WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Котова Елена Александровна

СОЗДАНИЕ И БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ

ПРОИЗВОДНЫХ БИС-(-ХЛОРЭТИЛ)-АМИНА

14.04.01 – технология получения лекарств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова и Научно-исследовательском институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук,

профессор                                Краснюк Иван Иванович

доктор фармацевтических наук,

профессор                          Оборотова Наталия Александровна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, Титова Анна Васильевна

начальник отдела организации

контроля качества лекарственных

средств ФГБУ «Информационно-

методический центр экспертизы,

учета и анализа обращения средств

медицинского применения»

Росздравнадзора

кандидат фармацевтических наук, Павлова Людмила Анатольевна

доцент, заведующая лабораторией

биологически активных соединений

НИИ фармации ГБОУ ВПО

Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Курский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится «21» ноября 2012 г. в 14.00 часов  на заседании диссертационного совета Д 208.040.09 при Первом МГМУ имени И.М. Сеченова по адресу: 119991, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Первого МГМУ имени И.М. Сеченова по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект,  д. 49.

Автореферат разослан « 2 » октября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.040.09,

доктор фармацевтических наук,

профессор Садчикова Наталья Петровна

Актуальность темы

Диагноз «рак» стал приговором для многих людей. В мире ежегодно фиксируется 12 миллионов новых случаев онкологических заболеваний (международная некоммерческая организация «Всемирный фонд исследований рака»). По данным ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН за последние 10 лет число онкологических больных в России увеличилось в полтора раза.

Наряду с хирургическими и лучевыми методами лечения широко применяется химиотерапия злокачественных опухолей, которая получила научное обоснование в 40-х гг. ХХ в. Проведенные исследования первого цитостатического препарата алкилирующего действия – эмбихина – позволили продвинуть его в клинику для лечения лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы и мелкоклеточного рака легкого. В это время выдающийся отечественный ученый Л.Ф. Ларионов предложил использовать аминокислоты, обеспечивающие селективность действия препаратов на ДНК раковых клеток, в качестве «носителей» цитотоксической химической группы бис-(-хлорэтил)-амина. В соответствии с этой идеей в ФГБУ «РОНЦ  им. Н.Н. Блохина» РАМН синтезированы первые отечественные препараты: сарколизин и его пептидное производное – цифелин. Но терапевтический эффект сарколизина сопряжен с рядом побочных действий, а менее токсичный цифелин в силу нерастворимости в воде обладает низкой биодоступностью.

Сохранение и продление жизни  многих онкологических больных прямо зависит от применения инновационных лекарственных форм (ЛФ). Одно из наиболее интересных и быстро развивающихся направлений современных исследований в области медицины и фармации – применение липосом в качестве носителей для доставки лекарственных веществ (ЛВ) к патологически измененным клеткам. В отличие от регулярной, упорядоченной васкуляризации нормальных тканей сосуды опухолей представляют собой аномальные, деформированные капилляры с проницаемыми стенками и замедленным кровотоком. Так, благодаря эффекту повышенной проницаемости капилляров и удерживания ЛВ в тканях организма с нарушенным лимфатическим дренажом, липосомы накапливаются в опухоли, способствуя повышению терапевтического эффекта лекарственных препаратов. В мире зарегистрированы известные (Daunoхome, Doxil, Caelyx, Myocet, Lipodox, Липодокс) и активно разрабатываются новые противоопухолевые липосомальные препараты. В многочисленных клинических исследованиях продемонстрировано преимущество инкапсулирования цитотоксичных ЛВ в везикулы за счет более мягкого действия и снижения побочных эффектов на здоровые клетки.

В связи с вышеизложенным актуальной является разработка новых ЛФ известных противоопухолевых веществ – стерически стабилизированных липосом производных бис-(-хлорэтил)-амина – цифелина и сарколизина.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось создание стерически стабилизированных липосомальных лекарственных форм  (ЛЛФ) сарколизина и цифелина, повышающих их биодоступность и избирательность противоопухолевого действия.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи:

  1. Разработать оптимальный состав стерически стабилизированных ЛЛФ сарколизина и цифелина.
  2. Оптимизировать технологию и провести сравнение методов изготовления липосомальных дисперсий сарколизина и цифелина.
  3. Экспериментально обосновать условия получения устойчивых при хранении лиофилизированных липосомальных лекарственных форм (ЛЛЛФ) сарколизина и цифелина.
  4. Разработать методики качественного и количественного анализа ЛЛЛФ сарколизина и цифелина.
  5. Определить показатели качества и изучить стабильность ЛЛЛФ сарколизина и цифелина.
  6. Оценить цитотоксическую активность ЛЛЛФ сарколизина и цифелина в опытах in vitro и противоопухолевое действие в опытах in vivo.

Научная новизна

Впервые разработан состав стерически стабилизированных ЛЛФ сарколизина и цифелина. На основании комплексных исследований установлена методика загрузки сарколизина в липосомы. Выбрана оптимальная технология изготовления липосомальных дисперсий. Изучено действие различных криопротекторов на показатели качества ЛЛФ производных бис-(-хлорэтил)-амина в процессе лиофилизации.

Разработаны методики качественного и количественного анализа новых ЛФ. Определены показатели качества ЛЛЛФ сарколизина и цифелина и исследуется их изменение при хранении. Валидированы методики количественного определения сарколизина и цифелина в ЛЛЛФ методом спектрофотометрии.

В опытах in vitro и in vivo установлено преимущество противоопухолевого действия стерически стабилизированных ЛЛЛФ по сравнению с субстанциями сарколизина и цифелина.

