависимости от дозы света. Культура клеток НЕр2.

Препарат

Доза света, Дж/см2

2,5

5

10

20

ИК50, мкг/мл

Фотогем

14,5±0,8

10,2±0,7

7,8±0,7

7,6±0,6

Фотосенс

15,3±1,2

4,5±0,7

2,5±0,4

2,3±0,3

Радахлорин

19,1±1,8

6,4±0,9

4,5±0,7

4,6±0,8

Продолжая исследования на клетках культуры НЕр2 с выбранной дозой света 10 Дж/см2 и облучением в присутствии фотосенсибилизатора в среде в зависимости от времени инкубации с препаратами «Фотогем», «Фотосенс» и «Радахлорин» в широком диапазоне концентраций. Как видно из данных, представленных на рис. 1, концентрационная зависимость и время инкубации с препаратами, необходимые для достижения максимального эффекта, являлись индивидуальными показателями для каждого фотосенсибилизатора. Это свидетельствует о том, что для адекватной оценки фотоиндуцированной активности соединений целесообразно включить в протокол исследования оценку данных параметров.

Рис.1. Фотоиндуцированная активность Фотогема (1), Фотосенса (2) и Радахлорина (3) в зависимости от концентрации в среде и времени инкубации (культура клеток НЕр2).

Для косвенной оценки внутриклеточного накопления красителей облучение проводили параллельно в двух вариантах: в присутствии красителя в среде и с его удалением непосредственно перед облучением. Сопоставление эффектов, полученных в этих двух вариантах облучения, позволяет оценить вклад фотоиндуцированного повреждения, обусловленного красителем, накопившимся внутри клеток. Следует отметить, что при облучении клеток после удаления Фотогема, Фотосенса или Радахлорина из среды инкубации ИК50 возрастает. Это указывает на то, что только часть фотосенсибилизатора проникает в клетки и накапливается в них.

При этом абсолютные величины, характеризующие эффективность фотосенсибилизаторов при облучении клеток после удаления препаратов из среды инкубации, не влияют на результат их сравнительной оценки (рис. 2).

Рис. 2. Фотоиндуцированная активность официнальных препаратов в зависимости от их присутствия в среде во время облучения (голубые столбцы) и после удаления (синие столбцы).

Таким образом, при первоначальном изучении новых фотосенсибилизаторов целесообразно включить в протокол оценку их фотоиндуцированной цитотоксичности на одной клеточной линии, в зависимости от концентрации, времени инкубации до воздействия, вариантами облучения в присутствии фотосенсибилизатора в среде и с его удалением, при фиксированной дозе света 10 Дж/cм2.

По данным литературы отмечено, что фотоиндуцированная активность фотосенсибилизаторов зависит от природы опухолевых клеток в культуре и плотности монослоя на момент воздействия. Поэтому мы исследовали фотоиндуцированную цитотоксичность новых соединений на 3-х различных культурах опухолевых клеток человека (эпидермоидной карциноме гортаноглотки – НЕр2, карциноме легкого – А549, карциноме толстой кишки – НТ29) при различной плотности клеточной популяции (от 3х104 до 12х104 клеток/мл).

Показано, что эффективность при ФДВ Фотосенса и Радахлорина на разных культурах отличалась, а клетки в конфлюэнтном монослое были более устойчивы к фотодинамическому воздействию (рис. 3, 4). Эти данные подтвердили целесообразность изучения фотоиндуцированной цитотоксичности соединений на нескольких клеточных линиях (с предварительной оценкой оптимального времени инкубации до воздействия).

Таким образом, на основании полученных результатов разработана многопараметрическая методика тестирования соединений на опухолевых клетках in vitro для выявления их максимальной фотоиндуцированной активности. Для этого на первом этапе оценивали фотоиндуцированную цитотоксичность соединений на одной клеточной линии при фиксированной дозе света, варьируя концентрации красителей, время  инкубации до воздействия светом, облучение в присутствии соединений в среде и с их удалением непосредственно перед воздействием. На втором этапе проводили углубленное изучение эффективности фотосенсибилизаторов при ФДВ по той же методике, расширив панель клеточных культур. Данная методика включена в «Методические указания по изучению фотоиндуцированных противоопухолевых свойств фармакологических веществ и лекарственных средств».

Методика оценки эффективности фотосенсибилизаторов в системе in vitro

____________________________________________________________________________

Культуры клеток:        

• плотность клеток при посеве

• HEp2 (эпидермоидная карцинома гортаноглотки человека)

• A549 (аденокарцинома легкого человека)

• Т24 ( карцинома мочевого пузыря человека)

• НТ29 (карцинома толтой кишки человека)

Варьируемые параметры:        

• концентрация фотосенсибилизатора (от 5 нМ до 300 мкМ)

• время инкубации  (от 30 минут до 6 часов)

Варианты тестирования:        

• облучение в среде инкубации, содержащей фотосенсибилизатор

• облучение после замены среды инкубации на среду, не содержащую фотосенсибилизатор

Контроли:        

• без воздействия

• только фотосенсибилизатор

• только облучение

• референс препарат (официнальный фотосенсибилизатор)

Поскольку физико-химические и фотофизические свойства в значительной степени определяют как фотоиндуцированную активность фотосенсибилизаторов, так и их перспективность для фармакологии, в протокол исследования перед биологическими испытаниями включали изучение растворимости соединений, их стабильности в темновых условиях и при облучении. Это дало возможность из 70 субстанции выбрать 61 и исследовать их по предложенной программе.

Таким образом, скрининг новых экзогенных фотосенсибилизаторов на первом этапе включал изучение и оценку их физико-химических и фотофизических свойств с целью выявления красителей, растворимых в биосовместимых средах и наиболее устойчивых как без воздействия света, так и при облучении. На втором этапе - изучение и оценку фотоиндуцированной активности и темновой токсичности на культурах опухолевых клеток человека с целью отбора наиболее перспективных соединений.

