WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ЩЕРБАКОВА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА

Совершенствование  эпидемиологического  надзора и лабораторной диагностики арбовирусных инфекционных болезней

14.02.02 – эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Саратов – 2011

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения  «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант

Академик Российской академии медицинских наук,

доктор медицинских наук, профессор

Кутырев Владимир Викторович

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Ющенко Галина Васильевна

Заслуженный деятель науки РФ, доктор  биологических наук, профессор

Шляхтин Геннадий Васильевич

Доктор медицинских наук

Коротков Владимир Борисович

Ведущая организация ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Защита состоится «____»_______________2012 г. в________ часов на  заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителя и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автореферат разослан _________________________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник                                                А.А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Актуальность оптимизации эпидемиологического надзора за арбовирусными инфекционными болезнями связана с эпидемиологической ситуацией, сложившейся в конце XX начале XXI веков. Глобальное потепление климата и антропогенная нагрузка на природные биоценозы обусловили расширение ареалов возбудителей  целого спектра природно-очаговых инфекционных болезней, [Алексеев В.В. и др., 2004; Бутенко А.М., Ларичев В.Ф., 2004; Львов Д.К. и др., 2004], а недостаточный уровень организации и эффективности эпидемиологического надзора способствовали ухудшению эпидемиологической ситуации в Российской Федерации по инфекционным болезням, в том числе и арбовирусной природы [Онищенко Г.Г., 2000, 2006]. В частности, широкое распространение получила лихорадка Западного Нила (ЛЗН), вспышки которой, в том числе с летальными исходами, имели место в России, США, Канаде, Румынии, Израиле, Чехии, Италии [Львов Д.К. и др., 2004; Crichlow R., Bailey J., 2004;  Goody R.J., 2008; Siddharthan V., 2009] и Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ), случаи заболевания которой ежегодно отмечаются на территории Южного федерального округа (ЮФО) Российской Федерации [Малецкая О.В. и др., 2010]. В целом за период 1999–2010 гг. зарегистрировано более 1300 случаев КГЛ и более  1500 случаев ЛЗН. При этом наибольшее количество случаев ЛЗН пришлось на регион Нижнего Поволжья.

Помимо вирусов Западного Нила (ЗН) и Крымской–Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), на территории Российской Федерации происходит активная циркуляция и других арбовирусов, о чем свидетельствуют результаты многолетних исследований [Бутенко А.М и др., 1989; Львов Д.К. и др., 2001], в частности, – это вирусы серогруппы калифорнийского энцефалита (СКЭ) – Тягиня, Инко, а также вирусы Батаи, Синдбис и др. Широкая распространенность, экологическая адаптивность, генетическая изменчивость, пантропность действия этих арбовирусов создают потенциальную опасность возникновения заболеваний среди людей [Львов Д.К. и др., 1989]. Разработка эффективных противоэпидемических и профилактических мероприятий, направленных на снижение заболеваемости, а также риска возникновения арбовирусных инфекционных болезней, возможна лишь на основе осуществления действенного эпидемиологического надзора, включающего все подсистемы информационного обеспечения, эпидемиологической диагностики, разработки и контроля реализации управленческих решений [Беляков В.Д., 1985; Черкасский Б.Л., 1990]. В настоящее время остаются не решенными ряд задач по организации и проведению эпидемиологического надзора по целому спектру арбовирусных инфекционных болезней, возбудители которых широко циркулируют на территории Российской Федерации. Одним из аспектов повышения эффективности эпидемиологического надзора за арбовирусными инфекционными болезнями является оптимизация эпидемиологического мониторинга.

Другой, не менее важной задачей, в рамках оптимизации эпидемиологического надзора является совершенствование лабораторной диагностики арбовирусных инфекционных болезней. Это связано в первую очередь с решением организационно-методических вопросов ее проведения на федеральном, региональном и территориальном уровнях в учреждениях здравоохранения и Роспотребнадзора, а также с разработкой и внедрением в практику современных диагностических препаратов.

Цель работы – оптимизация эпидемиологического мониторинга арбовирусных инфекционных болезней (на примере Саратовской и Астраханской областей) и совершенствование лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила. 

Задачи исследования:

  1. Определить территориальную приуроченность, характер распространённости и структурные особенности природных очагов арбовирусных инфекционных болезней на территории Саратовской и Астраханской областей. Оценить потенциальную эпидемиологическую значимость арбовирусов для данных регионов.
  2. Разработать метод дифференциации территории по степени потенциальной эпидемической опасности заражения арбовирусными инфекционными болезнями и провести эколого-эпидемиологическое районирование  Саратовской области.
  3. Определить направления совершенствования эпидемиологического надзора за арбовирусными инфекционными болезнями на основе оптимизации эпидемиологического мониторинга в соответствии с полученными данными о степени эпидемиологической значимости отдельных арбовирусов (на примере Саратовской и Астраханской областей).
  4. Разработать тест-системы для выявления РНК вирусов ККГЛ и ЗН методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Определить их диагностическую ценность и провести апробацию при мониторинге природных очагов арбовирусных инфекционных болезней.
  5. Разработать подходы к стандартизации лабораторной диагностики ЛЗН и КГЛ на территориальном, региональном и федеральном уровнях в соответствии с трехуровневой организацией лабораторной диагностики в учреждениях, осуществляющих санитарно-эпидемиологической надзор. 

       Теоретическая значимость и научная новизна Разработаны теоретические основы совершенствования эпидемиологического надзора за арбовирусными инфекционными болезнями на основе комплексного изучения динамики пространственно-временных параметров их проявления, эпизоотологического и лабораторного обеспечения путем расширения арсенала диагностических средств, оптимизации функционирования трехуровневой системы эпидемиологического мониторинга возбудителей инфекционных болезней I–II групп патогенности вирусной природы, новой методологии эпидемиологического районирования территорий по арбовирусным инфекциям.

Модельные исследования выполнены на примере Саратовской и Астраханской областей, системные разработки относительно функциональности всех трех уровней лабораторной сети – в масштабе Российской Федерации.

В результате мониторинга арбовирусных инфекционных болезней получены новые данные о современных ареалах арбовирусов, условиях их циркуляции и эпидемиологической значимости на территории Саратовской и Астраханской областей.

Анализ результатов эпидемиологического, эпизоотологического и экологического обследования за последние 10 – 12 лет (1999 – 2010 гг.) позволил  выявить циркуляцию на территории Саратовской области вирусов СКЭ, Батаи, Синдбис, ЗН, ККГЛ, которая характеризуется меньшей интенсивностью по сравнению с Астраханской областью, где циркулируют вирусы СКЭ, Батаи, Синдбис, ККГЛ, ЗН, Дхори, Бханджа, Укуниеми.

Определена структура природных очагов арбовирусных инфекций и их территориальная приуроченность, уточнен спектр арбовирусов и выявлены основные эколого-эпидемиологические и биоценотические особенности их циркуляции, установлены систематические группы носителей и переносчиков арбовирусов, уровни иммунной прослойки населения и сельскохозяйственных животных к арбовирусам. Показано расширение границ ареалов вирусов ЗН и ККГЛ на юг Саратовской области. Впервые на территории Саратовской области на основании данных лабораторных исследований выявлен случай ЛЗН.

Разработан новый методический подход количественной оценки степени потенциальной эпидемической опасности заражения арбовирусными инфекционными болезнями, который основан на результатах корреляционного анализа, свидетельствующего о наличии статистически достоверной (р<0,05) связи каждого из используемых эпидемиологических параметров с циркуляцией арбовирусов – это природно-климатические условия на территории конкретного района; наличие основных переносчиков и природных резервуаров арбовирусов; выявление «маркеров» (антигены/РНК или антитела) арбовирусов в клещах, комарах, в органах мелких млекопитающих, в сыворотках крови людей и  сельскохозяйственных животных. Такой подход позволил осуществить объективное эпидемиологическое районирование Саратовской области и выделить территории с высокой, средней и низкой степенью потенциальной опасности заражения арбовирусами.

Научно обоснованы основные направления оптимизации эпидемиологического мониторинга за арбовирусными инфекционными болезнями  в зависимости от различной эпидемиологической значимости отдельных арбовирусов (на примере Саратовской и Астраханской областей).

Впервые обоснованы принципы организации и функционирования единой многоуровневой системы лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за инфекционными болезнями. Предложены подходы по стандартизации лабораторной диагностики инфекционных болезней в соответствии с трехуровневой системой (на территориальном, региональном и федеральном уровнях), разработаны основные требования к лабораториям, персоналу, методам и схемам лабораторной диагностики, осуществлению внутреннего контроля качества в соответствии с международными стандартами, действующими в Российской Федерации в качестве ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий», ИСО 9001:2000 «Система управления качеством. Требования», ИСО 5725-(1-6) – 2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

Разработаны ПЦР-тест-системы для выявления РНК вирусов ККГЛ и ЗН. Предложена схема комплексной лабораторной диагностики болезней, вызванных этими возбудителями, а также алгоритм исследования полевого материала.

Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом Российской Федерации  на изобретение № 2324187 «Способ подготовки проб для серологических исследований из сопряженных очагов чумы и арбовирусных инфекций» и свидетельством о государственной регистрации базы данных № 2011620585 «Нуклеотидные последовательности и характеристики геномов, вариабельных тандемных повторов, олигонуклеотидных праймеров и зондов штаммов возбудителей бактериальных и вирусных инфекций I–II групп патогенности».

Практическая значимость и формы внедрения Результаты, представленные в работе, были использованы в отчетных материалах НИР, в рамках договоров с ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН при  выполнении Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002 – 2006 годы, а также совместных НИР: с ФГУЗ «Астраханская ПЧС» Роспотребнадзора и ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (шифр темы 038-1-00) «Мониторинг очагов арбовирусных инфекций на территории Астраханской области и разработка специфической диагностики и профилактики этих болезней»; с ФГУЗ Ставропольский НИПЧИ, ФГУЗ Астраханская ПЧС, ФГУЗ Элистинская ПЧС, ФГУЗ Причерноморская ПЧС, ФГУЗ ПЧС Приволжской железной дороги (г. Саратов) и ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (шифр темы 004-1-01) «Мониторинг очагов арбовирусных инфекций на территории юго-востока европейской части России и разработка системы специфической диагностики и профилактики»; НИОКР по Государственному контракту № 67-Д от 25.07.2011 г. «Разработка научно-методического обеспечения мониторинга, эпидемиологического расследования и лабораторной диагностики особо опасных, «новых» и «возвращающихся» инфекционных болезней на базе стационарных и мобильных лабораторий учреждений Роспотребнадзора» в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 – 2013 годы)» в 2011 г.