Практическая значимость

Технология изготовления ЛЛЛФ цифелина и сарколизина внедрена в работу лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ  им. Н.Н. Блохина» РАМН и в учебный процесс кафедры фармацевтической технологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова. Методики фармацевтического анализа новых ЛФ внедрены в работу лаборатории химико-фармацевтического анализа НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Методики получения и анализа ЛЛЛФ могут быть переданы в другие организации.

Подготовлены проекты ФСП на ЛП: «Цифелин липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 17 мг» и «Сарколизин липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2 мг». В лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН утверждены лабораторные регламенты на производство указанных препаратов.

Более высокий противоопухолевый эффект ЛЛЛФ цифелина и сарколизина по сравнению с нелипосомальными позволяет начать производство новых ЛФ для углубленного доклинического изучения.

Положения, выносимые на защиту

  1. Результаты исследований по разработке состава и технологии изготовления липосомальных дисперсий цифелина и сарколизина.
  2. Выбор криопротектора для лиофилизации липосомальных дисперсий цифелина и сарколизина.
  3. Методики качественного и количественного анализа и показатели качества ЛЛЛФ цифелина и сарколизина, изучаемые в процессе хранения.
  4. Результаты изучения цитотоксического действия ЛЛЛФ цифелина и сарколизина в опытах in vitro и противоопухолевого эффекта in vivo.

Апробация работы

Материалы проведенных исследований представлены на конференциях:  IХ и Х Всероссийских научно-практических конференциях «Отечественные противоопухолевые препараты» (Нижний Новгород, 18-19 мая 2010г.; Москва, 22-23 марта 2011г.), II и III Всероссийских научных конференциях с международным участием «Наноонкология»  (Тюмень, 26-28 сентября 2010г.; Саратов, 6-7 сентября 2011г.), Итоговой всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, январь 2011г.), IV Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 26-27 апреля 2011г.), IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием: Биомедицинская инженерия и биотехнология (Курск, июнь 2011г.), Rusnanotech nanotechnology international forum (Moscow, October 26-28 2011г.), Научно-методической конференции с международным участием «Сандеровские чтения» (Санкт-Петербург, 3 февраля 2012г.), Научно-практической конференции «Аспирантские и докторантские чтения: Дерзания нового времени – поиск инноваций» (Москва, 8 февраля 2012г.), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 23-27 апреля 2012г.), Межлабораторных конференциях НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, Межкафедральной научной конференции на кафедре фармацевтической технологии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва, 30 мая 2012 г.).

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 – технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер государственной регистрации 01.2.006 06352). Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической технологии «Разработка научных основ технологии, стандартизации и организации производства лекарственных средств».

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликована 21 печатная работа, включая 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, общих выводов, обсуждения результатов, библиографии и приложений. Работа содержит 43 таблицы и 32 рисунка. Библиографический список включает в себя 183 источника литературы, из которых 98 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

С целью повышения биодоступности и уменьшения токсичности, посредством получения липосомальной формы были выбраны следующие лекарственные вещества, синтезированные в НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН: цифелин (рис.1, ФСП 42-0105089201) и сарколизин (рис.2, ФСП 0258-07).

Для получения липосом использовали фосфатидилхолин (ФХ, Е PC S Lipoid GmbH, Германия), холестерин (Хол, SIGMA, Германия), дистеароилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль-2000 (ДСФЭ-ПЭГ-2000, Lipoid GmbH, Германия). Для разработки составов ЛЛФ и изучения их свойств использованы вспомогательные вещества, разрешенные к медицинскому применению и отвечающие требованиям действующих нормативных документов.

Рис.1. Структурная формула цифелина Рис.2. Структурная формула сарколизина

Методика изготовления дисперсии многослойных липосом (МСЛ) цифелина. Изготовление МСЛ цифелина проводили методом гидратации липидной пленки. Точные навески ФХ, Хол, ДСФЭ-ПЭГ-2000 и цифелина растворяли в хлороформе и переносили в круглодонную колбу. Раствор упаривали на роторном испарителе (BCHI Rotavapor R-200) при температуре водяной бани 35±2 °С (BCHI Heating Bath B-490, BCHI Labortechnik AG, Швейцария) и давлении 24 мм рт. ст. до образования тонкой пленки на стенках колбы с последующим досушиванием в течение 50 минут под вакуумом. Липидную пленку гидратировали 0,9 % раствором натрия хлорида до полного смывания со стенок колбы.

Методика изготовления дисперсии многослойных липосом сарколизина. Изготовление МСЛ сарколизина проводили методом гидратации липидной пленки. Точные навески ФХ, Хол и ДСФЭ-ПЭГ-2000 растворяли в хлороформе и переносили в круглодонную колбу. Хлороформный раствор упаривали на роторном испарителе при температуре водяной бани 35±2 °С и давлении 24 мм рт. ст. до образования тонкой липидной пленки на стенках колбы, с последующим досушиванием в течение 50 минут под вакуумом. Затем липидную пленку гидратировали раствором сарколизина в 0,9 % растворе натрия хлорида или в растворителе Н следующего состава: 6,9 мл концентрированной хлороводородной кислоты, 21,2 мл 95 % этилового спирта и воды для инъекций до 1000 мл.

Методика изготовления дисперсии однослойных липосом (ОСЛ) цифелина и сарколизина. Полученную дисперсию МСЛ цифелина или сарколизина фильтровали через нейлоновые мембранные фильтры Pall N66 (ООО «Палл Евразия», Россия) с диаметром пор 1,2 и 0,45 мкм, после чего экструдировали через поликарбонатные фильтры Nuclepore (Whatman, Великобритания) с диаметром пор 0,2 мкм на мини-экструдере (Avanti Polar Lipids Inc., США).

В результате исследования разработан способ загрузки сарколизина по градиенту рН. Для этого полученную дисперсию ОСЛ сарколизина смешивали с цитратным буфером со значением рН 6,0 в объемном соотношении 2:1.