2. Изучение новых экзогенных фотосенсибилизаторов

С использованием разработанной системы скрининга проведено сравнительное изучение и последующий отбор активных соединений, являющихся производными хлорофилла а и бактериохлорофилла а, тетрагидропорфиринов и тетраазапорифринов в системе in vitro, модификация которых проводилась для придания амфифильных и гидрофильных свойств молекулам фотосенсибилизаторов, улучшения их фотофизических свойств, а также, в ряде случаев, для улучшенной доставки соединений в клетку.

2.1. Производные природного хлорофилла а

2.1.1. Производные пирофеофорбида а

Пирофеофорбиды представляют группу фотосенсибилизаторов, технология получения, которых позволяет осуществлять их наработку в достаточном количестве. Для данного класса соединений характерно наличие в спектрах интенсивной полосы поглощения в области 660-670 нм с коэффициентом экстинкции 3,5-4,5х104 М-1см1. Квантовый выход синглетного кислорода - 0,5-0,6.

Нами изучены пирофеофорбид а и его гидрокси-, глико- и галактозильные производные (рис. 5), являющиеся гидрофобными соединениями. По данным литературы, конъюгирование красителей с углеводными фрагментами может способствовать увеличению направленной доставки фотосенсибилизаторов в клетку, а также придавать молекуле амфифильный характер, увеличивая растворимость красителей в водных растворах.

№ фс

Тип бокового заместителя (R)

мax, нм

ИК50, нМ

1

-CH=СН2

672

160±30

2

-ОН

662

200±25

3

-О-CH2-Gal

662

75±5

4

-О-CH2-Glu

660

40±5

5

-S-(CH2)2-O-Gal

663

50±15

6

-О-Gal

662

80±10

7

-S-Glu

662

10±5

Показано, что пирофеофорбид а (1) и его производные (2-7) стабильны в среде Игла, содержащей 7% ЭТС, в течение 24 часов без облучения, но неустойчивы в культуральной среде при воздействии светом.

При оценке биологических свойств оказалось, что соединения 5 и 7, где углеводный остаток присоединен через атом серы, обладали темновой цитотоксичностью (от 10 до 100 нМ), что делало эти вещества неперспективными. У соединений 1-4 и 6 темновой цитотоксичности не отмечено, при этом выявлено, что пирофеофорбид а (1) и его гидроксипроизводное (2) проявляли высокую фотоиндуцированную активность относительно опухолевых клеток культуры А549 (ИК50 составляла 160±30 нМ и 200±25 нМ), а введение углеводных остатков в пиррольное кольцо А (соединения 3, 4 и 6) значительно повышало эффективность фотосенсибилизаторов при ФДВ (величина ИК50 составляла 75±5, 40±5 и 80±10 нМ, соответственно). Все соединения накапливались в клетках со средней скоростью, поскольку временной интервал, при котором наблюдалась максимальная активность у этого класса фотосенсибилизаторов, составлял 4 часа. Углеводные производные пирофеофорбида а (3, 4 и 6) показали высокую фотоиндуцированную активность также на клеточных культурах, которые характеризовались высоким уровнем экспрессии углевод-связывающих рецепторов (НЕр2 и НТ29), сопоставимую с активностью относительно клеток культуры А549.

Таким образом, показана высокая фотоиндуцированная активность пирофеофорбида а (1) и его гидроксипроизводного (2) (величина ИК50 составляла 160±30 нМ и 200±25 нМ, соответственно). Присоединение углеводного фрагмента к пиррольному кольцу А увеличивало эффективность соединений 3, 4 и 6 в 2-5 раза как по сравнению с исходным пирофеофорбидом (1), так и с его гидроксилированным производным (2). Однако, несмотря на высокую активность большинства соединений, фотосенсибилизаторы данного класса не были отобраны для дальнейшего изучения. К недостаткам этих соединений следует отнести трудоемкий и дорогостоящий синтез, а также наличие максимума поглощения при max=660-665 нм.

2.1.2. Производные хлорина е6

В последнее время уделяется пристальное внимание классу природных хлоринов, обладающих рядом преимуществ: они легко подвергаются биодеградации и быстро выводятся из организма, технологичны при получении. Хлорины - соединения с max при 665 нм, с коэффициентом экстинкции 2,5-3х104 М-1см-1 и квантовым выходом синглетного кислорода 0,4-0,7, однако имеющие ограниченное применение в качестве фотосенсибилизаторов из-за низкой фотостабильности, поэтому встает необходимость создания более устойчивых красителей. В нашей работе использовали производные хлорина е6 и хлорина р6 с различными боковыми заместителя.

На рис.6 представлены триметиловый эфир хлорина е6 и его гликозилированные производные.

фс

Заместители

мax, нм

R1

R2

8

-OCH3

-CH2

665

9

-OCH3

665

10

-CH2

665

11

-CH2

665

При исследовании физико-химических и фотофизических свойств соединений показано, что триметиловый эфир хлорина е6 (8) характеризовался меньшей стабильностью в растворах без воздействия светом и подвергался фотовыцветанию. Гликокозилированные производные были стабильны в растворах в темновых условиях, но оказались неустойчивыми при облучении; исключением явилось галактозильное производное триметилового эфира хлорина е6 с заместителем в пирроле А (9), оказавшееся устойчивым при воздействии светом.

При оценке эффективности производных хлорина е6 на клетках культур различного эпителиального происхождения показано, что все соединения не проявляли темновой цитотоксичности in vitro (диапазон концентраций от 3 до 1000 нМ). Введение углеводного остатка в пиррол А (9) в значительной степени (в 2-25 раз, в зависимости от клеточной линии) повышало фотоиндуцированную активность фотосенсибилизаторов, а присутствие сахара в пирроле С (соединение 10) и наличие замещенного триазольного цикла (соединение 11), наоборот, снижало фотоактивность красителей как по сравнению с негликозилированным производным (8), так и с гликоконьюгатом (9). Все производные триметилового эфира хлорина е6 оказались существенно активнее, чем известный официнальный препарат «Радахлорин» (таблица 2). Время инкубации клеток с фотосенсибилизаторами, при котором соединения проявляли максимальной эффект при ФДВ, составляло 4 часа.