Материалы научных исследований  нашли отражение в приведенных ниже документах:

- Методические указания «Организация и проведение мероприятий против Крымской геморрагической лихорадки» МУ 3.1.12488-09, утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 26.02.2009 г.;

- Методические указания «Мероприятия по борьбе с лихорадкой Западного Нила на территории Российской Федерации» МУ 3.1.3.2600-10, утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 19.04.2010 г.;

- Практическое руководство «Специфическая индикация патогенных биологических агентов» М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006 288 с.;

- Практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» М: «Издательство «Медицина»,  издательство «Шико», 2009. 472 с.;

- Санитарно-эпидемиологические правила «Профилактика лихорадки Западного Нила» (представлены для утверждения в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека);

- Методические указания «Организация и проведение лабораторной диагностики лихорадки Западного Нила в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней» (представлены для утверждения в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека);

- Методические указания «Организация и проведение лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней» (представлены для утверждения в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека);

- Методические рекомендации «Эпидемиологическое районирование Саратовской области по степени потенциальной эпидемической опасности заражения арбовирусными инфекционными болезнями» (утверждены директором ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб», протокол Ученого Совета ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» № 4 от 28.06.2011).

Депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (Саратов) генетически модифицированные штаммы E. coli TG1 (pCCHF) и E. coli TG1 (pWN ApR), используемые для разработки положительных контрольных образцов к тест-системам, стандартных образцов предприятия (СОПк+), применяемые для контроля чувствительности и специфичности препаратов на этапе производства.

Материалы научных исследований использованы при составлении Комплексного плана профилактических и противоэпидемических мероприятий по предупреждению заболеваний лихорадки Западного Нила среди населения Саратовской области на 2011 2012 гг., утвержденного Заместителем Председателя Правительства Саратовской области, а также информационных писем Министерства здравоохранения Саратовской области для врачей ЛПУ Саратовской области.

Проведены Государственные испытания разработанных тест-систем для выявления РНК вирусов ККГЛ и ЗН. Результаты Государственных испытаний одобрены на Ученом совете ГИСК им. Л.А. Тарасевича (протокол заседания Ученого Совета ГИСК им. Л.А. Тарасевича № 14 от 19.1004 и № 1 от 17.01.06, соответственно). Получены рекомендации комитета МИБП о регистрации препаратов «Тест-система для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР» и «Тест-система для выявления РНК вируса Западного Нила методом ОТ-ПЦР» в Российской Федерации и внедрении их в практику здравоохранения, а нормативной документации к ним – к утверждению в установленном порядке (протокол заседания комитета МИБП  №5 от 28.07.05 и № 1 от 09.02.06, соответственно).

Научные и практически значимые результаты работы  по эпидемиологии и лабораторной диагностике арбовирусных инфекционных болезней использованы в лекциях на курсах первичной специализации и повышения квалификации, проводимых в ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» для специалистов учреждений Минздравсоцразвития, Роспотребнадзора и других ведомств, а также областных семинарах для специалистов Роспотребнадзора и ЛПУ Саратовской области.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Результаты мониторинга арбовирусных инфекционных болезней свидетельствуют о том, что на территории Саратовской области циркуляция арбовирусов носит менее интенсивный характер по сравнению с Астраханской областью. В настоящее время происходит расширение ареалов вирусов ЗН и ККГЛ на территории Саратовской области.
  2. В циркуляцию арбовирусов на территории Саратовской и Астраханской областей вовлечены различные виды кровососущих членистоногих и мелких млекопитающих, что определяет особенности структуры природных очагов арбовирусных инфекционных болезней в этих регионах.
  3. Разработан новый метод количественной оценки степени потенциальной эпидемической опасности заражения арбовирусными инфекционными болезнями, обеспечивающий объективное эпидемиологическое районирование Саратовской области с выделением территорий с различной  (высокой, средней и низкой) степенью потенциальной опасности заражения арбовирусными инфекционными болезнями.
  4. Использование дифференцированных подходов к организации эпидемиологического мониторинга в зависимости от степени эпидемиологической значимости арбовирусов для конкретных территорий позволяет оптимизировать эпидемиологический надзор за арбовирусными инфекционными болезнями на территории Саратовской и Астраханской областей.
  5. В основу совершенствования организации и проведения лабораторной диагностики ЛЗН и КГЛ положены принципы функционирования трехуровневой системы эпидемиологического мониторинга и лабораторной диагностики инфекционных болезней.
  6. Разработанные тест-системы для выявления РНК вирусов ЗН и ККГЛ методом ОТ-ПЦР могут быть использованы при мониторинге природных очагов и лабораторной диагностике арбовирусных инфекционных болезней.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на Научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); Всероссийской научно-практической конференции «Природно-очаговые инфекции в России: современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения» (Омск,1999); 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000); Научно-практической  конференции, посвященной 80-летию Омского НИИПИ «Актуальные аспекты природно-очаговых болезней» (Омск, 2001); VIII съезде Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002); 4-й Научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002);  Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология – XXI век» (Саратов, 2004); Международном совещании «Млекопитающие как компоненты аридных экосистем (ресурсы, фауна, экология, медицинское значение и охрана) (Саратов, 2004); VI Межгосударственной научно-практической конференции государств – участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников Содружества Независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); VII Межгосударственной научно-практической конференции государств – участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группа восьми» и санитарная  охрана территорий государств – участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006); VII съезде врачей-инфекционистов «Итоги и перспективы диагностики и лечения инфекционных больных» (Н.Новгород, 2006); Расширенном пленуме проблемной комиссии «Арбовирусы» РАМН и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); Х Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2007); Научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Минск, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств – участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); II Международной научной конференции «Зоологические исследования регионов России и сопредельных территорий» (Н. Новгород, 2007); Х Межгосударственной научно-практической конференции государств – участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и  ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (Ставрополь, 2010).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликованы 52 научные работы, в том числе 19 в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 286 страницах компьютерного текста, содержит введение, обзор литературы, главу с описанием используемых материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключение и выводы, иллюстрирована 39 таблицами, 20 рисунками. Библиография содержит 302 источника, в том числе 55 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. Сбор материала для исследований в рамках мониторинга арбовирусных инфекционных болезней проводился на территориях Саратовской и Астраханской областей. Точки сбора были подобраны таким образом, чтобы наиболее полно охарактеризовать обследуемую территорию в отношении распространения арбовирусов с учетом ландшафтной зональности Нижнего Поволжья. Участки долговременного наблюдения приурочены к крупным населенным пунктам, активно осваиваемым сельскохозяйственным и промышленным территориям, стыкам ландшафтно-географических зон, путям миграции и местам гнездования перелетных птиц.

Сбор материала в Саратовской области проводили в 2000 2010 гг.; на территории Астраханской области  в 1991 2000 и 2006 2007 гг. во время экспедиционных выездов (с апреля по ноябрь каждого года). 

На территории Саратовской области было собрано 5705 экз. комаров 12 видов Ae. vexans, Ae. lepidonotus, Ae. сataphylla, Ae. detritus, Ae. cyprius, Ae. flavescens, Ae. diantaeus, Ae. leucomelas, Ae. subdiversus, An. maculipennis, Cx. pipiens, M. richiardii; 12292 экз. клещей, представленных 7 видами семейства Ixodidae: D. marginatus, D. reticulatus, R. schulzei, R. rossicus, H. scupense, I. ricinus, I. persulcatus; 4055 экз. мелких млекопитающих 17 видов: малая лесная мышь, полевая мышь, домовая мышь, желтогорлая мышь, рыжая полевка, обыкновенная полевка, общественная полевка, водяная полевка, малый суслик, большой тушканчик, малый тушканчик, степная мышовка, ондатра, слепушонка обыкновенная, заяц-русак, насекомоядные; 204 экз. птиц 43 видов.

       На территории Астраханской области было собрано 76981 экз. комаров 7 видов Ae. caspius, Ae. сommunis, Ae. flavescens, Ae. vexans, An. hyrcanus, An. maculipennis, Cx. pipiens; 17020 экз. клещей  4 видов H. marginatum,  H. asiaatica,  Rh. schulzei, Rh. pumilio; 969 экз. мелких млекопитающих 8 видов: малый суслик, гребенщиковая песчанка, полуденная песчанка, домовая мышь, полевая мышь, обыкновенная полевка, общественная полевка, серый хомячок. Полевой материал был собран сотрудниками ФГУЗ «Астраханская противочумная станция» Роспотребнадзора.

Для изучения уровня иммунной прослойки населения к арбовирусам были проанализированы 1473 сывороток крови здорового населения, проживающего в Саратовской области, и 470 сывороток – в Астраханской области. Иммуносерологическими и молекулярно-генетическими методами было исследовано 50 проб сывороток крови от 32 больных (с подозрением на ОРВИ и лихорадку неясного генеза), госпитализированных в 2010 г. в Городскую больницу № 2 (г. Энгельс, Саратовская область). Для определения иммунной прослойки к арбовирусам среди сельскохозяйственных животных было исследовано 223 образца сывороток крови КРС, собранных на территории Саратовской области, и 279 сывороток крови КРС из Астраханской области.

В ходе Государственных испытаний ПЦР-тест-системы «ГенКонго» и  последующей ее апробации исследовали 667 пулов клещей, доставленных с эндемичных и неэндемичных по КГЛ территорий России и 268 сывороток крови здоровых доноров, людей с подтвержденным диагнозом «КГЛ» и другими вирусными заболеваниями. Материал был собран  на территории Астраханской, Ростовской областей и Ставропольского края.

Государственные испытания и апробацию ПЦР-тест-системы «ГенНил» проводили при исследовании 28 образцов органов птиц (смешанный пул головного мозга и селезенки) и 122 проб суспензий комаров и 175 сывороток крови здоровых доноров, лиц с заболеваниями, не исключающими арбовирусную этиологию и другие вирусные инфекции. Материал собран на территории Астраханской области и Ставропольского края. Пробы предварительно были протестированы на наличие вируса ЗН вирусологическими и иммуносерологическими методами.

В работе использовали 36 штаммов вирусов, относящихся к различным семействам: Flavi-, Toga-, Bunya-, Reo- и Orthomyxoviridae, геномные ДНК человека и мыши, 9 штаммов бактерий семейств Enterobacteriaceae, Streptococcaceae, Micrococcaceae, а также родов с неясным систематическим положением (Francisella), вызывающих, как и вирусы ЗН и ККГЛ, лихорадку или часто выявляемых в биологическом материале, исследование которого планируется проводить с помощью конструируемой тест-системы (кровь человека, органы млекопитающих и птиц, суспензии эктопаразитов).