На этапе сравнения методов изготовления ОСЛ объемом более 20 мл использованы методики:

  1. Экструзия. Профильтрованные МСЛ цифелина и сарколизина экструдировали через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм на экструдере LIPEX™ (Northern Lipids Inc., Канада) под давлением азота 0,8 мПа 10 раз.
  2. Измельчение ультразвуком. Профильтрованные МСЛ цифелина измельчали на ультразвуковом диспергаторе Transsonic 310 (Elma, Германия) с частотой 20кГЦ в течение 20-30 мин.
  3. Гомогенизация. Профильтрованные МСЛ цифелина и сарколизина измельчали на гомогенизаторе Microfluidizer M-110S (Microfluidics, США) под давлением 40 psig (280 кПа) в течение 1-6 мин (в зависимости от объема).

Лиофилизацию липосомальных дисперсий проводили на установке лиофильной сушки Edwards Minifast DO.2 (Ero Electronic S.p.A., Великобритания) после добавления криопротектора в экспериментально подобранной концентрации.

Для достижения поставленной цели и решения задач исследования использовали следующие методы анализа:

• Размер липосом определяли методом динамической спектроскопии светорассеяния на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США). Форму и размер липосом – методом негативного окрашивания под электронным микроскопом JEM-100CX (JEOL, Япония).

• Количественное определение проводили методом спектрофотометрии в  УФ-области на спектрофотометре Cary 100 (Varian, Inс., Австралия).

• Качественный состав подтверждали тонкослойной хроматографией на пластинках «Sorbfil».

• Эффективность включения (ЭВ) сарколизина в липосомы определяли методом гель-фильтрации на хроматографических колонках C 10/20, Amersham Biosciences (Швеция). В качестве элюента экспериментально выбран 0,9 % раствор натрия хлорида. Кристаллы невключенного в липидный бислой цифелина отделяли при фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

• Перекисное окисление липидов устанавливали спектрофотометрически по концентрации конечного продукта окисления – малонового диальдегида (МДА), образующегося после взаимодействия липосом с трихлоруксусной и тиобарбитуровой кислотами.

• Для оценки роста опухолевых клеток и цитотоксической активности исследуемых ЛЛЛФ сарколизина и цифелина в опытах in vitro использован МТТ-тест. Опыт проводили на клеточных линиях опухолей человека: SKOV-3 – клетки аденокарциномы яичников и Jurkat – Т-клеточный лимфобластный лейкоз. Эффект ЛЛЛФ сарколизина и прототипа (субстанция сарколизина в растворителе Н) изучали в следующих концентрациях: 510-6, 7,510-6, 110-5, 2,510-5, 510-5, 7,510-5, 110-4 и 2,110-4 моль/л, что соответствует 0,002, 0,003, 0,004, 0,009, 0,02, 0,03, 0,04 и 0,07 мг/мл. В эксперименте с ЛЛЛФ цифелина и субстанцией использован ряд разведений до концентрации: 110-8, 110-7, 510-7, 110-6, 510-6, 110-5, 110-4 и 910-4 моль/л, что соответствует 510-6, 510-5, 210-4 и 510-4, 0,002, 0,005, 0,05 и 0,4 мг/мл. Учитывая нерастворимость субстанции цифелина в воде, его растворяли в ДМСО. Планшеты с клетками инкубировали в течение 72 часов. Измерения проводили на фотометрическом анализаторе иммуноферментных реакций  «АИФР-01 Униплан» (ЗАО «Пикон», Россия).

• Противоопухолевое действие ЛЛЛФ цифелина изучали на мышах (самки гибриды первого поколения BDF1) с перевитыми опухолями лейкоцитарной лейкемии Р-388 и аденокарциномы молочной железы Са-755 при внутрибрюшинном введении.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка состава липосомальной дисперсии цифелина

Цифелин как гидрофобное вещество включали в состав липосомальной мембраны, основным компонентом которой выбран липид – фосфатидилхолин. Холестерин добавляли для придания жесткости структуре бислоя. Такие липосомы легко подвергаются захвату из кровотока клетками ретикуло-эндотелиальной системы, поэтому для увеличения продолжительности циркуляции липосом в состав вводили дистеароилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль-2000. Липидное производное ПЭГ, повышая осмотическое давление в примембранной области, препятствует поглощению липосом макрофагами и обеспечивает доставку ЛВ в опухолевый очаг  путем пассивного нацеливания.

Изготавливали составы с различными молярными соотношениями «ФХ: Хол: ДСФЭ-ПЭГ-2000», а также изменяли соотношение «липид: цифелин». Основным параметром выбора явилась эффективность включения ЛВ. По результатам проведенного исследования установлено, что избыточное количество Хол не включается в бислой и на стадии получения МСЛ образовывался обильный кристаллический осадок. В образцах с высоким содержанием ДСФЭ-ПЭГ-2000 наблюдали низкое включение цифелина в мембрану. Оптимальным по ЭВ и внешнему виду выбран состав с молярным соотношением липидов 165:8:1 и соотношением  «липид: цифелин» 12:1, включение ЛВ в котором составило 98±1 %.

Разработка состава липосомальной дисперсии сарколизина

Сарколизин практически нерастворим в хлороформе, но легко растворим в воде при нагревании, что позволяет инкапсулировать его во внутреннюю среду везикул. Полученные составы сравнивали по показателям: размер везикул,  величина рН и ЭВ.