Таблица 2.

Сравнительная фотоиндуцированная активность гликоконъюгатов в системе in vitro.

Время инкубации 4 часа.

Фотосенсибилизаторы

ИК50, нМ

НЕр2

А549

НТ29

Радахлорин

5500±300

6100±450

7500±550

Триметиловый эфир хлорина е6 (8)

200±25

150±48

400±43

Триметиловый эфир хлорина е6

с галактозой в пирроле А (9)

15±8

70±19

34±16

Триметиловый эфир хлорина е6 с галактозой в пирроле С (10)

200±55

700±47

400±27

Триметиловый эфир хлорина е6 с галактозой и триазолом в пирроле С (11)

400±35

700±41

600±38

Впервые показано, что фотоиндуцированная активность триметилового эфира хлорина е6 превышала активность Радахлорина в 20-40 раз. Введение углеводных заместителей в пиррол А повышало эффективность соединений еще на порядок, но наличие остатков сахаров в пирроле С приводило к снижению фотоактивности по сравнению с неконъюгированным аналогом (8) и с гликоконьюгатом (9). Однако, несмотря на хорошие результаты в биологических тестах, наличие у этих соединений максимума поглощения при 665 нм, где отсутствует глубокое проникновение света в ткани, а также сложность и трудоемкость их химического синтеза делают дальнейшее изучение данной группы фотосенсибилизаторов нецелесообразным.

2.1.3.Производные хлорина р6

Хлорин р6 (12) является близким структурным аналогом хлорина е6. Замена винильной группы на формильную в 3-м положении макроцикла обеспечивает сдвиг максимума до 690 нм (формильное производное хлорина р6 13), а введение дополнительного имидного экзоцикла в молекулу хлорина р6 - к еще более существенному сдвигу до 710-715 нм. При этом варьирование заместителей в пиролле А (R1) и экзоцикле Е (R2) позволило сместить длинноволновую полосу поглощения в область 724-746 нм. На рис. 7 представлены изученные циклоимидные производные хлорина р6 с различными заместителями в макроцикле.

№ фс

Заместители

мax, нм

R1

R2

R3

14

-CH=CH2

-(CH2)3OH

H

716

15

-CH=CH2

-(CH2)2OH

H

712

16

-CH=CH2

-OCOCH3

H

712

17

-CH=CH2

-OH

CH3

715

18

-CH=CH2

-CH2COOH

CH3

708

19

-CH=CH2

-(CH2)2COOН

CH3

708

20

-CHO

-(CH2)3OH

H

746

21

-CH=CH2

-OCH3

CH3

710

22

-CH=NOH

-OCH3

CH3

720

23

-CHO

-OCH3

CH3

740

Все изученные фотосенсибилизаторы характеризовались стабильностью в культуральной среде в течение 24 часов без облучения. При оценке фотовыцветания ряда производных хлорина р6 выявлено, что соединения 20 и 23 подвергались фотовыцветанию в меньшей степени, чем фотосенсибилизаторы 17, 19 и 22.

Все соединения характеризовались отсутствием темновой цитотоксичности относительно клеток А549. Оценка фотоиндуцированной активности хлорина р6 и его производных показала, что введение заместителей в макроцикл красителя существенным образом увеличивало эффективность производных при ФДВ. Так, наибольшая активность выявлена у фотосенсибилизатора с гидроксильной группой в экзоцикле (17)  (величина ИК50 составляла 35±10 нМ); удлинение углеводородной цепи в этом положении (соединения 18 и 19) существенно снижало фотоиндуцированную активность (ИК50- 130±26 нМ и 127±30 нМ, соответственно) (рис. 8). Соединения с ярко выраженными липофильными свойствами (21-23), характеризовались более высокой активностью: величина ИК50 в среднем составляла 67±15 нМ. В ряду соединений 14-16 активность, напротив, убывала с укорочением алкильного радикала в экзоцикле Е (величина ИК50 - 90±15 нМ, 170±18 нМ и 250±23 нМ, соответственно). Полученные результаты показывают, что, варьируя структуру боковых заместителей и их положение в макроцикле, можно в значительной степени влиять на эффективность фотосенсибилизаторов при ФДВ. Отмечено, что временной интервал, при котором соединения проявляли максимальную фотоиндуцированную цитотоксичность, составлял 2 часа, все красители проникали в клетки и накапливались в них.

12.  3400±45 нМ

13. 5500±55 нМ

14.  90±20 нМ

15.  170±20 нМ

16.  250±30 нМ

17.  35±10 нМ

18.  130±26 нМ

19.  130±30 нМ

20.  140±30 нМ

21.  70±10 нМ

22.  65±15 нМ

23.  63±10 нМ

Таким образом, показано, что внутримолекулярная циклизация и введение ряда электроноакцепторных заместителей в макроцикл хлорина р6 (max=660 нм) в значительной степени смещала максимум поглощения его модифицированных производных в более длинноволновую область спектра (max=710-740 нм) и увеличивала фотоиндуцированную активность фотосенсибилизаторов по сравнение с хлорином р6 и его формильным производным. Так, эффективность хлорина р6 и его формильного производного была в 100-150 раз ниже, чем у наиболее активного циклоимидного производных хлорина р6 (величина ИК50 составлляа 35±10 нМ), который был выбран для дальнейшего изучения в системе in vivo.

