WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

БУРЫЛЕВ

Виталий Владимирович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ  ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ У ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

14.01.21 -  Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт Петербург

2012

Работа выполнена в ФГБУ “Российский научно-исследовательский институт

гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического

агентства России”

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Бессмельцев Станислав Семенович

доктор медицинских наук, профессор Чеботкевич Виталий Николаевич

Официальные оппоненты:

Климко Николай Николаевич доктор медицинских наук, профессор

ГБОУ ВПО Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И.Мечникова Росздрава России, заведующий кафедрой клинической микологии, аллергологии и иммунологии

Минеева Наталья Витальевна доктор биологических наук, профессор

ФГБУ “РосНИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА России”, руководитель лаборатории изосерологии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится “_____” ______________ 2012г. в ______часов

на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России» по адресу:

191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-ая Советская, д.16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ

гематологии и трансфузиологии

Автореферат разослан “_____” _____________ 2012 г.

Ученый секретарь специализированного совета РосНИИГТ

доктор медицинских наук

  Т.В. Глазанова

 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы в лечении опухолевых заболеваний системы крови, борьба за продление жизни пациентов сохраняет свою актуальность до настоящего времени. Одной из ведущих причин гибели больных продолжают оставаться инфекционные осложнения. Число возможных этиологических агентов этих осложнений достаточно велико - бактерии, грибы и вирусы. Подверженность больных смешанным инфекциями обусловлена нарушениями в клеточном и гуморальном звеньях иммунитета, расширением входных ворот, вследствие повреждения кожи, слизистых оболочек, длительной катетеризацией центральных вен, активизацией эндогенной инфекции. Особенно часто такие осложнения наблюдаются у больных при проведении им высокодозовой химиотерапии или после осуществления больному трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, когда организм ослаблен как за счет опухолевого заболевания, так и за счет использования агрессивных программ терапии и иммуносупрессивной терапии (Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М., 2004).

У онкогематологических больных и реципиентов гемопоэтических стволовых клеток тяжелые инфекционные осложнения выявлены у 42% умерших (Голенков А.К., Луцкая Т.Д. и др. 2012). Риск возникновения тяжелых бактериальных, грибковых, вирусных инфекций существенно повышается при развитии гранулоцитопении. Особенно высок риск развития инфекционных осложнений при уровне гранулоцитов менее 0,1109/л. (Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М., 2004). В целом частота инфекционных осложнений при гемобластозах достигает 60-70%, при этом цитомегаловирусная (ЦМВ) инфекция встречается у 22–45% больных, ассоциированные инфекции – у 20–30%. Разработка эффективных методов терапии позволила добиться значительных успехов в лечении бактериальных и грибковых инфекций. Благодаря своевременному и грамотному применению антибактериальных препаратов, летальность больных гемобластозами с глубокой нейтропенией от инфекционных осложнений снизилась с 50% до 10% (Schimpff  S.C., 1997).

Определенные результаты достигнуты в лечении вирусных инфекций. Внедрение мониторинга ЦМВ-виремии и превентивной терапии ЦМВ-инфекции привело к значительному снижению встречаемости ЦМВ болезни у иммунокомпрометированных пациентов (Балашов Д.Н., Шелихова Л.Н. и др. 2010; Ширяев С.Н., Боровкова А.С. и др., 2012; Ljungman P., 1997).

Тем не менее, вирусные инфекции, остаются актуальной проблемой для больных  с иммуносупрессиями. Наиболее изученным из группы герпесвирусов является цитомегаловирус. Мало исследованы респираторные вирусы, хотя они играют большую роль в развитии инфекций у онкогематологических больных (Чеботкевич В.Н., Румель Н.Р., Абдулкадыров К.М.,  2001; Whimbey E, Champlin RE, Couch RB. et al., 1996). Высокая частота вирусных инфекций наблюдается у больных лейкозами, особенно при использовании современных методов высокодозовой химиотерапии (Йовдий А.В., Шардаков В.И. и др., 2012). Течение вирусных, в частности герпетических инфекций, у данных групп больных, как правило, тяжелое и при отсутствии своевременной диагностики и терапии может угрожать жизни пациентов (Исаков В.А., Исаков Д.В., 2012).

Не меньшую проблему представляет инфекционный контроль донорской крови т.к. гемотрансфузионная терапия широко используются для лечения онкогематологических больных. Современные методы контроля донорской крови позволили до минимума снизить риск гемотрансфузионных инфекций. Этого удалось добиться совершенствованием отбора доноров, широким набором тестов скрининга крови на основные инфекционные агенты и внедрением эффективных методов инактивации патогенов в гемокомпонентах (Колотвин В.В., 2012; Кузнецов О.Е., Матвеев А.В. и др.,  2012; Селиванов Е.А., Чечеткин А.В. и др., 2012). Значительно сложнее обеспечить инфекционную безопасность гемотрансфузий у иммуносупрессивных больных,  для которых инфекционные агенты представляют смертельную опасность. К ним в первую очередь относятся вирусы группы герпеса.