Разработку ЛЛФ начали с изучения эффективности пассивной загрузки. Ранее показано, что присутствие хлорид ионов стабилизирует легко гидролизующийся сарколизин. Поэтому при пассивной загрузке липидную пленку гидратировали раствором сарколизина в 0,9 % растворе натрия хлорида или в растворителе Н. В первом случае получали дисперсии с величиной рН 2,9 и максимальным включением 32±2 %, тогда как с растворителем Н липосомы получались с сильно кислой средой, что способствует окислению липидов. В результате пришли к выводу о необходимости применения метода активной загрузки по градиенту рН. При выборе гидратирующей жидкости липосомальные дисперсии смешивали с цитратным буфером со значением рН 6,0 в объемном соотношении 2:1. Полученные результаты представлены в табл.1.

Как видно из табл.1, при активной загрузке происходит увеличение значения рН в 2 раза. ЭВ при гидратации 0,9 % раствором натрия хлорида увеличилась незначительно, тогда как с растворителем Н в составе 4 ЭВ достигала 41±1%.

Таблица 1

Выбор гидратирующей жидкости для загрузки сарколизина

«ФХ: Хол: ДСФЭ-ПЭГ-2000»

«липид: сарколизин»

Гидратирующая жидкость

Размер везикул, нм

Эффективность включения сарколизина,

%

Значе-

ние рН

1

86:14,5:1

12:1

0,9 % NaCl

с сарколизином

189±18

32±2

5,6±0,4

2

75:15:1

34:1

186±21

35±3

5,9±0,2

3

86:14,5:1

12:1

Растворитель Н

с сарколизином

175±14

33±2

3,5±0,5

4

75:15:1

34:1

168±9

41±1

3,7±0,3

Градиент рН можно создавать добавлением как цитратного, так и фосфатного буфера. Полученные результаты свидетельствуют о малой буферной емкости при добавлении фосфатного буфера (использован  буфер с величиной рН 6,0 и 8,0), дисперсии имели значение рН около 2х и через несколько недель хранения (+4 °С) наблюдали выпадение хлопьевидного осадка. А с цитратным буфером (величина рН 5,0, 6,0 и 8,0) образовывались менее кислые липосомы со значением рН около 3,5 и меньшего размера. Оптимальные результаты получены при смешении с цитратным буфером с величиной рН 6,0 в соотношении «дисперсия: буфер» равном 2:1.

Пытаясь достичь наибольшего инкорпорирования ЛВ, проведен ряд экспериментов с изменением молярных соотношений компонентов липосомальной мембраны и соотношения «липид: сарколизин». Среди исследованных составов лучшие результаты получили для состава с молярным соотношением «ФХ: Хол: ДСФЭ-ПЭГ-2000» 123:14,5:1 и «липид: сарколизин» равным 58:1, соответственно. При изучении изменения инкапсулирования сарколизина в липосомы отмечен рост ЭВ до 62±1% в течение 20 часов.

Сравнение методов изготовления липосомальных дисперсий

При разработке составов липосомальных дисперсий цифелина и сарколизина липосомы получали экструдированием на ручном экструдере. Однако такой метод достаточно трудоемок в случае изготовления липосомальных дисперсий в объемах более 20 мл. В настоящее время известно много способов получения ОСЛ, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.

В данном исследовании сравнили изменение показателей качества дисперсий цифелина и сарколизина, полученных измельчением ультразвуком, экструзией и гомогенизацией МСЛ (табл.2 и 3).

Таблица 2 

Изменение размера везикул цифелина при измельчении ультразвуком

Время измельчения ультразвуком, мин

20

25

30

Размер везикул,

нм

сразу после измельчения ультразвуком

190±15

180±19

215±18

через сутки после измельчения ультразвуком

240±23

230±24

265±17

Как представлено в табл.2, при воздействии ультразвука на липосомы цифелина образовывалась гетерогенная дисперсия, которая трудно фильтруется. В отличие от липосом цифелина дисперсию сарколизина не подвергали измельчению ультразвуком, так как воздействие УЗ волн и локальный нагрев приведут к разрушению термолабильной структуры ЛВ.

Экструдированием в обоих случаях получали гомогенные липосомальные дисперсии с воспроизводимым размером везикул и ЭВ: 162±12 нм и 98±1 % для ЛЛФ цифелина, 171±15 нм и 62±1 % для ЛЛФ сарколизина, соответственно.

Таблица 3

Качество ЛЛФ цифелина и сарколизина в зависимости от времени гомогенизации

ЛЛФ

Параметр качества

Время измельчения (объем 100 мл)

1мин

2мин

3мин

4мин

5мин

6мин

Цифелин

Размер, нм

190±10

147±9

131±14

120±12

104±15

136±18

Сарколизин

Размер, нм

187±14

134±16

118±23

99±26

83±31

Включение, %

37±2

34±2

28±2

23±3

При гомогенизации быстрее и без особых усилий удалось получить липосомы меньшего размера чем при экструзии. Как видно из табл.3, для ЛЛФ цифелина сохраняется оптимальный размер везикул и величина ЭВ равная 97±1 % при измельчении 100 мл в течение 3-4 минут. В результате многократной циркуляции дисперсии сарколизина даже при сильном охлаждении наблюдали «вытекание» ЛВ во внешнюю среду: эффективность включения ЛВ снизилась с 62±1 до 37±1 % в течение 2 минут.

В результате сравнения методов изготовления липосомальных дисперсий цифелина и сарколизина оптимальные показатели качества получены при использовании экструзии. Для получения ЛЛФ гидрофобного цифелина также можно использовать гомогенизацию.

Стабилизация липосомальных дисперсий цифелина и сарколизина

При длительном хранении дисперсии происходит изменение бислойной структуры, липосомы начинают агрегировать, «вытекает» внутреннее содержимое. Для повышения срока годности их стабилизируют лиофилизацией.