Вирусные штаммы, использованные в работе, получены из Государственной коллекции вирусов Российской Федерации ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва). Все виды работ, связанные с использованием вирусных штаммов, проводились на базе лаборатории биологии и индикации арбовирусов этого института (зав. лабораторией профессор, доктор биол. наук А.М. Бутенко).

Бактериальные штаммы были получены из Государственной коллекции патогенных бактерий ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов). 

Методы исследований. В работе были использованы эпидемиологические, молекулярно-генетические, иммуносерологические, вирусологические методы и методы статистического анализа.

В основу проводимых исследований положен комплексный эпидемиологический подход, включающий эпизоотологическое и эпидемиологическое обследование природных очагов арбовирусных инфекционных болезней, вирусологические, иммуносерологические и молекулярно-генетические исследования полевого и клинического материала на арбовирусы, а также анализ полученных данных с использованием компьютерных программ и методов математической статистики.

Для выбора специфичных мишеней и диагностических праймеров использовали программы Oligo, Gene Runner, Vector NTI, Mega,  ресурсы интернета и веб-сайты – GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) и BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Олигонуклеотиды для амплификации участков генома вирусов ККГЛ и ЗН были синтезированы фосфоамидитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК в ЗАО «SYNTOL» (Россия).

Для выделения РНК использовали различные вариации метода нуклеосорбции в присутствии 6М гуанидинтиоцианата и метод фенол-хлороформовой экстракции.

Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием обратной транскриптазы M-MLV («Promega», США) и буферного раствора, содержащего случайные гексануклеотиды («Sigma», США), кроме этого для детекции РНК вируса ЗН использовали специфичный праймер Wn 10588. Для детекции РНК вирусов ЗН и ККГЛ методом ПЦР использовали наборы праймеров, разработанные в ходе настоящей работы. Амплификацию проводили в термоциклерах «Терцик МТС410» («ДНК-Технология», Россия), «TCP-100» («MJ Research», США).

В качестве положительного контроля к тест-системам генно-инженерным методом были сконструированы СОП (стандартные образцы предприятия), представляющие собой рекомбинантные плазмиды pGEM-T, содержащие фрагмент ДНК, гомологичный нуклеотидной последовательности участка РНК, кодирующего белок NS5 (для СОП вируса ЗН) и S-сегмента (для СОП  вируса ККГЛ).

Для проведения ИФА использовали коммерческие тест-системы производства ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва) и тест-системы производства ЗАО «Биосервис» (г. Боровск Калужской обл.).

Статистическую обработку полученных при исследовании полевого и клинического материала данных проводили по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева (1962) по таблицам А.Я. Боярского (1955), по критерию Фишера  [Урбах В.Ю., 1963].

Районирование территории проводили на основе методов балльной оценки показателей [Куклев Е.В.,1999] и регрессионной модели вычисления общего балльного показателя [Наркайтис Л.И., 2008] в собственной модификации. 

Мониторинг арбовирусных инфекций на территории Саратовской области был выполнен совместно со специалистами лаборатории эпизоотологического мониторинга ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (зав. лабораторией доктор биол. наук, профессор Попов Н.В.) и  аспирантом СГМУ Кутыревым И.В.

Исследования по изучению распространения арбовирусов и их эпидемиологического значения на территории Астраханской области выполнены совместно со специалистами ФКУЗ Астраханской противочумной станцией, в частности канд. мед. наук  Журавлевым В.И.

Разработка ПЦР-тест-систем осуществлялась совместно со специалистами ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» канд. мед. наук Красовской Т.Ю. и  канд. биол. наук Найденовой, а так же при участии специалистов лаборатории биологии и индикации арбовирусов  (зав. лабораторией доктор биол. наук, профессор Бутенко А.М.) ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского. Государственные испытания проводили  на базе ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского с участием сотрудников лаборатории стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов против арбовирусных инфекций, риккетсиозов и СПИДа ГИСК им. Л.А. Тарасевича (зав. лабораторией, доктор мед. наук, профессор М.С. Воробьева).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эпидемический мониторинг арбовирусных инфекционных  болезней на территории Саратовской и Астраханской областей

Для определения спектра циркулирующих арбовирусов, уточнения видового состава их основных переносчиков и носителей, особенностей распространённости и территориальной приуроченности природных очагов арбовирусных инфекций были проведены комплексные энтомолого-эпизоотологические и лабораторные исследования основных носителей и переносчиков арбовирусов – кровососущих членистоногих, мелких млекопитающих, птиц, а также сывороток крови населения и сельскохозяйственных животных, собранных на территории Саратовской и Астраханской областей. 

Результаты энтомолого-эпизоотологического мониторинга арбовирусных инфекционных болезней на территории Саратовской области

В ходе энтомолого-эпизоотологического обследования территории Саратовской области собраны и исследованы пробы от мелких млекопитающих (4055 экз., 17 видов), птиц (204 экз., 43 видов), комаров (5705 экз., 12 видов) и клещей (12292 экз., 7 видов). Выявлены виды комаров и клещей, являющихся основными переносчиками арбовирусов на территории Саратовской области. Установлено, что наиболее часто антигены арбовирусов регистрировали в пулах, составленных из комаров рода Aedes, что позволяет предположить доминирующую роль комаров этого рода в распространении арбовирусов на территории области. Впервые показано, что на территории южных районов области возможна циркуляция вируса ККГЛ, которая происходит с преимущественным участием клещей видов D. marginatus и R. schulzei. Установлено, что в циркуляции вируса ЗН, помимо комаров, могут участвовать клещи R. rossicus, R. schulzei, D. marginatus. Впервые на территории Саратовской области выявлены антигены вируса КЭ в клещах I.ricinus.

Среди грызунов, вовлекаемых в циркуляцию арбовирусов, наиболее важную роль играют фоновые виды и, в первую очередь, домовые и лесные мыши, в материале от которых зарегистрированы антигены вирусов СКЭ, Батаи, Синдбис, ККГЛ, ЗН. Показана принципиальная возможность заноса на территорию Саратовской области в период весенней миграции птиц возбудителей арбовирусных инфекционных болезней, в частности вирусов ЗН и Синдбис, маркеры которых обнаружены при исследовании птиц, добытых на территории Саратовского Заволжья. Установлено, что циркуляция арбовирусов наиболее интенсивно осуществляется в степной и полупустынной зонах области, о чем свидетельствуют показатели инфицированности членистоногих и мелких млекопитающих. На этих территориях выявлена циркуляция вирусов ЗН и ККГЛ, что свидетельствует о расширении северных границ ареалов этих арбовирусов, в том числе и на территории Саратовской области.

Результаты мониторинга арбовирусных инфекционных болезней на территории Астраханской области

В результате комплексного исследования собранных на территории Астраханской области фоновых видов комаров (76981 экз., 7 видов), клещей (17020 экз., 4 видов) и мелких млекопитающих (969 экз., 10 видов) были выявлены высокие показатели инфицированности арбовирусами всех сочленов паразитарной системы: вирус членистоногое млекопитающее. Полученные данные являются подтверждением активной циркуляции арбовирусов СКЭ (Тягиня, Инко), Батаи, Синдбис, ЗН, ККГЛ, Дхори, Бханджа и Укуниеми, происходящей в данном регионе в настоящее время. Основное значение в качестве переносчиков «комариных» арбовирусов (СКЭ, ЗН, Синдбис, Батаи) на территории области имеют представители рода Aedes:Ae. caspius, Ae. vexans, а также рода Culex: C.рipiens. Для вирусов, экологически тесно связанных с клещами (ККГЛ, Дхори, Бханджа, ЗН), основное значение в циркуляции имеет клещи H.marginatum.

Показано, что на территории области в круг циркуляции арбовирусов происходит вовлечение синантропных видов как членистоногих, так и мелких млекопитающих, в частности комаров C. рipiens и домовых мышей, что является условием формирования антропоургических очагов ряда инфекционных болезней и  может привести к осложнению эпидемиологической обстановки.

Результаты серологического мониторинга на территории Саратовской и Астраханской областей        

Для определения степени активности природных очагов арбовирусных инфекций, их эпидемического значения и распространенности на отдельных территориях проведены исследования сывороток крови населения, проживающего на территориях Саратовской и Астраханской областей, и сельскохозяйственных животных.

На наличие специфических IgG антител к арбовирусам исследовали сыворотки крови людей (1473 образца), постоянно проживающих на территории Саратовской области (пробы получены в Саратовском областном центре по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями). В результате проведённых исследований с помощью ИФА  была выявлена иммунная прослойка среди населения к арбовирусам СКЭ (Тягиня, Инко), Батаи, Синдбис, ЗН, ККГЛ, КЭ. Всего обнаружено 158 образцов (10,7 %), содержащих антитела к арбовирусам. При этом антитела к вирусам ККГЛ и ЗН были выявлены преимущественно в сыворотках крови людей, проживающих в полупустынной и степной зонах Саратовской области, а наличие антител к вирусу КЭ детектировали в образцах из лесостепной зоны. В целом, на территории области выявлен невысокий уровень иммунной прослойки среди населения ко всем арбовирусам (0,8 2,9 %), что свидетельствует о низкой активности циркуляции арбовирусов  в этом регионе. Эти данные совпадают с результатами эпизоотологического мониторинга и энтомологического обследования территории, в ходе которых также выявлены невысокие показатели инфицированности арбовирусами комаров, клещей, мелких млекопитающих. Наиболее высокий уровень иммунной прослойки к арбовирусам (за исключением КЭ) зарегистрирован в полупустынной зоне (13,4 %), что указывает на возможность эпидемиологических осложнений именно на этой территории.

Выявление лихорадки Западного Нила на территории Саратовской области

В связи с обострением эпидемиологической ситуации по ЛЗН в летне-осенний период на территориях Волгоградской и Воронежской областей в 2010 г. нами  проведено исследование 50 сывороток крови от 32 больных, находившихся на лечении в МУЗ «Городская больница № 2» (г. Энгельс Саратовской области)  с предварительными диагнозами: лихорадка неясного генеза (4 человека), ОРВИ (28 человек). Все обследуемые (жители г. Энгельс и Энгельсского района Саратовской области) заболели в период с 29 августа по 16 октября 2010 г. От 18 человек были получены парные сыворотки крови. Первый забор крови осуществлялся на 2 –19-й дни болезни, повторный – на 7 – 27-й дни. От 14 больных получено по одной сыворотке крови на 3 – 22 дни болезни. Сыворотки крови людей исследовали на наличие антител классов M и G к вирусу ЗН в ИФА.