2.2. Производные природного бактериохлорофилла а

Производные бактериохлорофилла а обладают спектральными характеристиками, выгодно отличающими их от хлоринов, и имеют максимум поглощения в области 760-830 нм с коэффициентом экстинкции в длинноволновой полосе поглощения равным 4104М-1см-1. В качестве кандидатов для использования в ФДТ рассматриваются две группы бактериохлоринов: производные природного бактериохлорофилла а, которые за счет  химических модификаций имеют повышенную стабильность и улучшенные спектральные и фотофизические характеристики, и группа синтетических бактериохлоринов, которые получены путем восстановления порфиринов до тетрагидропроизводных.

2.2.1. Производные бактериохлорина р

Известно, что природные бактериопурпуринимиды отличаются высокой гидрофобностью, поэтому для увеличения их растворимости в водных средах важную роль играет соотношение гидрофобных и гидрофильных заместителей в молекуле. Нами изучен ряд производных с различными заместителями в пирроле А и экзоцикле Е, которые увеличивали гидрофильность исследуемых красителей (рис.10).

фс

Заместители

мax, нм

R1

R2

25

-OCH3

778

26

-OCH3

782

27

-OCH3

781

28

-OCH3

781

29

-OCH3

783

30

-OCH3

792

31

-OCH3

-NH2

834

32

-OCH3

-N(CH3)2

820

33

-OCH3

826

34

-OCH3

826

35

800

Показано, что бактериопурпурин (24) неустойчив в 1% водном растворе кремофора как без светового воздействия, так и при облучении. Бактериопурпуринимиды (25-35) стабильны в растворах в течение суток наблюдений без светового воздействия. Фотосенсибилизатор 35 проявил высокую фотостабильность по сравнению с соединениями 25-34, которые оказались менее устойчивы к световому воздействию.

При оценке эффективности фотосенсибилизаторов относительно опухолевых клеток не отмечено темновой цитотоксичности красителей (при варьировании концентраций от 5 нМ до 1200 нМ). Фотоиндуцированная активность соединений с заместителями в пирроле А оказалась в 20 раз выше, чем у исходного бактериопурпурина (величина ИК50 составляла 520±22 нМ). Характер полярного заместителя в пиррольном кольце А не оказывал влияния на фотоактивность производных 25-30 (величина ИК50 была сопоставима у всех соединений и составляла в среднем 35±10 нМ). Введение азотсодержащих заместителей (соединения 31 - 34, величина ИК50 которых изменялась от 95±22 до 300±33 нМ) и оксипропильного заместителя в пиррол А и экзоцикл Е (соединение 35 ИК50 450±30 нМ) существенным образом снижало фотоиндуцированную цитотоксичность соединений (рис. 11). Отмечено, что фотосенсибилизаторы (25 - 35) проникают в опухолевые клетки и накапливаются в них. Время инкубации, при котором наблюдалась максимальная фотоиндуцированная активность, составляло 4 часа.

24.  450± 30нМ

25. 35±5 нМ

26. 30±10 нМ

27. 32±12 нМ

28. 31±15 нМ

29. 36 ±8 нМ

30. 27± 10 нМ

31.  95± 20 нМ

32.  245± 31 нМ

33.  150±20 нМ

34.  300± 33 нМ

35.  500±25 нМ

Таким образом, показано, что введение заместителей в пиррол А и экзоцикл Е позволило сместить максимум поглощения в более длинноволновую область спектра (=780-835 нм) и повысить их стабильность в растворе. Наиболее эффективной, приводящей к значительному увеличению фотоиндуцированной цитотоксичности, оказалась модификация пиррольного кольца А (величина ИК50 в среднем составляла 35±10 нМ для соединения 25-30), в то время как введение амино и оксипропильной групп в экзоцикл Е снижало фотоиндуцированную цитотоксичность соединений 31-35. По совокупности физико-химических, фотофизических и биологических свойств производных бактериохлорофилла а, исследованных в настоящей работе, а также с учетом технологичности их получения для дальнейшего изучения in vivo был выбран бактериопурпуринимид с остатком глицерина в пирроле А (28) и бактериопурпуринимид (35).

2.3. Синтетические тетрагидропорфирины

Другими фотосенсибилизаторами бактериохлоринового ряда, впервые исследованными в настоящей работе, являлись тетрагидропорфирины, полученные восстановлением соответствующих порфиринов. Эти соединения имеют максимум поглощения в области 740-760 нм, коэффициент экстинкции – 7-8104 М-1см-1 и квантовый выход синглетного кислорода - 0,3-0,45. Преимуществом данных фотосенсибилизаторов является гидрофильность, что делает возможным их использование в виде водных растворов. Изучены производные с различными боковыми заместителями и центральными атомами металлов (рис.12).

фс

Заместители

Атом металла

мax, нм

R1

R2

M

36

-N(CH2)4Br2

-CН

Н

765

37

38

-N(CH2)4N(C5H5)Br2

-CН

H

765

Zn

780

39

-N(CH2)4N(CH3)2(CH2)2OHBr2

-CН

H

765

40

-NCH2COOC2H5

-CН

H

765

41

-NCH3J

-CН

H

760

42

43

-CH

H

765

Zn

775

44

-CН

H

740

При изучении абсорбционных и флуоресцентных спектров отмечено, что красители 36-39 и 41 были стабильны в выбранном временном диапазоне, тогда как соединения 40, 42 и 44 оказались менее стабильными.

Выявлено, что цинковый комплекс тозильного производного (43) подвергался деградации (отсутствие длинноволнового пика в спектрах флуоресценции), поэтому в дальнейших исследованиях данное соединение не использовалось. Показано, что фотовыцветание фотосенсибилизаторов 36 и 37 было менее интенсивным, чем красителей 38-42 и 44.

Синтетические тетрагидропорфирины (36-42, 44) не проявляли темновой цитотоксичности относительно опухолевых клеток в культуре.