С целью защиты мембраны липосом от повреждения при лиофильной сушке в состав необходимо добавлять криопротектор. В связи с этим изучили влияние криопротекторов  на показатели качества ЛЛФ цифелина. Для этого использовали представителей класса углеводы: глюкозу, сахарозу, лактозу и класса многоатомных спиртов – маннит (табл.4).

Таблица 4

Влияние криопротекторов на размер и эффективность включения цифелина в липосомы после лиофильной сушки

Криопротектор

Размер везикул, нм

Эффективность включения после лиофилизации,  %

до лиофилизации

после лиофилизации

через 2 недели после лиофилизации

Глюкоза

158±14

126±20

124±23

74±2

Сахароза

154±9

137±15

136±12

97±1

Лактоза

160±17

129±22

138±18

82±1

Маннит

160±24

225±41

387±49

Контроль

158±15

195±27

332±38

Как видно из табл.4, при добавлении в состав ЛЛФ криопротектора в молярном соотношении «суммарный липид: криопротектор» 1:1,6 липосомы с маннитом сильно укрупнялись, а с сахарами, наоборот, размер везикул уменьшался и вместе с ним снижалась эффективность включения ЛВ в бислой. Лучшие результаты получены с криопротектором сахарозой – стабильный размер липосом и ЭВ 97±1 %.

Изменение в дисперсии цифелина концентрации сахарозы от 4 до 12 % незначительно влияло на величину рН и размер везикул после лиофилизации. В итоге выбран состав ЛЛФ со значением рН 5,3 и размером везикул 130±12 нм в котором концентрация криопротектора составила 8 %, а молярное соотношение «липид: сахароза» 1: 1,4.

При хранении ЛЛФ может протекать деструкция липидной мембраны за счет окисления ФЛ, поэтому исследовано влияние добавления антиоксиданта – -токоферола (табл.5).

Таблица 5

Характеристика ЛЛФ цифелина при добавлении -токоферола

Параметр качества

Состав 1

(без -токоферола)

Состав 2

(с добавлением 6,5 мг -токоферола)

Состав 3

(с добавлением 13 мг

-токоферола)

до

после

через 6 мес после

до

после

через 6 мес после

до

после

через 6 мес после

лиофилизации

Размер везикул, нм

157

±11

130

±13

131

±10

171

±8

145

±17

152

±18

165

±14

134

±22

182

±31

Значение рН,

5,4

±0,3

5,3

±0,4

5,3

±0,1

5,6

±0,2

5,7

±0,3

5,3

±0,5

5,6

±0,3

5,6

±0,5

5,1

±0,4

СМДА, нмоль/мл

2,73 ±0,14

2,76 ±0,06

3,07 ±0,10

2,70 ±0,09

2,76 ±0,07

3,08 ±0,12

2,64 ±0,15

2,66 ±0,12

3,11 ±0,19

По результатам, представленным в табл.5, видно, что антиоксидант не способствует снижению окисления липидов в ЛЛЛФ цифелина при хранении (+4°С). Концентрация продуктов окисления (СМДА) в таких составах выше, чем в составе без антиоксиданта. При сравнении дисперсий по внешнему виду наблюдали выпадение осадка и расслоение в процессе хранения липосом с антиоксидантом в результате дестабилизации липосомальной мембраны. По результатам проведенного эксперимента обнаружили, что добавление в липосомальный состав цифелина  -токоферола в качестве агента, препятствующего перекисному окислению, привело к возникновению прооксидантного действия, поэтому выбран состав липосомальной дисперсии без добавления антиоксиданта.

Так в результате исследования разработан ЛП «Цифелин липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 17 мг».

Для стабилизации свежеприготовленной дисперсии сарколизина лиофилизацией проводили эксперимент по выбору концентрации криопротектора – сахарозы, добавляемой к липосомам с цитратным буфером (табл.6).

Таблица 6

Изменение показателей качества в лиофилизированной липосомальной форме  сарколизина с различной концентрацией сахарозы

Показатель качества

Концентрация сахарозы в образце липосом, %

2

4

6

8

10

12

Молярное соотношение «суммарный липид: сахароза»

1:0,6

1:0,8

1:1,0

1:1,2

1:1,4

1:1,6

Размер везикул,

нм

до

лиофилизации

178±27

176±25

174±8

168±6

173±15

175±11

после

184±22

171±18

172±13

165±9

171±17

162±18

через 2 недели после

187±29

150±19

158±19

159±12

154±15

135±20

Эффективность включения,

%

до

60±3

61±2

58±2

после

57±4

60±1

53±3

Значение рН

до

3,5±0,4

3,4±0,4

3,3±0,3

3,3±0,3

3,2±0,4

3,1±0,3

после

2,4±0,6

3,4±0,7

3,3±0,3

3,3±0,2

3,1±0,3

3,0±0,5

Как видно из табл. 6, во всем исследуемом диапазоне концентраций криопротектора происходило незначительное изменение размеров везикул и значения рН после лиофилизации, что невозможно сказать про ЭВ. Оптимальные параметры качества: размер везикул 165±9 нм, величина рН 3,3±0,2 и ЭВ 60±1 % получили для состава ЛЛЛФ сарколизина с концентрацией сахарозы 8  %.

В липосомальную дисперсию сарколизина не добавляли липофильный антиоксидант, так как это может привести к снижению жесткости бислоя и «вытеканию» внутренней среды липосом. Сравнили перекисное окисление ЛЛФ сарколизина до, сразу после лиофилизации и через 6 месяцев хранения (СМДА 1,35±0,11, 1,34±0,18 и 1,27±0,23 нмоль/мл, соответственно). При этом не наблюдали значимых различий показателей качества, а уровень МДА уменьшался с течением времени, что подтвердило антиоксидантный эффект цитратного буфера.

Таким образом, в результате исследования разработан ЛП «Сарколизин липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2 мг».