При исследовании сывороток крови людей специфические антитела к вирусу ЗН и сероконверсия в парных сыворотках выявлены у одного больного - мужчины 49 лет, жителя г. Энгельс. Пациент заболел 3 сентября, находился на лечении в стационаре с предварительным диагнозом лихорадка неясного генеза. Первая сыворотка была взята на 9-й день болезни (11.09.10), титр антител к вирусу ЗН составил: Ig M 1:800, Ig G 1:100. Вторая сыворотка получена на 18-й день болезни (20.09.10) – Ig M 1:3200, Ig G 1:3200. В эпиданамнезе пациента отсутствовал факт посещения неблагополучных по лихорадке ЗН регионов, но был отмечен выезд на Волжские острова в районе с. Шумейка (в 10 км севернее г. Энгельс) и нападение комаров.

Для верификации результатов исследования образцы сывороток крови этого больного были направлены в Референс-центр по мониторингу за лихорадкой Западного Нила (ФКУЗ Волгоградский НИПЧИ Роспотребнадзора). В Референс-центре подтвердили полученные данные.

Впервые выявленный в 2010 г на территории Саратовской области случай ЛЗН, наряду с результатами изучения иммунной прослойки населения области к арбовирусам, служит еще одним доказательством расширения ареала вируса ЗН на территорию области.

Исследование сывороток крови сельскохозяйственных животных Саратовской области

В исследования были включены 223 сыворотки крови КРС, собранные сотрудниками СГАУ им. Н. Вавилова в районах области, расположенных в лесостепной, степной и полупустынной зонах области. Сыворотки крови исследовали в ИФА на наличие специфических иммуноглобулинов IgG  к вирусам СКЭ, Батаи, Синдбис, КЭ, ЗН и ККГЛ. Всего выявлено 50 положительных образцов (22,4 %), содержащих антитела к указанным выше арбовирусам, за исключением вируса КЭ. Показано, что КРС наиболее часто инфицируется вирусами Батаи и СКЭ (8,9 и 7,6 % положительных проб соответственно), а риск инфицирования этими вирусами наиболее высок в районах, относящихся к лесостепной и степной зонам. Иммунная прослойка среди КРС к вирусам ЗН и ККГЛ наиболее высока в степной (4,0 и 2,0 %, соответственно) и полупустынной (2,9 и 2,8 %, соответственно) зонах области. В целом  результаты изучения уровня иммунной прослойки среди КРС к арбовирусам полностью согласуется с данными, полученными при изучении иммунной прослойки среди населения, и свидетельствуют о невысокой активности арбовирусов на территории Саратовской области.

Исследования сывороток крови людей, проживающих на территории  Астраханской области

В исследование включены 158 сывороток крови людей (постоянно проживающих в Астраханской области), которые изучали на наличие специфических иммуноглобулинов к наиболее эпидемически значимым для этого региона арбовирусам – СКЭ, Батаи, ККГЛ, Синдбис, ЗН (пробы получены со станции переливания крови 1-й городской клинической больницы в 1998 г.).  Кроме этого, во время вспышки ЛЗН в 1999 г. на территории Астраханской области получены и исследованы в ИФА на наличие IgG к вирусу ЗН 163 сыворотки крови доноров. Помимо использования серологических методов для исследования сывороток, часть образцов (307 сывороток) была протестирована в реакции нейтрализации (РН) на наличие нейтрализующих антител к вирусу ЗН. Все серологические исследования проводили с участием сотрудников Астраханской ПЧС. РН выполняли на базе НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, при участии сотрудников этого института и Астраханской ПЧС.

В результате проведенных исследований выявлен высокий уровень иммунной прослойки среди населения к вирусам СКЭ, Батаи и ЗН (8,9 - 17,7 %). Кроме этого, в сыворотках крови выявлены антитела к вирусам Синдбис и ККГЛ.

При исследовании в РН сывороток крови людей, собранных до вспышки ЛЗН и после нее, выявлено двукратное увеличение числа положительно реагирующих проб (с 23,4 до 44,2 %). Этот факт, вероятно, указывает на массовый характер вспышки ЛЗН и большое количество инаппарантных форм, так как среди обследованных не было лиц с диагнозом «ЛЗН» или указывающих на перенесенное в прошлом заболевание. По данным ИФА, не удалось обнаружить существенных различий в уровне иммунной прослойки населения к вирусу ЗН в 1998 и 1999 гг.  По всей видимости, это объясняется тем, что в ИФА определяли IgG-антитела, а увеличение числа положительных проб произошло за счет выявления в РН нейтрализующих антител, в том числе IgM.

Исследование сывороток крови сельскохозяйственных животных в Астраханской области

Объектами исследования были 279 сывороток крови КРС, собранных на территории 6 районов Астраханской области. Сыворотки крови тестировали в ИФА на наличие специфических антител к вирусам СКЭ, Батаи, Дхори, Укуниеми, Бханджа, Синдбис, ЗН, ККГЛ. Всего выявлено 204 положительно реагирующих сыворотки (73,1 %). В целом, зарегистрированы высокие показатели иммунной прослойки (12,5 – 17,5 %) среди КРС к арбовирусам: СКЭ, Батаи, ККГЛ, ЗН, Синдбис и Дхори. Эти данные согласуются с результатами исследований членистоногих и мелких млекопитающих, в результате которых выявлены высокие показатели инфицированности различными арбовирусами, а также с результатами, полученными при исследовании уровня иммунной прослойки среди населения области к арбовирусам. Результаты исследований указывают на высокую активность природных очагов арбовирусных инфекционных болезней на территории Астраханской области.

Обобщенные данные об арбовирусах, циркулирующих на территории Астраханской и Саратовской областях, полученные нами в ходе исследования, представлены в таблице.

Таблица Обобщенные данные эпидемиологического мониторинга арбовирусных инфекционных болезней на территории Саратовской и Астраханской областей

Вирус

Основные переносчики/

Носители

Уровень иммунной прослойки среди людей

Уровень иммунной прослойки среди с/х животных

1

2

3

4

5

Батаи

Саратовская область

Ae. vexans

Ae. lepidonotus

Ae. cataphylla

Малый суслик

Малая лесная мышь

Желтогорлая мышь

2,4

14,8

Астраханская область

An. maculipennis

An. maculipennis

Ae. flavescens

Домовая мышь
полевая мышь

Обыкновенная полевка

8,9

16,1

СКЭ

Саратовская область

Ae. vexans

Ae. lepidonotus

Домовая мышь

Малый суслик

Желтогорлая мышь

2,6

7,5

Астраханская область

Ae. vexans

Ae. сaspius

Ae. flavescens

Домовая мышь
Обыкновенная полевка

Гребенщиковая песчанка

17,7

24,0

ККГЛ

Саратовская область

D. marginatus

R. sсhulzei

Малый суслик

Домовая мышь

Обыкновенная полевка

1,6

1,7

Астраханская область

H.marginatum

Rh.schulzei

H. asiaatica

Гребенщиковая песчанка

Обыкновенная полевка

Малый суслик

1,9

12,5

ЗН

Саратовская область

Ae. cataphylla

An. maculipennis

D. marginatus

R. sсhulzei

R. rossicus

Домовая мышь

Обыкновенная полевка

Общественная полевка

2,3

3,5

Астраханская область

Ae. сaspius

Ae. vexans

C. рipiens

H. marginatum

Домовая мышь

Обыкновенная полевка

15,3

17,5

КЭ

Саратовская область

D. reticulatus

I. ricinus

Н.и.

0,2

0

Астраханская область

Н.и.

Н.и.

н.и.

н.и.

Синд-бис

Саратовская область

Ae. cataphylla

Ae. detritus

Малый суслик

Малая лесня мышь

Домовая мышь

1,5

0,9

Астраханская область

Ae. vexans

C. рipien

Гребенщиковая песчанка

3,2

12,2

Примечание. Н.и. – не исследовали

Оптимизация эпидемиологического мониторинга
за арбовирусными инфекционными болезнями

Одним из аспектов повышения эффективности эпидемиологического надзора арбовирусных инфекционных болезней является оптимизация эпидемиологического мониторинга. Получаемая в ходе эпидемиологического мониторинга арбовирусных инфекционных болезней информация должна обеспечить возможность проведения оперативной динамической оценки состояния и тенденции развития эпидемического и эпизоотического процессов, а также ретроспективного эпидемиологического анализа [Беляков В.Д., 1985; Черкасский Б.Л., 1990]. В соответствии с этими задачами эпидемиологический мониторинг арбовирусных инфекционных болезней должен включать несколько уровней сбора информации: о состоянии заболеваемости, циркуляции возбудителей среди основных носителей и переносчиков, состоянии уровня коллективного иммунитета среди людей и животных к арбовирусам.

Оптимизация информационного обеспечения в рамках эпидемиологического мониторинга должна проходить нескольким направлениям. Во-первых, необходимо оценить результативность диагностических методов, используемых на различных этапах эпидемиологического мониторинга арбовирусных инфекционных болезней (при проведении лабораторной диагностики арбовирусных инфекций, в ходе энтомолого-эпизоотологического обследования территорий и серологического мониторинга) и определить место этих методов в схемах диагностических исследований. Во-вторых, требуют дифференциации объемы диагностических исследований, проводимых в рамках эпидемиологического мониторинга различных арбовирусных инфекционных болезней.

В рамках первого направления нами проведен анализ информативности ряда методических подходов, используемых в ходе эпидемиологического мониторинга арбовирусных инфекционных болезней. Показано, что наибольшей результативностью при энтомолого-эпизоотологическом обследовании территории обладают ИФА (для выявления антигенов) и ПЦР; при лабораторной диагностике арбовирусных инфекций – ИФА (для выявления IgM и IgG) и ПЦР; при серологическом мониторинге - ИФА (для выявления IgG).

С целью реализации второго направления – дифференциации объемов диагностических исследований, проводимых в рамках эпидемиологического мониторинга различных арбовирусных инфекционных болезней, нами проведена оценка эпидемиологической значимости различных арбовирусов, циркулирующих на территориях Саратовской и Астраханской областей, и с учетом этого осуществлено их распределение на группы. За основу такого распределения взят методический прием, предложенный Е.И. Андаевым (2009). В первую группу отнесены те арбовирусные инфекционные болезни, заболеваемость которыми официально регистрируется на территории области и в отношении которых проводится эпидемиологический надзор. Ко второй группе инфекционных болезней мы отнесли арбовирусные инфекции, возбудители которых широко распространены на территории области, но их значение в инфекционной патологии требует дополнительного изучения. К третьей группе отнесены арбовирусные инфекционные болезни, не представляющие серьезного эпидемиологического значения для этого региона. На основании различной эпидемиологической значимости отдельных арбовирусов предложены основные направления оптимизации эпидемиологического мониторинга арбовирусных инфекционных болезней с определением объемов и методических подходов проводимых диагностических исследований. Показано, что эпидемиологический мониторинг арбовирусных инфекционных болезней, относящимся к первой группе, должен проводиться  в полном объеме по следующим направлениям:

- организация и проведение целенаправленной лабораторной диагностики заболеваний;

- проведение ежегодного комплексного паразитологического и эпизоотологического мониторинга;

- изучение популяционного иммунитета населения и сельскохозяйственных животных к арбовирусам.