Наибольшая фотоиндуцированная цитотоксичность выявлена у тетрабромидного (36) и октабромидного (37) безметальных производных и сравнима с активностью ряда производных природного бактериохлорофилла а (32, 34). Введение атома цинка в макроцикл в значительной степени (в 30-35 раз) снижало фотоиндуцированную активность фотосенсибилизаторов (38) (рис. 13).

Удаление фотосенсибилизаторов из культуральной среды перед воздействием светом позволило оценить вклад фотоиндуцированного повреждения, обусловленного красителем, накопившимся внутри клеток. Показано, что эффективность соединений при ФДВ значительно снижалась (в 4-8 раз), что свидетельствовало о незначительном проникновении красителей в клетки. Однако применение их в качестве фототоксических агентов в системе in vivo может приводить к опосредованному механизму эффективного фотоповреждения опухолевой ткани, за счет повреждения ее сосудистой системы.

Впервые изучены оригинальные синтетические фотосенсибилизаторы и показано, что наибольшую эффективность при ФДВ относительно клеток в культуре проявили безметальные тетрабромидное (36) и октабромидное (37) производные тетрагидропорфирина (величина ИК50 – 0,34±0,07мкМ и 0,37±0,08 мкМ, соответственно). Отмечено, что присутствие в боковом заместителе карбоксильной группы (40) в значительной степени снижало фотоиндуцированную активность фотосенсибилизатора (ИК50 – 9,7±1,2мкМ), а введение атома цинка в макроцикл красителя (38) делало его неактивным (ингибирование пролиферации не превышало 25-30%). Безметальные тетрабромидное (36) и октабромидное (37) производные тетрагидропорфиринов переданы для изучения эффективности ФДТ на животных с перевивными опухолями.

2.4. Тетраазапорфирины (фталоцианины)

Фталоцианины – синтетические фотосенсибилизаторы, обладающие интенсивной полосой поглощения в красной и ближней инфракрасной областях спектра – 670 - 700 нм с коэффициентом экстинкции – 1105 М-1см-1. Квантовый выход синглетного кислорода для фталоцианинов составляет порядка 0,3-0,6. Незамещенные фталоцианины – гидрофобные соединения, однако введение в молекулу сенсибилизатора гидрофильных заместителей (SO32-, OH-, COO-, PO43-) позволяет достигать необходимой растворимости в воде.

2.4.1. Отрицательно заряженные производные фталоцианина

В нашей работе мы изучали отрицательно заряженные производные фталоцианина с боковыми заместителями различной природы (сульфо- и карбоксигруппами), различными центральными атомами металла (Al, Zn, Mg) и разной степенью сульфирования (рис.14).

фс

Тип бокового заместителя (R)

Атом металла

Формула

мax, нм

(1%водный р-р тритона)

45

-CОOH

Zn

ZnPc(COOH)8

690

46

-COOH

Al

AlPc(COOH)8

690

47

-SO~1,5

H

H2Pc(SO3)1,5

662/690

48

-SO~2,5

H

H2Pc(SO3)2,5

662/690

49

-SO~2,5

Mg

MgPc(SO3)2,5

680

50

-SO~2,5

Zn

ZnPc(SO3)2,5

673

51

-SO~3

H

H2Pc(SO3)3

662/690

52

-SO~3

Mg

MgPc(SO3)3

680

53

-SO~3

Zn

Zn gPc(SO3)3

673

54

-SO~3,8

H

H2Pc(SO3)3,8

662/690

55

-SO~3,8

Mg

MgPc(SO3)3,8

680

56

-SO~3,8

Zn

Zn Pc(SO3)3,8

673

При изучении абсорбционных и флуоресцентных спектров производных фталоцианина было отмечено, что металлосодержащие производные находятся в водно-солевых растворах в частично агрегированной форме, а безметальные - в полностью агрегированной форме. Введение Кремофора EL и Тритона X-100 в среду приводило к мономеризации красителей, поэтому при оценке стабильности производных фталоцианина использовали 1% и 10% водные растворы солюбилизаторов. Производные карбоксифталоцианина алюминия и цинка характеризовались меньшей стабильностью в динамике, тогда как все сульфированные производные были стабильны в выбранном временном диапазоне (24 часа). При оценке фотовыцветания  показано, что сульфированные производные фталоцианина более устойчивыми при воздействии светом (47-56), чем карбоксифталоцианины (45, 46).

В биологических тестах in vitro установлено, что фотосенсибилизаторы не обладали темновой цитотоксичностью относительно опухолевых клеток (в диапазоне концентраций от 0,05 до 2 мкМ). Фотоактивность октакарбоксифталоцианина алюминия и цинка относительно клеток НЕр2 оказалась существенно ниже, чем сульфированных производных (величина ИК50 AlPC(COOH)8 - 200±1,5 мкМ, ZnPC(COOH)8 – 160±2,1 мкМ). Наибольшую активность среди сульфированных производных проявили производные цинка, магния и безметальное с преимущественным содержанием ди- и трисульфогрупп (величина ИК50 в среднем составляла 0,2±0,1 мкМ) (рис. 15). Временной интервал, при котором наблюдалась максимальная активность, у соединений данного класса составлял 2 часа. На опухолевых клетках различного гистогенеза показана высокая фотоиндуцированная активность сульфированного безметального производного (H2Pc(SО3)~2,5). Чувствительность клеток к ФДВ возрастала в следующем ряду: НТ29<Т24<А549<НЕр2<Raji (величина ИК50 составляла 3,2±0,08, 1,8±0,1, 0,52±0,11, 0,25±0,08 и 0,04±0,07 мкМ, соответственно).