Стандартизация ЛЛЛФ цифелина и сарколизина

Качественный состав ЛЛЛФ подтверждали методом тонкослойной хроматографии. Оптимальное разделение пятен в случае ЛЛЛФ как цифелина так и сарколизина достигли с использованием подвижной фазы: «бутанол – ледяная уксусная кислота – вода»  в соотношении 12: 3: 5. В качестве детекторов применяли: пары йода, 0,2% спиртовой раствор нингидрина и 0,05% подкисленный раствор хлорида железа (III) (табл.7).

Таблица 7

Результаты хроматографирования ЛЛЛФ цифелина и сарколизина

Компонент

Rf

Цвет пятна с детектором

Пары йода

Нингидрин

Хлорид железа (III)

Цифелин

0,82

Желтый

Красно - розовый

Сиреневый

Сарколизин

0,69

Желтый

Красно - розовый

Сиреневый

Фосфатидилхолин

0,29

Желтый

Желтый

Коричневый

Холестерин

0,90

-

-

Сиренево-розовый

Сахароза

0,17

-

Сине-фиолетовый

-

Из табл.7 видно, что в данной системе все компоненты отошли друг от друга на достаточное для идентификации расстояние. С целью подтверждения наличия холестерина и сахарозы детектирование необходимо проводить раствором хлорида железа (III) и нингидрина, соответственно. Цвет пятен цифелина и сарколизина в ЛЛЛФ и растворах свидетелей идентичен.

   

Рис.3. Электронная микрофотография Рис.4. Электронная микрофотография

  ЛЛЛФ цифелина  ЛЛЛФ сарколизина

Как представлено на рис.3 и 4, везикулы после регидратации лиофилизированных липосомальных форм водой для инъекций восстанавливают свою структуру. Под электронным микроскопом видны липосомы как цифелина так и сарколизина округлой формы без видимых в поле зрения агрегатов, что подтверждает их стабильность.

Для ЛЛЛФ разработаны методики количественного определения разведений ЛЛЛФ и субстанций цифелина и сарколизина в 95 % этиловом спирте методом спектрофотометрии в УФ-области при 260±2 нм.

  Рис.5. Электронные спектры поглощения  Рис.6. Электронные спектры поглощения

спиртовых разведений спиртовых разведений

1 – ЛЛЛФ цифелина, 1 – «пустых» липосом,

2 – «пустых» липосом,  2 – ЛЛЛФ сарколизина,

3 – субстанции цифелина 3  – субстанции сарколизина

По представленным на рис.5 кривым видно, что «пустые» липосомы не поглощают в области максимума, поэтому количественное определение можно проводить относительно растворителя. В отличие от цифелина, как видно на рис.6, «пустые» липосомы для ЛЛЛФ сарколизина имеют поглощение равное 0,04, следовательно, анализ необходимо проводить относительно раствора сравнения (разведение «пустых» липосом).

По результатам определения специфичности, линейности, правильности, прецизионности и аналитической области разработанные методики количественного определения применимы в диапазоне концентраций ЛВ от 80 до 120 %.

По результатам качественного и количественного анализа подготовлены проекты ФСП на разработанные ЛФ. В соответствии с требованиями ГФ XII и  ОСТ 91500.05.001-00 выбраны показатели качества: описание, растворимость (регидратация), подлинность, средняя масса во флаконе, размер везикул, значение pH, потеря в массе при высушивании, количественное определение. Обязательными для ЛФ для парентерального введения также являются разделы – прозрачность и механические включения, но так как ЛЛФ представляют собой гетерогенную систему, эти показатели не могут быть определены.

Стандартные серии ЛЛЛФ цифелина и сарколизина хранили в морозильной камере при -18 С, поскольку такая температура установлена для хранения липидов. Согласно требованиям НД, определяли показатели качества сразу после изготовления, через 3, 6 (для ЛЛЛФ сарколизина) и 12 месяцев (для ЛЛЛФ цифелина). Продолжаются исследования для установления максимального срока годности.

Изучение  цитотоксической активности ЛЛЛФ цифелина и сарколизина

в опытах in vitro

В ходе исследования цитотоксического эффекта определяли количество клеток, погибших под воздействием ЛЛЛФ цифелина и сарколизина (рис.7 и 8).

 

  Рис.7. Цитотоксичность ЛЛЛФ цифелина Рис.8. Цитотоксичность ЛЛЛФ сарколизина

Как видно из рис.7, через 72 часа инкубации наибольшую цитотоксичность для ЛЛЛФ цифелина на линии SKOV-3, равную 78 %, установили в концентрации 910-4 моль/л, а для субстанции в той же концентрации лишь 45 %. На линии Jurkat максимальный цитотоксический эффект ЛЛЛФ цифелина выявлен в концентрации ЛВ 110-4 моль/л и составил 86 %. Тогда как для субстанции цитотоксичность, равную 74 % наблюдали в большей концентрации – 910-4 моль/л.

По данным, представленным на рис.8 установлено, что на клеточной линии аденокарциномы яичников SKOV-3 максимальный цитотоксический эффект субстанции сарколизина составил 73 % в концентрации 110-4 моль/л, а для ЛЛЛФ одинаково максимальный эффект – 84 % показан в концентрациях 7,510-5 и 110-4 моль/л. Цитотоксическую активность ЛЛЛФ сарколизина равную 94 % наблюдали на клеточной линии Т-клеточного лимфобластного лейкоза Jurkat в таких же концентрациях как и на SKOV-3 – 7,510-5 и 110-4 моль/л. Для субстанции в концентрациях 110-4 и 2,110-4 моль/л цитотоксичность составила 92 %.