В отношении второй группы инфекционных болезней эпидемиологический мониторинг должен включать следующие направления:

- установление эпидемиологического значения арбовирусов в инфекционной патологии на  конкретной территории;

- изучение популяционного иммунитета населения и сельскохозяйственных животных к арбовирусам на территориях высокого и среднего риска заражения арбовирусными инфекционными болезнями;

- проведение комплексного паразитологического и эпизоотологического мониторинга на территории районов, относящихся к зонам высокого и среднего риска заражения арбовирусными инфекционными болезнями.

Проведение комплексного энтомолого-эпизоотологического обследования территории областей должно проводиться на основе областных программ, направленных на изучение экологических и эпизоотологических аспектов циркуляции арбовирусов на территории Саратовской и Астраханской областей, что позволит уточнить ареал и характер распространения вирусов, биоценотическую структуру природных очагов арбовирусных инфекций в различных природно-климатических и ландшафтных зонах региона. Энтомолого-эпизоотологическое обследование целесообразно осуществлять на территориях районов, относящихся к зонам высокого и среднего риска заражения арбовирусными инфекционными болезнями. С учетом данных по изучению уровня иммунной прослойки к арбовирусам среди населения Саратовской и Астраханской областей рекомендуемые объемы серологических исследований составляют 200 – 250 сывороток крови людей и 150 – 200 сывороток крови КРС.

В рамках эпидемиологического мониторинга арбовирусных инфекционных болезней, вошедшими в третью группу, предлагается проводить серологический мониторинг и исследовать материал от больных с подозрением на заболевание арбовирусной этиологии. 

Обследование территории, скрининговые исследования сывороток крови людей и сельскохозяйственных животных могут проводиться учреждениями противочумной системы и «ЦГиЭ». В этих же учреждениях должна быть организована и лабораторная диагностика сезонных лихорадочных заболеваний, симптомы которых не исключают арбовирусную этиологию.

Для оптимизации и повышения эффективности эпидемиологического мониторинга за арбовирусными инфекционными болезнями нами предложен методический подход дифференциации территорий по степени потенциальной эпидемической опасности заражения арбовирусными инфекционными болезнями.

С целью подбора показателей для районирования были изучены экологические, природно-климатические, географические условия на территориях, эндемичных для арбовирусных инфекционных болезней, а также данные по видовому составу основных носителей и переносчиков арбовирусов, их инфицированности, уровню иммунной прослойки среди населения и сельскохозяйственных животных. Это позволило определить основные эпидемиологические параметры, статистически достоверные (p<0,05), которые в дальнейшем использовали как показатели при районировании территории по степени потенциальной эпидемической опасности заражения арбовирусными инфекционными болезнями. В качестве показателей для дифференциации территории по степени потенциальной эпидемической опасности заражения арбовирусными инфекционными болезнями использовали природно-климатические условия на территории конкретного района (температурный режим, количество осадков), наличие основных переносчиков и природных резервуаров арбовирусов: комаров родов Culex, Aedes и др., клещей H. marginatum, D. marginatus, I. ricinus  и др., выявление «маркеров» (антигены/РНК или антитела) арбовирусов в клещах, комарах, в органах мелких млекопитающих, в сыворотках крови людей и сельскохозяйственных животных.

На основе данных энтомолого-эпизоотологического обследования районов Саратовской области и результатов серологического мониторинга проведено районирование территории по степени потенциальной опасности заражения лихорадками Тягиня и Инко, Батаи, Синдбис, ЛЗН, КГЛ и в целом арбовирусными инфекционными болезнями. Данные по районированию Саратовской области по степени потенциальной эпидемической опасности заражения КГЛ и ЛЗН представлены на рисунках 1 и 2.

Показано, что территориями высокого потенциального риска заражения арбовирусными инфекционными болезнями являются Александрово-Гайский, Красноармейский, Ровенский, Краснокутский, Питерский и Новоузенский районы области. К группе районов со средней степенью потенциальной эпидемической опасностью заражения относятся Дергачевский, Воскресенский, Лысогорский, Озинский, Самойловский, Энгельсский и Саратовский районы. Аткарский, Духовницкий, Федоровский, Базарно-Карабулакский, Хвалынский, Советский, Калиниский, Ершовский и Марксовский районы входят в группу территорий с низкой степенью потенциальной эпидемической опасности заражения арбовирусными инфекционными болезнями (рисунок 3).

Рисунок 1 - Районирование Саратовской области по степени потенциальной  эпидемической опасности заражения КГЛ

Рисунок 2 - Районирование Саратовской области по степени потенциальной  эпидемической опасности заражения ЛЗН

Рисунок 3 - Районирование территорий Саратовской области по степени потенциальной эпидемической опасности заражения арбовирусными инфекционными болезнями

Предложенная нами методика и проведенное с ее помощью районирование позволяет дифференцировать территорию Саратовской области по степени потенциальной эпидемической опасности заражения арбовирусными инфекционными болезнями. Предложенный метод районирования может быть использован для любой другой территории с коррекцией отдельных  показателей, характерных именно для этого региона.

Совершенствование лабораторной диагностики
арбовирусных инфекционных болезней

Стандартизация лабораторной диагностики лихорадки Западного Нила и Крымской геморрагической лихорадки

Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы является важной составляющей эпидемиологического надзора в рамках санитарной охраны территории Российской Федерации. Лабораторную диагностику опасных инфекционных болезней, к которым относятся и арбовирусные инфекции, в Российской Федерации осуществляют учреждения Роспотребнадзора: центры гигиены и эпидемиологии, противочумные учреждения, научно-исследовательские институты эпидемиологического и вирусологического профиля, государственные научные центры, а также профильные учреждения других ведомств. Все эти учреждения осуществляют исследование возбудителей инфекционных болезней в рамках единой многоуровневой системы индикации, идентификации и типирования возбудителей особо опасных, возвращающихся  и новых инфекций [Куличенко А.Н., Кутырев В.В., 2007; Кутырев В.В., Куличенко А.Н., 2007]. С целью совершенствования организации лабораторной диагностики инфекционных болезней нами были предложены и научно обоснованы принципы функционирования единой многоуровневой системы лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора, в том числе разработаны подходы по стандартизация лабораторной диагностики ЛЗН и КГЛ, а также разработаны  ОТ-ПЦР-тест-системы для детекции вирусов ЗН и ККГЛ, что расширяет арсенал диагностических средств, используемых в ходе осуществления эпидемиологического надзора за арбовирусными инфекционными болезнями.

Вступление в действие Международных медико-санитарных правил (ММСП) (2005) на территории Российской Федерации, обусловливает необходимость  проведения ряда мероприятий, направленных на укрепление национальных ресурсов, одним из ключевых компонентов которых является лабораторная сеть страны. В связи с этим лаборатории, осуществляющие диагностические исследования в рамках эпидемиологического надзора, должны соответствовать определенным требованиям, позволяющим получать результаты исследований, которым будет доверять международное сообщество. Одним из таких требований  является соответствие международным стандартам, действующим в Российской Федерации в качестве ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий», ИСО 9001:2000 «Система управления качеством. Требования», ИСО 5725-(1-6) – 2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». В соответствии с требованиями этих документов, а также трехуровневой системой лабораторной диагностики, действующей в Российской Федерации (на территориальном, региональном и федеральном уровнях), разработаны основные требования к лабораториям, персоналу, осуществлению внутреннего контроля качества,  методам и схемам лабораторной диагностики инфекционных болезней и др.

В качестве основного принципа при организации лабораторной диагностики инфекционных болезней предлагается использовать подход, позволяющий дифференцировать объемы и сложность используемых методов в зависимости от базового уровня лаборатории, обеспечивая при этом единство требований биологической безопасности и преемственность на всех этапах исследования. С повышением уровня организации лабораторной базы должен повышаться уровень ее оснащенности оборудованием, как аналитическим, так и обеспечивающим более высокий уровень биологической безопасности при выполнении работ. Соответственно этому должны увеличиваться объемы и  повышаться методический уровень исследований, в том числе при работе с материалом, содержащим ПБА в высоких концентрациях. Такой подход позволит обеспечить требуемый уровень биологической безопасности проводимых работ и рационального оснащения диагностических лабораторий.

Одним из основных моментов, направленных на повышение надежности и качества лабораторной диагностики, является верификация результатов на каждом последующем уровне с увеличением числа подтверждающих тестов. Это достигается за счет последовательного изучения материала в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней. Причем, если на первом уровне может проводиться только индикация возбудителя, то на третьем (в лабораториях Референс-центров и Национальных центров верификации диагностической деятельности) должна осуществляться полная идентификации выделенных штаммов микроорганизмов с использованием современного арсенала диагностических средств и методических подходов.

Основные принципы  организации лабораторной диагностики в соответствии с трехуровневой системой отражены в практическом руководстве «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» (Москва, 2009), а так же проектах методических указаний «Организация и проведение лабораторной диагностики лихорадки Западного Нила в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней»  и  «Организация и проведение лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней». Реализация требований к организации и проведению исследований, изложенных в указанных документах, обеспечит функционирование многоступенчатой системы верификации получаемых результатов, в ходе подтверждающего тестирования проб, что позволит повысить надежность и качество лабораторной диагностики опасных инфекционных болезней, в том числе ЛЗН и КГЛ. 

Конструирование тест-систем для выявления РНК вирусов Крымской-Конго геморрагической лихорадки и Западного Нила методом ОТ-ПЦР

С целью конструирования ПЦР-тест-систем для детекции РНК вирусов ЗН и ККГЛ, были подобраны специфические праймеры. Для выявления РНК вируса ККГЛ – праймеры, комплементарные участку гена, отвечающего за синтез белка, входящего в состав нуклеопротеина и локализованного в области консервативного участка S-сегмента; для детекции РНК вируса ЗН – системы праймеров (для двухэтапной ПЦР) на основе участка гена, кодирующего неструктурный белок NS5 РНК вируса ЗН. Кроме того, были подобраны оптимальные условия ПЦР с выбранными праймерами, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность реакции, а также методы выделения РНК.