Сравнительная оценка эффективности фталоцианинов относительно клеток в культуре показала, что активность октакарбоксифталоцианина цинка (45) и алюминия (46) оказалась существенно ниже (ИК50 составляла 200±15 мкМ и 130±20 мкМ, соответственно), чем сульфированных производных. Среди сульфированных соединений наиболее активными оказались безметальный (48), магниевый (49) и цинковый (50) комплексы со степенью сульфирования 2,5 (ИК50 в среднем составляла 0,2±0,08 мкМ), в то время как препарат «Фотосенс», на основе фталоцианина, проявлял существенно меньшую фотоиндуцированную активность (ИК50 = 2,0±0,1мкМ). Безметальное сульфированное производное (48) выбрано для дальнейших экспериментов на животных и на его основе разработан препарат «Фталосенс-лио», доклинические испытания которого завершены.

2.4.2. Положительно заряженные производные фталоцианина

Соединения данного класса рассматриваются как потенциальные агенты не только для ФДТ рака, но и для антимикробной ФДТ. Изучены катионные производные фталоцианина, отличающиеся центральными атомами металла и несущими заряд заместителями (таблица 3).

Таблица 3.

Положительно заряженные производные фталоцианина

№ фс

Тип бокового заместителя (R)

Атом металла

Формула

мax, нм

57

-CH2N+Me2CH2CH2OH Cl-

Zn

ZnPcChol8

685

58

-CH2N+Me2CH2CH2OH Cl-

AlOH

AlPcChol8

685

59

-CH2N+Me2CH2CH2OH Cl-

H

H2PcChol8

685

60

Zn

ZnPcPym8

685

61

AlOH

AlPcPym8

685

Анализ абсорбционных и флуоресцентных спектров показал, что из всех изученных соединений безметальное холиновое производное фталоцианина H2PcChol8 (59) характеризовалось наименьшей устойчивостью в среде Игла с добавлением 7% ЭТС, и поэтому было исключено из дальнейшего исследования. Соединения 57, 58, 60 и 61 оказались стабильны как без воздействия светом, так и при облучении.

Катионные производные фталоцианина не обладали темновой токсичности относительно опухолевых клеток В ряду холиновых и пиридиниевых производных наибольшей фотоиндуцированной активностью обладали цинковые комплексы (рис.16).

ZnPcChol8 ИК50=0,3±0,08 мкМ

ZnPcPym8-ИК50=0,35±0,1 мкМ

AlPcChol8 -ИК50=13±0,1 мкМ

AlPcPym8-ИК50=25±0,1 мкМ

Фотосенс ИК50=2,00±0,08 мкМ

Рис. 16. Фотоиндуцированная цитотоксичнсоть отрицательно заряженных производных фталоцианина (ИК50, нМ). Культура клеток НЕр2. Время инкубации 2 часа.

Все соединения проникали в опухолевые клетки и накапливались в них. Для холинового производного фталоцианина цинка проведено сравнительное изучение эффективности фотодинамического воздействия на опухолевых клетках человека различного генеза. Выявлено, что наиболее чувствительными оказались клетки НЕр2 (0,30±0,08 мкМ), а наименее – НТ29 (2,00±0,13 мкМ).

Таким образом, выявлено, что фотоиндуцированная активность положительно заряженных фталоцианинов не зависела от природы боковых заместителей, но наличие атома цинка в центре макроцикла в значительной степени повышало специфическую активность соединений. Для изучения в системе in vivo было выбрано холиновое производное цинка (57) как наиболее перспективная субстанция, и на ее основе разработан препарат «Холосенс-лио».

3. Изучение внутриклеточной локализации ряда красителей методом КОМИРСИ

Известно, что эффективность фотодинамического повреждения клетки зависит от внутриклеточной концентрации соединения и его локализации. В лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул (ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Очинникова РАН) под руководством д.б.н. Феофанова А.В. совместно выполнено сравнительное исследование накопления и внутриклеточного распределения ряда наиболее активных соединений класса фталоцианинов и пурпуринимидов. Локализация фотосенсибилизаторов в клетке определялась методом КОМИРСИ, включающим флуоресцентное мечение внутриклеточных органелл специфическими красителями.

3.1. Пурпуринимиды

На рис. 17 представлено внутриклеточное распределение амфифильного пурпуринимида с гидроксильной группой в имидном экзоцикле (18) (выделено красным цветом). Селективное мечение внутриклеточных органелл в присутствии фотосенсибилизатора с использованием специфических красителей (выделены зеленым цветом) показало, что соединение преимущественно накапливается в аппарате Гольджи и митохондриях. Желтым цветом выделены участки, в которых локализация флуоресценции фотосенсибилизатора и специфическое окрашивание органелл совпадают.

На рис. 18 представлено внутриклеточное распределение липофильного пурпуринимида (22). Обнаружено, что данное соединение накапливается в липидных каплях, органеллах, отвечающих за хранение и метаболизм нейтральных липидов и стериловых эфиров.

3.2.Отрицательно заряженные производные фталоцианина

Изучение внутриклеточного распределения методом КОМИРСИ показало, что H2Pc(SО3)~2,5 проникает в опухолевые клетки различного генеза (НЕр2 – карциномы гортаноглотки человека, А549- аденокарциномы легкого и Raji – лимфомы Беркита) и накапливается в них в мономерной (флуоресцирующей) форме, диффузно распределяясь в цитоплазме клеток и частично связываясь с плазматической мембраной (рис. 19), при этом  проникновения красителя в ядра клеток не отмечено. Внутриклеточная локализация H2Pc(SО3)~2,5 (48) не зависела от типа опухолевых клеток.

Таким образом, различия во внутриклеточном накоплении фотосенсибилизаторов, по-видимому, обусловлены их различной химической структурой и физико-химическими свойствами. Пурпуринимид (18), который накапливался в аппарате Гольджи и митохондриях, характеризовался наибольшей фотоиндуцированной активностью in vitro (величина ИК50 составляла 35±10 нМ).