Цитотоксический эффект характеризует ИК50 (ингибирующая концентрация) – концентрация препарата, при которой гибнет 50 % опухолевых клеток. Для ЛЛЛФ сравнили значение ИК50. В ходе исследования отмечена тенденция к ее снижению при инкубации от 24 до 72 ч:

  • на клеточной линии SKOV-3 величина ИК50 при инкубации в течение 72 ч для ЛЛЛФ сарколизина составила ~2,510-5 моль/л, для ЛЛЛФ цифелина - 110-5 моль/л.
  • на клеточной линии Jurkat после 72 ч инкубации установлено значение ИК50 в концентрации ~7,510-6 моль/л для ЛЛЛФ сарколизина и  ~510-6 моль/л для ЛЛЛФ цифелина.

Таким образом, на клеточных линиях опухолей человека: SKOV-3 и Jurkat выявили значительное возрастание цитотоксичности ЛЛЛФ сарколизина и цифелина по сравнению с субстанциями. Вместе с тем отмечено, что ЛЛЛФ сарколизина действует в меньших дозах по сравнению с ЛЛЛФ цифелина. ЛЛЛФ цифелина проявила большую активность на клетках лейкоза, а сарколизина на аденокарциноме яичников.

При сопоставлении цитотоксичности изучаемых ЛЛЛФ обнаружено небольшое различие значений в первые сутки с последующим увеличением эффективности в течение 72 ч. Снижение ИК50 для ЛЛЛФ цифелина и сарколизина в ходе исследования доказывает теорию о пролонгированном действии пегилированных липосом.

Изучение  противоопухолевого действия ЛЛЛФ цифелина

в опытах in vivo

Провели изучение спектра специфического действия пегилированной ЛЛЛФ цифелина. Как представлено на рис.9, при изучении противоопухолевого действия ЛЛЛФ цифелина в опытах in vivo установлено увеличение продолжительности жизни (УПЖ) мышей с перевитой лейкоцитарной лейкемией Р-388 при пятикратном внутрибрюшинном введении в дозе 20 мг/кг равное 83 % по сравнению с  13% перорально вводимой субстанции в дозе 80 мг/кг. Как видно из рис.10, на аденокарциноме молочной железы Са-755 при внутрибрюшинном введении ЛЛЛФ наблюдали торможение роста опухоли (ТРО), равное 91%, тогда как субстанция оказалась неактивной.

В результате проведенных экспериментов показано, что включение гидрофобного цифелина в состав липосомальной мембраны позволило значительно повысить его биодоступность и расширить спектр противоопухолевого действия.

  Рис.9. Сравнение противоопухолевого Рис.10. Сравнение противоопухолевого 

действия субстанции и ЛЛЛФ цифелина  действия субстанции и ЛЛЛФ цифелина

на лейкоцитарной лейкемии Р-388  на аденокарциноме молочной железы

  Са-755

Примечание:

* - р<0,05 по отношению к контролю;