В целях обеспечения биологической безопасности при работе с тест-системами и их производстве были сконструированы генно-инженерным методом стандартные образцы предприятия (СОПК+) и положительные контрольные образцы для тест-систем. Штаммы-продуценты E. coli TG1 (pCCHF) и E. coli TG1 pWN ApR депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (Саратов).

Диагностическую ценность (чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов) разработанных препаратов «ГенКонго» и «ГенНил» определяли в ходе Государственных комиссионных испытаний в соответствии с Программами, утвержденными Комитетом МИБП. 

Специфичность и чувствительность ПЦР с разработанными тест-системами оценивали в экспериментах с гомологичными и гетерологичными штаммами вирусов, СОПК+ – при тестировании различного биологического материала: сыворотки крови людей, суспензии клещей, суспензии комаров и др. Одновременно пробы тестировали в ИФА с тест-системами для выявления антигена вируса ККГЛ или ЗН. Титр вируса ККГЛ определяли путем интрацеребрального заражения вируссодержащим материалом новорожденных беспородных белых мышей, а титр вируса ЗН – на культуре клеток Vero E6.

Сравнительный анализ результатов, полученных вирусологическими методами, ИФА и ПЦР, показал, что ПЦР-анализ с использованием предложенных нами тест-систем превышает по чувствительности ИФА и не уступает методу выделения вирусов на чувствительной биологической модели (в организме биопробных животных, или в культуре клеток). Преимуществами ПЦР-анализа, по сравнению с вирусологическими методами, является скорость получения результатов (6 – 8 часов) при исследовании штаммов вирусов и проб полевого и клинического материала, а также повышение уровня биологической безопасности персонала, так как применение молекулярно-генетических тестов не сопряжено с накоплением возбудителя в чувствительных биологических моделях.

Проведенные Государственные испытания показали, что чувствительность тест-системы «ГенКонго» составила 5103 ГЭ/мл (соответствует заявленной чувствительности препарата), специфичность – 100 %, воспроизводимость результатов – 100 %. Чувствительность ПЦР с тест-системой «ГенНил» составила 1103 ГЭ/мл (соответствует заявленной чувствительности препарата), специфичность – 98,3 %, воспроизводимость результатов – 100 %. Отчет о проведенных Государственных приемочных испытаниях тест-системы «ГенКонго» рассмотрен на Ученом Совете ГИСК им. Л.А. Тарасевича (протокол № 14 от 19.10.04) и утвержден Комитетом МИБП (протокол № 5 от 28.07.05). Тест-система «ГенНил» также рекомендована Ученым советом ГИСК им. Л.А. Тарасевича (протокол № 1 от 17.01.06) и Комитетом МИБП (протокол № 1 от 09.02.06) к регистрации в Российской Федерации. 

Для того, чтобы оценить разработанные нами препараты с точки зрения их эффективности, удобства применения в ходе эпизоотологического мониторинга природных очагов арбовирусных инфекционных болезней и лабораторной диагностики ЛЗН и КГЛ провели их апробацию при исследовании полевого и клинического материала. Показано определенное преимущество ПЦР-анализа, по сравнению с ИФА при мониторинге природных очагов арбовирусных инфекционных болезней и целесообразность использования ПЦР совместно с ИФА, направленным на выявление специфических антител при лабораторной диагностике ЛЗН и КГЛ.