ВЫВОДЫ

1. Разработанная методика скрининга новых экзогенных фотсенсибилизаторов in vitro включает два этапа: 1-й - изучение физико-химических и фотофизических свойств фотосенсибилизаторов с целью выявления красителей, растворимых в биосовместимых средах и устойчивых как без воздействия, так и при облучении; 2-й - оценка фотоиндуцированной противоопухолевой активности соединений с применением мультипараметрической системы с целью отбора наиболее эффективных красителей для дальнейшего изучения при ФДТ in vivo.

2. Оригинальная мультипараметрическая система изучения эффективности фотосенсибилизаторов при ФДВ позволяет адекватно оценивать и сравнивать  их по фотоиндуцированной противоопухолевой активности, а также выявлять зависимости выраженности фотоиндуцированного цитотоксического эффекта от концентрации соединений в среде инкубации, времени инкубации соединения с клетками до светового воздействия, дозы света, присутствия фотосенсибилизатора в среде во время облучения, от его удаления перед облучением.

3. На первом этапе скрининга в результате изучения физико-химических свойств из 70 производных природных хлорофилла а и бактериохлорофилла а, синтетических тетрагидро- и тетраазпорфиринов выявлено 61 соединение, характеризующееся хорошей растворимостью в биосовместимых гидрофильных и амфифильных средах, из которых  стабильность в темновых условиях в бесклеточной среде в динамике проявляли 59 красителей. При оценке фотофизических свойств выявлено, что 50% фотосенсибилизаторов оказались фотонеустойчивыми.

4. На втором этапе оценена фотоиндуцированная противоопухолевая активность 59 субстанций и показано, что эффективность соединений при ФДВ зависела от их химической структуры, природы боковых заместителей, центрального атома металла и увеличивалась в следующем ряду: сульфированные производные фталоцианина синтетические тетрагидропорфирины << пурпуринимиды   бактериопурпуринимиды.

5. По сочетанию физико-химических, фотофизических и биологических свойств отобраны наиболее активные соединения и переданы для дальнейшего изучения в системе in vivo:

- из класса хлоринов - пурпуринимид с гидроксигруппой в имидном цикле (ИК50 равна 35±10 нМ, max- 715 нм);

- из класса производных природного бактериохлорофилла а:

- бактериопурпуринимид с гидроксильным заместителем в пирроле А (ИК50 равна 30±10 нМ, max- 780 нм) max- и О-пропилоксим –N- пропоксициклоимид (ИК50 равна 500±75 нМ, max- 800 нм),

- из класса синтетических тетрагидропорфиринов: безметальное тетрабромидное и октабромидное производные (ИК50 равны 0,34±0,07мкМ и 0,37±0,08 мкМ, max – 765 нм, соответственно);

- из класса фталоцианинов – сульфированное безметальное производное и холиновое производное цинкового металлокомплекса (ИК50 равны 0,19±0,3 мкМ, max- 665 и 692 нм и  0,3±0,08 мкМ, max- 685 нм, соответственно).

На основе стандартных субстанций безметального сульфированного и холинового производных фталоцианина разработаны препараты, получившие названия «Фталосенс-лио» и «Холосенс-лио», соответственно.

6. Сравнительная оценка внутриклеточной локализации пурпуринимидов и производного фталоцианина показала, что различия во внутриклеточном накоплении определялись химической структурой красителей и их физико-химическими свойствами. Пурпуринимиды накапливались в клеточных органеллах (аппарате Гольджи, митохондриях, липидных каплях), а отрицательно заряженные производные фталоцианина – в плазматической мембране и цитоплазме опухолевых клеток. Накопление фотосенсибилизаторов в аппарате Гольджи и митохондриях ассоциировано с высокой фотоиндуцированной активностью in vitro.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Сравнительное изучение новых фотосенсибилизаторов рекомендуется начинать с изучения физико-химических свойств соединений, включающего определение растворимости в биосовместимых средах с учетом гидрофильности, амфифильности и гидрофобности соединений, выбор оптимального растворителя, оценку и отбор наиболее стабильных в растворах без воздействия светом в динамике и при облучении.

2. В биологических тестах целесообразно начинать исследования с выбора клеточной линии и посевной концентрации, при которой опухолевые клетки на момент воздействия находятся в логарифмической фазе роста. При первичной оценке фотоиндуцированной активности соединений возможно ограничиться одной клеточной линией при варьировании концентраций соединений в широком диапазоне (от 5 нМ до 300 мкМ), временем до воздействия (от 30 минут до 6 часов), дозой света, облучением в присутствии фотосенсибилизатора в среде и с его удалением непосредственно перед воздействием для выявления активных красителей.

3. При расширенном скрининге рекомендуется использовать несколько клеточных линий (3-4 клеточные культуры) при варьировании тех же параметров, с целью выбора наиболее перспективных фотосенсибилизаторов для дальнейшего исследования in vivo.

4. При оценке фотоиндуцированной активности фотосенсибилизаторов целесообразно проводить эксперименты в трех повторах во избежание получения недостоверных результатов или некорректной их интерпретации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Plyutinskaya A.D. Sugar derivatives of pyropheophorbide a: spectral, photodynamic and biological properties/ Sharonov G.V., Grichine A.I., Feofanov A.V., Karmakova T.A., Plyutinskaya A.D., Yakubovskaya R.I., Aksenova A.A., Sebyakin Y.L., Mironov A.F., Maurizot J.-C., Vigny P. //Abstr.in: Proc. of 9 th International Conference on chemistry of porphyrins and their analogues. – Ivanovo. – 2003. - p. 341-334.

2. Плютинская А.Д. Новые фотосенсибилизаторы для ФДТ рака на основе природного бактериохлорофилла а/ Миронов А.Ф., Грин М.А., Кармакова Т.А., Плютинская А.Д., Феофанов А.В., Якубовская Р.И., Вини П. // Российский биотерапевтический журнал. - 2003. - т. 1. - №1. - С. 33-34.