** - р<0,05 по отношению к прототипу

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

  1. Разработаны, теоретически и экспериментально обоснованы составы и выбраны оптимальные методы изготовления липосомальных дисперсий цифелина (экструзия и гомогенизация) и сарколизина (экструзия).
  2. Выбран криопротектор – сахароза – для стабилизации липосомальных дисперсий цифелина и сарколизина лиофилизацией.
  3. Предложены и валидированы методики количественного определения цифелина и сарколизина в липосомальных лекарственных формах методом спектрофотометрии разведений дисперсии в 95% этиловом спирте при длине волны 260 ± 2 нм.
  4. Подобраны условия проведения качественного анализа компонентов в липосомальных лекарственных формах цифелина и сарколизина методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Sorbfil»: подвижная фаза «бутанол-ледяная уксусная кислота-вода» в соотношении 12:3:5, в качестве детекторов использовали – пары йода, 0,2% спиртовой раствор нингидрина и 0,05% подкисленный раствор хлорида железа (III).
  5. Разработаны проекты ФСП на ЛП «Цифелин липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 17 мг» и «Сарколизин липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2 мг».
  6. Установлен цитотоксический эффект липосомальных лекарственных форм цифелина и сарколизина в опытах in vitro на аденокарциноме яичников SKOV-3 и Т-клеточном лимфобластном лейкозе Jurkat.
  7. Показано противоопухолевое действие липосомальной лекарственной формы цифелина в опытах in vivo на мышах с лейкоцитарной лейкемией Р-388 и аденокарциномой молочной железы Са-755.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Котова Е.А., Оборотова Н.А., Краснюк И.И., Денисова Т.В. Совершенствование изготовления противоопухолевых ЛП. // Материалы IХ Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты»  г. Нижний Новгород, 18-19 мая 2010 г. – Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Том 9, №2. – С. 88.
  2. Котова Е.А., Оборотова Н.А., Игнатьева Е.В. Определение содержания цифелина в различных лекарственных формах // Материалы II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология», г. Тюмень, 26-28 сентября 2010 г. – Российский биотерапевтический журнал – 2010. – Том  9, №3. – С. 14.
  3. Козеев С.Г., Котова Е.А. Технологические приемы загрузки гидрофильных лекарственных препаратов в липосомы // Тезисы итоговой Всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» [Электронный ресурс] – Приложение к журналу «Сеченовский вестник». – Том 3, №1 – С.69. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 1 электрон. опт. диск (CD-ROM).
  4. Котова Е.А. Проблема солюбилизации субстанции сарколизина // Тезисы итоговой Всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» [Электронный ресурс] – Приложение к журналу «Сеченовский вестник». – Том 3, №1 – С.  72-73. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 1 электрон. опт. диск (CD-ROM).
  5. Котова Е.А., Козеев С.Г., Краснюк И.И., Оборотова Н.А. Установление качественного состава липидов в липосомальных препаратах методом тонкослойной хроматографии // Материалы Х Всероссийской научной конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», г. Москва, 22-23 марта 2011 г. – Российский биотерапевтический журнал – 2010. – Том  10, №1. – С. 36-37.
  6. Санарова Е.В., Котова Е.А. Сравнение технологии изготовления липосомальных лекарственных форм гидрофильных и гидрофобных веществ // Тезисы докладов IV Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов, г. Архангельск, 26-27 апреля 2011 г. – Бюллетень северного государственного медицинского университета – 2011. – №1 (выпуск XXVI). –  С. 274-275.
  7. Котова Е.А., Санарова Е.В., Ланцова А.В., Денисова Т.В., Краснюк И.И., Оборотова Н.А. Сравнение уровня перекисного окисления фосфолипидов в однослойных липосомах, полученных различными способами // Сборник материалов IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием: Биомедицинская инженерия и биотехнология, г. Курск, июнь 2011г. – Курск: ГОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России, 2011. – С. 53-55.
  8. Котова Е.А., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Краснюк И.И., Оборотова Н.А. Оптимизация состава пегилированной липосомальной формы цифелина // Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология», г. Саратов, 6-7 сентября 2011 г. – Российский биотерапевтический журнал – 2011. – Том  10, №4. – С. 101.
  9. Котова Е.А., Санарова Е.В., Козеев С.Г., Ланцова А.В., Орлова О.Л., Партолина С.А., Игнатьева Е.В., Краснюк И.И., Оборотова Н.А. Окисление фосфолипидов липосом в процессе лиофилизации // Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология», г. Саратов, 6-7 сентября 2011 г. – Российский биотерапевтический журнал – 2011. – Том  10, №4. – С. 101-102.
  10. Санарова Е.В., Котова Е.А., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Ланцова А.В., Денисова Т.В., Краснюк И.И., Оборотова Н.А. Индекс окисленности липосомальных фосфолипидов на стадиях технологического процесса  // Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология», г. Саратов, 6-7 сентября 2011 г. – Российский биотерапевтический журнал – 2011. – Том  10, №4. – С. 111.
  11. Котова Е.А. Волшебные пузырьки – липосомы цифелина // Биомолекула [Электронный ресурс]. – 2011. – 8. с. – http://biomolecula.ru/content/954 (дата обращения 26.10.2011).
  12. Котова Е.А., Полозкова А.П, Денисова Т.В., Краснюк И.И., Оборотова Н.А.  Оптимизация состава и технологии изготовления stealth липосом цифелина // Химико-фармацевтический журнал. – 2011. – Том 45, №12. – С. 37-40.
  13. Котова Е.А., Краснюк И.И., Оборотова Н.А. Стабилизация липосомальной дисперсии цифелина лиофилизацией // Международная научно-методическая конференция «Сандеровские чтения», посвященная памяти выдающегося отечественного ученого в области технологии лекарств Ю.К. Сандера, г. Санкт-Петербург, 3-4 февраля 2012 г.: сб. науч. тр. – СПб.: Изд-во СПХФА, 2012. – С.35-39. 
  14. Котова Е.А. Разработка липосомальной лекарственной формы противоопухолевого препарата цифелина // Научно-практическая конференция «Аспирантские и докторантские чтения: Дерзания нового времени – поиск инноваций», г. Москва, 8 февраля 2012 г.: сб. материалов конфер. – М.: Изд-во Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, 2012 – С. 94-95.
  15. Кокорекин В.А., Котова Е.А., Заболотная П.Г., Щепочкина О.Ю., Родионова Г.М., Краснюк И.И., Оборотова Н.А. Идентификация цифелина в липосомальной лекарственной форме методом спектроскопии ЯМР 1Н и 13С // Биофармацевтический журнал. – 2012. – Том 4, №1. – С. 23-28.
  16. Санарова Е.В., Котова Е.А., Козеев С.Г., Ланцова А.В., Игнатьева Е.В., Краснюк И.И., Оборотова Н.А.  Качество липосомальных фосфолипидов на этапах технологического процесса // Химико-фармацевтический журнал. – 2012. – Том 46, №3. – С. 50-53.
  17. Котова Е.А., Заболотная П.Г., Кокорекин В.А., Щепочкина О.Ю., Денисова Т.В., Краснюк И.И., Оборотова Н.А. Валидация методики количественного определения цифелина в лиофилизированной липосомальной лекарственной форме // Фармация. – 2012. –  №3. С. 8-10.
  18. Котова Е.А., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Краснюк И.И., Оборотова Н.А.  Разработка лиофилизированной липосомальной лекарственной формы цифелина // Химико-фармацевтический журнал. – 2012. – Том 46, №5. – С. 39-42.
  19. Kotova E.A., Sanarova E.V. Comparison of hydrophilic and hydrophobic liposomal drugs preparation technology // Тезисы докладов IV Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов, г. Архангельск, 26-27 апреля 2011 г. – Бюллетень северного государственного медицинского университета – 2011. – №1 (выпуск XXVI). –  С. 345.
  20.   Sanarova E.V., Kotova E.A., Lantsova A.V.  Manufacturing technology of antineoplastic drug liposomal forms // Rusnanotech nanotechnology international forum Moscow. Abstracts of the Rusnanotech participants and international competition of scientific papers in nanotechnology for young researchers.  [Электронный ресурс], – 2011. – 1 CD-ROM.
  21. Sanarova E.V., Kotova E.A., Lantsova A.V. Technology of liposomal Tiosens, Cifelin and Lysomustin for industrial purposes // Journal of Phisics: Conference Series [Электронный ресурс]. – 2012. – №345 – 4 с. – http://iopscience.iop.org/1742-6596/345/1/012045 (дата обращения 20.02.2012).



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.