ВЫВОДЫ

  1. Анализ данных эпизоотологического мониторинга в динамике показал, что на территории Саратовской области осуществляется циркуляция вирусов СКЭ, Батаи, Синдбис, ЗН, ККГЛ; процессы циркуляции характеризуются меньшей интенсивностью по сравнению с Астраханской областью, на территории которой циркулируют вирусы СКЭ, Батаи, Синдбис, ККГЛ, ЗН, Дхори, Бханджа, Укуниеми.
  2. Расширены представления и выявлены различия в популяционной структуре природных очагов арбовирусных инфекций на территории Саратовской и Астраханской областей и степени вовлеченности отдельных видов кровососущих членистоногих и мелких млекопитающих в циркуляцию арбовирусов. В Саратовской области циркуляция арбовирусов осуществляется с участием комаров  родов Aedes (Ae. vexans, Ae. lepidonotus, Ae. cataphylla) и Culex (C. рipiens), клещей родов Dermacentor (D. marginatus, D.reticulatus), Rhipicephalus (R. schulzei, R. rossicus) и Ixodes (I. ricinus). Среди мелких млекопитающих в циркуляцию арбовирусов наиболее часто включаются видовые сообщества домовых, малых лесных мышей и обыкновенных полевок, а в Заволжье – популяции малого суслика и ондатры. На территории Астраханской области основное эпидемиологическое значение в циркуляции арбовирусов принадлежит популяциям комаров родов Aedes (Ae. caspius и  Ae. vexans), Anopheles (An.maculipennis и An. hyrcanus) и Culex (C. рipiens), клещей родов Hyalomma (H. marginatum) и Rhipicephalus (R. schulzei), а также видовым сообществам обыкновенных полевок, домовых мышей и гребенщиковых песчанок.
  3. Результаты изучения иммунной прослойки к арбовирусам среди населения Саратовской области свидетельствуют о потенциальном эпидемическом значении вирусов ЗН, ККГЛ, Батаи, СКЭ, Синдбис для данного региона, при этом установлено, что наиболее высокие показатели уровня иммунной прослойки к вирусам Батаи и СКЭ зарегистрированы в районах, приуроченных к степной и лесостепной зонам области, а к вирусам ЗН и ККГЛ – в районах, расположенных в степной и полупустынной зонах. Специфические антитела к вирусу КЭ  выявлены только при исследовании сывороток крови людей, проживающих на территории лесостепной зоны области. Среди сельскохозяйственных животных определен популяционный иммунитет к вирусам ЗН, ККГЛ, Батаи, СКЭ и Синдбис. Высокий уровень иммунной прослойки среди населения Астраханской области к вирусам СКЭ, Батаи, ККГЛ, Синдбис, ЗН подтверждает их эпидемическую значимость. У сельскохозяйственных животных выявлена иммунная прослойка к вирусам СКЭ, Батаи, ККГЛ, ЗН, Синдбис, Бханджа, Дхори, Укуниеми, при этом наиболее высокие показатели уровня популяционного иммунитета зарегистрированы к вирусам СКЭ, Батаи, ККГЛ, ЗН, Синдбис и Дхори.
  4. Выявлены тенденции к расширению ареалов вирусов ЗН и ККГЛ на территории Саратовской области, о чем свидетельствуют исследования иммунной  прослойки населения и данные эпизоотологического мониторинга в динамике. На  расширение границ природного очага ЛЗН указывает впервые выявленный в 2010 г на территории Саратовской области случай ЛЗН, диагностированный на основании четырехкратного увеличения титров специфических антител (IgG и  IgM) к вирусу ЗН при исследовании парных сывороток крови.
  5. Впервые с использованием стандартизованных показателей – природно-климатические условия на территории конкретного района, наличие основных переносчиков и природных резервуаров арбовирусов, выявление «маркеров» (антигены/РНК или антитела) арбовирусов, проведено эпидемиологическое районирование Саратовской области и определены территории высокой, средней и низкой степени потенциальной опасности заражения арбовирусами. На основании данных ранжирования территории предложены схемы эпидемиологического мониторинга арбовирусных инфекционных болезней в отдельных административных образованиях области. 
  6. На основе данных о распространенности арбовирусов на территориях Саратовской и Астраханской областей, эпизоотической активности природных очагов арбовирусных инфекционных болезней и различной эпидемиологической значимости отдельных арбовирусов для этих регионов разработаны дифференцированные подходы и предложены пути оптимизации эпидемиологического мониторинга арбовирусных инфекционных болезней.
  7. Разработаны основные принципы организации и проведения лабораторной диагностики инфекционных болезней, в том числе ЛЗН и КГЛ, в соответствии с трехуровневой системой (на территориальном, региональном и федеральном уровнях), что позволяет повысить надежность и качество диагностических исследований за счет дифференциации их объемов в зависимости от базовой оснащенности лабораторий и многоуровневой верификации получаемых результатов.
  8. Показано, что разработанная тест-система для выявления РНК вируса ЗН методом ОТ-ПЦР «ГенНил» характеризуется чувствительностью 1103 ГЭ/мл, специфичностью – 98,3 %, воспроизводимостью результатов – 100 %, позволяет выявлять возбудитель ЛЗН в сыворотке (плазме) крови, суспензиях клещей, комаров, органов животных (мозг, селезенка) и может быть использована при проведении лабораторной диагностики ЛЗН, в том числе при мониторинге природных очагов этой арбовирусной инфекционной болезни. 
  9. Установлено, что разработанная тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР «ГенКонго» характеризуется чувствительностью 5103 ГЭ/мл, 100 % специфичностью и воспроизводимостью результатов, позволяет выявлять возбудитель КГЛ в сыворотке (плазме) крови, суспензиях клещей и органов животных (мозг, селезенка) и может быть использована при проведении лабораторной диагностики КГЛ и мониторинге природных очагов этой арбовирусной инфекционной болезни.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Рогаткин А.К., Щербакова С.А., Андросова С.В., Журавлев В.И., Ларичев В.Ф., Хуторецкая Н.В., Букаева И.Н., Яшков А.И., Куклев Е.В., Куличенко А.Н., Кутырев В.В., Бутенко А.М. Дальнейшее изучение циркуляции арбовирусов в Астраханской области (1998-1999 г.г.)// Мед. паразитол. и паразитарн. болезни 2000. № 4. С.4951. (из перечня ВАК).
  2. Гаранина С.Б., Щербакова С.А., Ларичев В.Ф., Яшечкин Ю.И., Тучков И.В., Меркулова Т.К., Хуторецкая Н.В., Бутенко А.М., Куличенко А.Н. Разработка тест-систем для индикации вирусов Западного Нила и Конго-Крымской лихорадки методом полимеразной цепной реакции// Матер. 1-й Всерос. науч.–практ. конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций». – Саратов. –2000. – С.52–54.
  3. Гаранина С.Б., Рогаткин А.К., Щербакова С.А., Журавлев В.И., Клюева Е.В., Мальков П.М., Путилина Н.Г., Куличенко А.Н. Сравнительное изучение эффективности ПЦР-анализа и ИФА при детекции вирусов Западного Нила и Крымской геморрагической лихорадки в полевом и клиническом материале// Матер. 1-й Всерос. науч.–практ. конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций». – Саратов. –2000. – С.56 – 57.
  4. Гаранина С.Б., Щербакова С.А., Куличенко А.А., Журавлев В.И., Рогаткин А.К. Комплексное использование ПЦР и ИФА при детекции вируса Западного Нила в полевом и клиническом материале// Природно-очаговые особо опасные инфекции на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика. – Сб. науч. тр., посв. 100-летию Астраханской противочумн. ст. – Астрахань, 2001. – С. 139 – 142.
  5. Клюева Е.В., Щербакова С.А., Головинская О.Н., Гаранина С.Б., Чекашов В.Н., Попова Э.З., Попов Н.В., Куклев Е.В., Куличенко А.Н. Изучение циркуляции некоторых арбовирусов на территории Саратовской области// Матер. науч-практ. конф. «Актуальные аспекты природноочаговых болезней», посв. 80-летию Омского НИИПИ. – Омск. 2001. – С. 39–40.
  6. Шишкина Е.О., Бутенко А.М., Гайдамович С.Я., Ларичев В.Ф., Журавлев В.И., Щербакова С.А., Ковтунов А.И., Джаркенов А.Ф., Ситков В.Г., донская М.Г. Применение реакции нейтрализации, ИФА-IgG, ИФА-IgM и РТГА для изучения иммуноструктуры населения Астраханской области к вирусу Западного Нила в 1998 и 1999 гг.// Матер. Науч.-практ. конф. «Актуальные аспекты природноочаговых болезней», посв. 80-летию Омского НИИПИ. – Омск. 2001. – С. 79 – 80.
  7. Шишкина О.Е., Бутенко А.М., Гайдамович С.Я., Ларичев В.Ф., Журавлев В.И., Щербакова С.А., Ковтунов А.И., Джаркенов А.Ф., Ситков В.Г., Донская М.Г. Изучение иммуноструктуры населения Астраханской области к вирусу Западного Нила в 1998 и 1999 гг.// Матер. Науч.-практ. конф. «Актуальные аспекты природноочаговых болезней», посв. 80-летию Омского НИИПИ. – Омск. 2001. – С. 80 – 82.
  8. Журавлев В.И., Рогаткин А.К., Щербакова С.А., Путилина Н.Г., Андросова С.В., Мацуга Т.П., Ибрагимов Ф.Х. Экология и эпидемиологическое значение арбовируса «913=64» now?// Пробл. особо опасных  инф. –  2001.Вып.1 (81). С. 2630. (из перечня ВАК)
  9. Щербакова С.А., Куляш Г.Ю., Куклев Е.В., Кутырев В.В. Арбовирусные инфекции их актуальность для здравоохранения Саратовской области// Пробл. особо опасных  инф. 2001.Вып.1 (81). С. 1325. (из перечня ВАК).
  10. Журавлев В.И., Рогаткин А.К., Щербакова С.А., Путилина Н.Г., Ибрагимов Ф.Х., Андросова С.В., Мацуга Т.П., Гаранина С.Б. Экологические аспекты циркуляции арбовирусов на территории Астраханской области//  Пробл. особо опасных инф.   2001.Вып.2 (82). С. 7177. (из перечня ВАК).
  11. Щербакова С.А., Головинская О.Н., Клюева Е.В., Гаранина С.Б., Савицкая Л.В., Куличенко А.Н., Кутырев В.В. Результаты исследования сывороток крови населения Саратова на антитела к арбовирусам // Вопр. вирусол. 2002. №3. С. 3234. (из перечня ВАК).
  12. Клюева Е.В., Щербакова С.А., Головинская О.Н., Гаранина С.Б., Савицкая Л.В., Чекашов В.Н., Слудский А.А., Удовиков А.И., Князева Т.В., Колнобрицкая О.А., Попов Н.В., Куклев Е.В., Куличенко А.Н. Изучение циркуляции вирусов Западного Нила и Крымской геморрагической лихорадки в южных районах Саратовской области // Матер. VIII съезда Всесоюзн. об-ва. эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. – М., 2002. – С. 336–337.
  13. Клюева Е.В., Шарова И.Н., Щербакова С.А., Добло А.Д., Чекашов В.Н., Удовиков А.И., Слудский А.А., Дмитриева Л.Н., Ерофеев А.В., Пристанский Р.В., Коломеец В.В., Куличенко А.Н. Изучение зараженности клещей вирусом Крымской-Конго геморрагической лихорадки, собранных на территории Саратовской, Волгоградской и Ростовской областей // Матер. юбил. науч.-практ. конф. «Эпидемиология и безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посв. 50-тилетию Ставропольского НИПЧИ. – Ставрополь, 2002. – С. 125 – 126.
  14. Гаранина С.Б., Журавлев В.И., Щербакова С.А., Рогаткин А.К., Куличенко А.Н. Совершенствование схемы идентификации арбовирусов с использованием молекулярно-генетических методов// Матер. юбил. науч.-практ. конф. «Эпидемиология и безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посв. 50-тилетию Ставропольского НИПЧИ. – Ставрополь, 2002. – С 274 – 275.
  15. Шишкина Е.О., Бутенко А.М., Гайдамович С.Я., Лиричев В.Ф., Журавлев В.И., Щербакова С.А., Ковтунов А.И., Джаркенов А.Ф., Ситков В.Г, Донская М.Г.  Изучение иммуноструктуры населения Астраханской области к вирусу Западного Нила в 1998 и 1999 гг.// Вопр. вирусол.2002. № 6. С. 1317. (из перечня ВАК).
  16. Билько Е.А, Щербакова С.А., Красовская Т.Ю., Клюева Е.В., Куличенко А.Н. Изучение иммунной прослойки к арбовирусам у жителей Саратова//  Матер. Всероссийск. науч.-практ. конф. «Медицинская микробиология – XXI век» - Саратов, 2004. – С. 35–36.
  17. Малюкова Т.А., Ляпин М.Н., Головко Е.М., Костюкова Т.А., Щербакова С.А., Плотникова Е.А., Дроздов И.Г. Оценка бактерицидного действия -пропиолактона на взвеси вакцинного штамма чумного микроба// Матер. Всероссийск. науч.-практ. конф. «Медицинская микробиология – XXI век» - Саратов, 2004. – С. 144–145.
  18. Клюева Е.В., Щербакова С.А., Слудский А.А., Чекашов  В.Н., Князева Т.В., Колнобрицкая О.Н., Попов Н.В., Куличенко Н.В. Зараженность арбовирусами мелких млекопитающих, отловленных в пустынной зоне Саратовской области // Матер. Междунар. совещ. «Млекопитающие как компоненты аридных экосистем (ресурсы, фауна, экология, медицинское значение и охрана)». – Саратов, 2004. – С. 60–61.