3. Плютинская А.Д. Структурно-функциональные взаимосвязи фотосенсибилизаторов на примере циклоимидных производных хлорина р6/ Кармакова Т.А., Шаронов Г.В., Гришин А.И., Плютинская А.Д., Филясова А.И., Феофанов А.В., Казачкина Н.И., Якубовская Р.И., Лебедева В.С., Рузиев Р.Д., Миронов А.Ф., Вини П. // Российский биотерапевтический журнал. 2003. - т. 1. - № 1. - C. 25.

4. Plyutinskaya A.D. The study of sulphonated metal-free phthalocyanines in vitro and in vivo/ Lukyanets E.A., Derkacheva V.M., Chissov V.I., Yakubovskaya R.I., Kazachkina N.I., Morozova N.B., Karmakova T.A., Plyutinskaya A.D. // Abstracts of 9 th World Congress of the International Photodynamic Association. – Miyazaki. –Japan. – 2003. – P-015. – p. 42.

5. Плютинская А.Д. Влияние заместителей на фотохимические и биологические свойства 13,15-N-циклоимидных производных хлорина р6/ Назарова А.И., Феофанов А.В., Кармакова Т.А., Шаронов Г.В., Плютинская А.Д., Якубовская Р.И., Лебедева В.С., Миронов А.Ф., Маризо Ж-К., Вини П. //«Биоорганическая химия». 2005. т. 31. - №5. -  с.535-548.

6. Pljutinskaya A.D. Cycloimide bacteriochlorin p derivatives: Photodymanic properties and cellular and tissue distribution/ Sharonov G.V., Karmakova T.A., Kassies R., Pljutinskaya A.D., Grin M.A., Tsiprovski A.G., Yakubovskaya R.I., Mironov A.F., Otto C., Feofanov A.V. //Free Radical Biol. Med.- 2006. - V.40. -  P.407- 419.

7. Плютинская А.Д. Фотоиндуцированная противоопухолевая активность препарата фталосенса у животных с опухолями различного гистогенеза/ Якубовская Р.И., Морозова Н.Б., Панкратов А.А., Кармакова Т.А., Плютинская А.Д., Чиссов В.И., Деркачева В.М.,  Лукъянец Е.А.,  Ворожцов Г.Н. // Российский онкологический журнал. 2006. - № 3. - С. 26-32.

8. Plyutinskaya A.D. Positively charged phthalocyanines in antitumor PDT/ Yakubovskaya R.I., Morozova N.B., Plyutinskaya A.D., Chissov V.I., Lukyanets E.A., Negrimovsky V.M., Yuzhakova O.A., Vorozhtsov G.N. // 6th International Congress of the World Association of Laser Therapy. – Cyprus. – 2006. –P.157- 160.

9. Плютинская А.Д. Изучение эффективности сульфированных производных фталоцианина для фотодинамической терапии злокачественных новообразований/ Якубовская Р.И., Морозова Н.Б., Кармакова Т.А. Плютинская А.Д., Чиссов В.И.,Деркачева В.М., Лукъянец Е.А., Ворожцов Г.М. / Российский онкологический журнал. 2007. - № 3. - С. 29-34.

10. Pljutinskaya A. 13,15-N-Cycloimide derivatives of chlorin p6 with isonicotinyl substituent are photosensitizers targeted to lysosomes/ Nazarova A., Ignatova A., Feofanov A., Karmakova T., Pljutinskaya A., Mass J.,  Grin M., Yakubovskaya R., Mironov A., Maurizote J.-C. // Photochem. Photobiol. Sci. – 2007. – V. 6. -  р. 1184–1196.

11. Плютинская А.Д. Скрининг красителей для фотодинамической терапии в системе in vitro/ Плютинская А.Д., Кармакова Т.А., Морозова Н.Б., Якубовская Р.И. //Российский биотерапевтический журнал. 2008. т. 7. -№1. С.23.

12. Плютинская А.Д. Сравнение фотоиндуцированной активности препаратов «Фотогем», «Фотосенс» и «Радахлорин» в системе in vitro/ Плютинская А.Д., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И. // Российский биотерапевтический журнал. 2009. т. 8. - №2. - С.39.

13. Плютинская А.Д. Холиновое производное фталоцианина цинка - перспективный фотосенсибилизатор широкого спектра действия/ Морозова Н.Б., Плютинская А.Д., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И., Чиссов В.И., Феофанов А.В., Негримовский В.М., Южакова О.А.,  Лукъянец Е.А., Ворожцов Г.Н. // Тезисы VII съезда онкологов России. - М., 2009. - Т. I. - С.71-72

14. Плютинская А.Д. Изучение in vitro фотоиндуцированной активности положительно заряженных фталоцианинов/ Плютинская А.Д., Якубовская Р.И., Лукъянец Е.А., Негримовский В.М., Чиссов В.И. // Российский онкологический журнал». 2011. - №2. - С. 25-27.

Патенты:

15. Плютинская А.Д. Фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии/ Ворожцов Г.Н., Кармакова Т.А., Лужков Ю.М., Лукьянец Е.А., Морозова Н.Б., Негримовский В.М., Панкратов А.А., Плютинская А.Д., Чиссов В.И., Южакова О.А., Якубовская Р.И. // Патент № 2282646, рег. 27.08.2006.

16. Плютинская А.Д. Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии/ Дудкин С.В., Игнатова А.А., Кобзева Е.С., Лукьянец Е.А., Макарова Е.А., Морозова Н.Б., Плютинская А.Д., Феофанов А.В., Чиссов В.И., Якубовская Р.И.// Заявка на изобретение от 17.02.2012 № 2012105449.

17. Плютинская А.Д. Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии/ Дудкин С.В., Игнатова А.А., Кобзева Е.С., Лужков Ю.М., Лукьянец Е.А., Макарова Е.А., Морозова Н.Б., Панкратов А.А., Плютинская А.Д., Феофанов А.В., Чиссов В.И., Якубовская Р.И.// Заявка на изобретение от 17.02.2012 № 2012105450.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.