  19. Красовская Т.Ю., Билько Е.А., Данилов А.Н., Матвеева Т.Ф., Моисеенко О.Г., Щербакова С.А., Куличенко А.Н. Результаты исследования сывороток крови населения Пугачевкого и Балаковского районов Саратовской области на антитела к арбовирусам// ЗНиСО 2004. № 12/141 С. 2527. (из перечня ВАК).
  20. Щербакова С.А., Билько Е.А., Клюева Е.В., Данилов А.Н., Плотникова Е.А., Тарасов М.А., Чекашов В.Н., Удовиков А.И., Князева Т.В., Шилов М.М., Самойлова Л.В., Храмов В.Н., Казакова Л.В., Куклев Е.В., Куличенко А.Н. Особенности экологии и ландшафтного распространения арбовирусов на территории Саратовской области // ЖМЭИ 2005. № 5 С. 2730. (из перечня ВАК).
  21. Найденова Е.В., Шарова И.Н., Щербакова С.А., Яшечкин Ю. И., Куличенко А.Н. Разработка и апробация ПЦР-тест-системы для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР// Матер. VI Межгос. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях». – Волгоград, 2005. – С. 270-271.
  22. Красовская Т.Ю., Шарова И.Н., Щербакова С.А., Яшечкин Ю.И., Ларичев В.Ф., Хуторецкая Н.В., Бутенко А.М., Куличенко А.Н. Тест-система для выявления РНК вируса Западного Нила методом ПЦР // Матер. VII Межгосуд. науч.-практ. конф. «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербуржского саммита «Группа восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ». – Оболенск, 2006. – С. 212.
  23. Найденова Е.В., Шарова И.Н., Щербакова С.А., Яшечкин Ю.И., Ларичев В.Ф., Воробьева М.С., Бутенко А.М., Куличенко А.Н., Львов Д.К., Кутырев В.В. Тест-система для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР // Пробл. особо опасных инф. - 2006. Вып.2 (92). С. 5456. (из перечня ВАК).
  24. Найденова Е.В., Яшечкин Ю.И., Щербакова С.А., Шарова И.Н., Куличенко А.Н. Конструирование положительного контрольного образца к тест-системе для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР// Матер. VII съезда врачей-инфекционистов «Итоги и перспективы диагностики и лечения инфекционных больных». – Н.Новгород, 2006. – С. 169 – 170.
  25. Красовская Т.Ю., Шарова И.Н., Щербакова С.А., Яшечкин Ю.И., Ларичев В.Ф., Хуторецкая Н.В., Куличенко А.Н. Разработка тест-системы для выявления РНК вируса Западного Нила методом ОТ-ПЦР // Матер. VII съезда врачей-инфекционистов «Итоги и перспективы диагностики и лечения инфекционных больных». – Н.Новгород, 2006. – С. 159.
  26. Красовская Т.Ю., Найденова Е.В., Шарова И.Н., Яшечкин Ю.И., Щербакова С.А., Ларичев В.Ф., Хуторецкая Н.В., Саркисян К.А., Воробьева М.С., Бутенко А.М., Куличенко А.М., Львов Д.К., Кутырев В.В. Разработка и внедрение ПЦР-тест-систем для детекции вирусов Западного Нила и ККГЛ// Арбовирусы и арбовирусные инфекции: Матер. расширенного пленума пробл. комиссии «Арбовирусы» РАМН. – Астрахань, 2006.- С. 97-99.
  27. Топорков А.В., Кабин В.В., Тарасов М.А., Щербакова С.А., Слудский А.А., Шарова И.Н., Попов Н.В., Кологоров А.И., Кутырев В.В. Организационно-методические аспекты обследования сочетанных очагов особо опасных арбовирусных и бактериальных инфекций (на примере среднего и Нижнего Поволжья)// Арбовирусы и арбовирусные инфекции: Матер. расширенного пленума пробл. комиссии «Арбовирусы» РАМН. – Астрахань, 2006.- С. 147– 149.
  28. Щербакова С.А., Билько Е.А., Найденова Е.В., Красовская Т.Ю., Шарова И.Н., Пионтковский С.А., Уткин Д.В., Чекашов В.Н., Слудский А.А., Попов Н.В., Куклев Е.В., Фирстов Е.Н., Потемина Л.П., Логунова Т.Е., Водина Е.А., Куличенко А.Н., Кутырев В.В. Экологические и эпидемиологические аспекты циркуляции арбовирусов на территории Саратовской области// Арбовирусы и арбовирусные инфекции: Матер. расширенного пленума пробл. комиссии «Арбовирусы» РАМН. – Астрахань, 2006.- С. 150–152.
  29. Клюева Е.В., Щербакова С.А., Билько Е.А., Красовская Т.Ю., Самойлова Л.В., Данилов А.В., Слудский А.А., Чекашов В.Н., Удовиков А.И., Шилов М.М., Князева Т.В., Колнобрицкая О.Н., Попов Н.В., Куличенко А.Н. Зараженность мелких млекопитающих арбовирусами на территории Саратовской области // Бюл. Московского об-ва испытателей природы. Отдел биологический. – 2006. – Т.111., №3. – С.42–43.
  30. Щербакова С.А., Куклев Е.В., Куличенко А.Н., Самойлова Л.В., Слудский А.А., Попов Н.В., Кологоров А.И. Совершенствование эпидемиологического надзора за арбовирусными инфекциями // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. – 2007. – Т.3. – С. 238–239.
  31. Куклев Е.В., Кологоров А.И., Попов Н.В., Щербакова С.А. Совершенствование эпидемиологического надзора в сочетанных природных очагах бактериальных и вирусных инфекций// Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. – 2007. – Т.3. – С. 192– 193.
  32. Матросов А.Н., Щербакова С.А., Слудский А.А., Чекашов В.Н., Фирстов Е.Н., Князева Т.В., Красовская Т.Ю., Тарасов М.А., Кузнецов А.А., Шилов М.М., Удовиков А.И., Яковлев С.А. Эпизоотологический мониторинг в природных очагах зоонозных инфекций в Саратовской области // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. – 2007. – Т.3. – С. 201.
  33. Найденова Е.В., Щербакова С.А., Яшечкин Ю.И., Куклев Е.В. Районирование территории Саратовской области по возможности осуществления циркуляции вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки// Матер. 10-й Всерос. медико-биол. конф. молодых исследователей «Человек и его здоровье». – СПб., 2007. – С. 296–297.
  34. Найденова Е.В., Щербакова С.А., Шарова И.Н., Ларичев В.Ф., Хуторецкая Н.В., Бутенко А.М. Изучение эффективности методов лабораторной диагностики КГЛ в зависимости от срока начала заболевания// Матер. науч.-практ. конф. «Молекулярная диагностика инфекционных болезней». –  Минск, 2007. –С. 184.
  35. Ларичев В.Ф., Манзенюк И.Н., Найденова Е.В., Карань Л.С., Шарова И.Н., Щербакова С.А., Хуторецкая Н.В., Скороход М.А., Куличенко А.Н., Воробьева М.С. Платонов А.Е., Бутенко А.М. Характеристика ИФА- и ПЦР-тест-систем для детекции вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки// Вопр. вирусол. 2007. №4 С. 4347. (из перечня ВАК).
  36. Билько Е.А., Щербакова С.А., Красовская Т.Ю., Кутырев И.В., Шарова И.Н., Найденова Е.В. Разультаты лабораторных исследований по выявлению антигенов арбовирусов из полевого материала, собранного в Александрово-Гайском районе в 2006-2007 гг. // Матер. VIII Мегос. Науч.-практ. конф. государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» – Саратов, 2007. – С. 20–22.
  37. Матросов А.Н., Чекашов В.Н., Красовская Т.Ю., Кутырев И.В., Щербакова С.А., Билько Е.А., Шарова И.Н., Найденова Е.В., Осина Н.А., Плотникова Е.А., Ивашенцева Л.Н., Шилов М.М., Яковлев С.А., Князева Т.В., Удовиков А.И., Тарасов М.А., Кузнецов А.А., Мокроусова Т.В., Попов Н.В., Топорков А.В., Кутырев В.В. Результаты эпизоотологического мониторинга по зоонозам в южной части Саратовского Заволжья // Матер. VIII Мегос. Науч.-практ. конф. государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» – Саратов, 2007. – С. 20–22.
  38. Красовская Т.Ю., Шарова И.Н., Щербакова С.А., Яшечкин Ю.И., Хуторецкая Н.В., Ларичев В.Ф., Бутенко А.М., Куличенко А.Н. Разработка и внедрение тест-системы для лабораторной диагностики лихорадки Западного Нила методом ПЦР // ЗНиСО 2007. №6 (171). С. 4246. (из перечня ВАК).
  39. Малюкова Т.А., Головко Е.М., Костюкова Т.А., Щербакова С.А., Плотникова Е.А., Ляпин М.Н. Подготовка материала, отобранного в сопряженных очагах чумы и арбовирусных инфекций, к проведению серологического исследования. Сообщение 1. // Пробл. особо опасных инф. – 2007. Вып. 2 (94). – С. 1215.
  40. Матросов А.Н., Чекашов В.Н., Красовская Т.Ю., Шарова И.Н., Кутырев И.В., Щербакова С.А., Билько Е.А., Кузнецов А.А., Князева Т.В., Яковлев С.А., Тарасов М.А., Шилов М.М., Удовиков А.И., Толоконникова С.И., Слудский А.А., Попов Н.В., Кутырев В.В. Результаты эколого-эпизоотологического обследования в природных очагах зоонозов в Левобережье Саратовской области// Матер. II Междунар. науч. конф. «Зоологические исследования регионов России и сопредельных территорий». Н.Новгород, 2007. С. 172176.
  41. Найденова Е.В., Щербакова С.А., Билько Е.А., Красовская Т.Ю., Шарова И.Н., Водина Е.А., Логунова Т.Е., Потемина Л.П., Куличенко А.Н. Изучение уровня иммунной прослойки населения к вирусу ККГЛ // Матер. науч.-практ. конф. «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России». – Ставрополь, 2007. – Ч. II. – С. 3435.
  42. Малюкова Т.А., Ляпин М.Н., Щербакова С.А., Костюкова Т.А., Головко Е.М., Плотникова Е.А., Найденова Е.В. Способ подготовки проб серологических исследований из сопряженных очагов чумы и арбовирусных инфекций// Бюл. – 2008. - № 13 от 10.05.2008.
  43. Малюкова Т.А., Костюкова Т.А., Головко Е.М., Ляпин М.Н., Щербакова С.А., Плотникова Е.А., Найденова Е.В. Подготовка материала, отобранного в сопряженных очагах чумы и арбовирусных инфекций, к проведению серологического исследования. Сообщение 2. // Пробл. особо опасных инф. – 2008. Вып. 1 (95). – С. 4143.
  44. Кутырев В.В., Пакскина Н.Д., Щербакова С.А. Перспективы совершенствования лабораторной диагностики особо опасных инфекционных болезней// Дез. дело. 2009. №2. С. 36-37. (из перечня ВАК).
  45. Щербакова С.А, Билько Е.А., Найденова Е.В., Красовская Т.Ю., Слудский А.А., Князева Т.В., Матросов А.Н., Чекашов В.Н., Шарова И.Н., Самойлова Л.В., Кутырев В.В. Выявление антигенов арбовирусов в комарах и клещах, обитающих на территории Саратовской области// Мед. паразитол. и паразитарн. бол. 2009. №2. С. 3841. (из перечня ВАК).
  46. Онищенко Г.Г., Кузькин Б.П., Кутырев В.В., Щербакова С.А., Пакскина Н.Д., Топорков А.В. Актуальные направления совершенствования лабораторной диагностики особо опасных инфекционных болезней // Пробл. особо опасных инф. 2009. Вып. 1 (99). С. 510. (из перечня ВАК).
  47. Кузнецов А.А., Матросов А.Н., Осипов В.П., Князева Т.В., Поршаков А.М., Попов Н.В., Куклев Е.В., Щербакова С.А., Топорков В.П. Принципы организации эпизоотологического мониторинга сочетанных природных очагов чумы  и других опасных инфекционных болезней в регионе Нижнего Поволжья // Пробл. особо опасных инф. 2009. Вып. 4 (102). С.17-20. (из перечня ВАК).
  48. Турцева М.А., Кресова У.А., Матросов А.Н., Поршаков А.М., Яковлев С.А., Шарова И.Н., Красовская Т.Ю., Кузнецов А.А., Князева Т.В., Мокроусова Т.В., Щербакова С.А., Котоманова В.Г., Сантылова О.А. Новые данные о распространении иксодовых клещей и переносимых ими возбудителей природно-очаговых инфекций в Саратовской области // Пробл. особо опасных инф. 2009. Вып. 4 (102). С. 4044. (из перечня ВАК).
  49. Щербакова С.А., Шарова И.Н., Казакова Е.С., Кутырев В.В. Стандарты лабораторной диагностики, как основа модернизации единой системы мониторинга и диагностики инфекционных болезней // Матер. X науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ». – Ставрополь, 2010. – С. 126127.
  50. Попов Н.В., Куклев Е.В., Топорков В.П., Адамов А.К., Щербакова С.А., Малецкая О.В., Ковтунов А.И., Яшкулов К.Б., Кабин В.В., Подсвиров А.В. и Кологоров А.И.,  Кузнецов А.А., матросов А.Н., Князева Т.В.,  Григорьев М.П., Санджиев В.Б.-Х., Осипов В.П., Пискунова Н.В., Сангаджиева Г.В. Сочетанные природные очаги бактериальных, риккетсиозных и вирусных инфекционных болезней в регионе Северо-Западного Прикаспия // Пробл. особо опасных инф. 2010. Вып. 1 (103) С. 4447. (из перечня ВАК).
  51. Щербакова С.А., Найденова Е.В., Билько Е.А., Водина Е.А., Логунова Т.Е., Потемина Л.П., Кутырев В.В. Выявление специфических антител к арбовирусам в сыворотках крови людей, проживающих на территории Саратовской области // Пробл. особо опасных инф. 2011. Вып. 2 (108) С. 7275. (из перечня ВАК).
  52. Красовская Т.Ю., Щербакова С.А., Шарова И.Н., Найденова Е.В., Билько Е.А., Чекашов В.Н., Матросов А.Н., Яковлев С.А., Поршаков А.М., Шилов М.М., Рябова А.В., Князева Т.В., Мокроусова Т.В., Федорова З.П., Кресова У.А., Талаева Е.А., Миронова Н.И., Кутырев В.В. Изучение циркуляции вируса Западного Нила на территории Саратовской области в 2010 г.// Пробл. особо опасных инф. 2011. Вып. 3 (109) С. 1317. (из перечня ВАК).





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.