Для диагностики вирусных инфекций у больных чаще всего используют молекулярно-биологические методы, в частности ПЦР. При необходимости обследования большого количества образцов при скрининге донорской крови на вирусы гепатита и ВИЧ разрабатываются методы ПЦР мультиплексного анализа в формате минипулов (Горская О.А., Попова М.В. и др., 2012). Разработаны методы ПЦР в реальном времени в мультиплексном формате и для выявления герпесвирусов среди доноров крови (Кузнецов О.Е., Матвеев А.В. и др., 2012). Однако предлагаемый в настоящее время спектр наборов для определения вирусов группы герпеса не полон и не позволяет проводить одновременную детекцию всех типов вирусов этой группы. Дальнейшее совершенствование методов диагностики возможно при использовании нанотехнологических методов, в частности биочипов. Анализ с использованием биологических биочипов - один из новейших и наиболее быстро развивающихся методов современной биологии и медицины. Эффективность применения биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения большого числа специфических взаимодействий молекул биополимеров. При этом удается в достаточно простых экспериментах собрать и обработать на отдельных элементах биочипа огромное количество биологической информации (Мирзабеков А.Д., 2002, 2003), что особенно важно при необходимости проведения массовых исследований, в частности, при скрининге донорской крови и необходимости индикации большого количества инфекционных агентов в биоматериалах.

Таким образом, разработка новых методов диагностики инфекционных осложнений у онкогематологических больных с использованием биологических биочипов является актуальной проблемой в современной гематологии и вирусологии. Аналогичная работа до настоящего времени не проводилась, что и послужили основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования.

Определение частоты и значимости вирусных инфекций у онкогематологических больных и маркеров герпесвирусов у доноров крови и совершенствование  диагностики герпесвирусных инфекций путем использования олигонуклеотидных биочипов.

Задачи исследования:

  1. Выявить частоту респираторных и герпесвирусных инфекций у онкогематологических больных.
  2. Установить частоту выявления маркеров герпесвирусных инфекций у доноров крови.
  3. Определить диагностическую ценность методов иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) при выявлении герпесвирусов у больных и доноров крови.
  4. Разработать олигонуклеотидный биочип для выявления герпесвирусов человека и определить возможность его использования для индикации вирусов в биологическом материале.

Научная новизна исследования.

Впервые в России проведен мониторинг на расширенный спектр инфекционных агентов, включающий 15 возбудителей респираторных инфекций и вирусов группы герпеса. Установлен высокий удельный вес респираторных вирусов в структуре инфекционных осложнений у больных различными формами гемобластозов (до 62%).

       Показано, что развитие острой пневмонии у онкогематологических больных в 42% случаев происходит на фоне активации вирусов группы герпеса, из которых наибольшую роль играет вирус Эпштейна-Барр.

Проведено изучение молекулярно-биологических (в ПЦР) маркеров герпесвирусных инфекций у доноров крови. Установлено, что чаще у доноров выявлялись маркеры активной ВЭБ инфекции (4,6%), реже других герпесвирусов (ЦМВ - 0 %, ВПГ1/2- 0,2% и ВГЧ6 -1,75%).

Разработан биочип для определения вирусов группы герпеса в биологическом материале (крови, ликворе, моче и др.).

Впервые показана возможность использования биочипа для эффективной идентификации различных герпесвирусов у онкогематологических больных.

Практическая значимость

На основании полученных данных о распространенности респираторных вирусных инфекций у онкогематологических больных представлено обоснование для проведения исследований  на маркеры этих вирусов с помощью ПЦР в реальном времени.

Использование этих исследований в комплексе с общепринятыми бактериологическими и микологическими исследованиями позволит проводить раннюю этиотропную терапию инфекционных осложнений у больных.

Разработан и апробирован олигонуклеотидный биочип для выявления герпесвирусов человека и доказана возможность его использования для индикации вирусов биологическом материале (в крови, ликворе, слюне, мазки из зева и носа, моче и др.).

Определена частота выявления серологических (ИФА) и молекулярно-биологических (ПЦР) маркеров ЦМВ герпесвирусных инфекций у доноров крови, показана возможность и целесообразность выделения группы серонегативных доноров. Из-за вероятности сероконверсии эти лица требуют периодического контроля.

Основные положения выносимые на защиту

  1. У онкогематологических больных респираторные вирусы выявляются чаще при инфекционных осложнениях, чем без них.
  2. Оптимальным методом лабораторной диагностики вирусных инфекций у больных при имуносупрессии является ПЦР в реальном времени, позволяющий выявлять геномы возбудителей в любом биологическом материале.
  3. Разработанный олигонуклеотидный биочип является высокочувствительным и специфичным, позволяет проводить определение восьми видов герпесвирусов человека и выявляет их как в контрольных образцах, накопленных на культивируемых клетках человека, так и в клинических образцах от пациентов.

Апробация работы. Результаты работы представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные осложнения при иммунодепрессиях» 11-12 февраля 2010, СПб; в материалах VII Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2010» 24-26 ноября 2010, Москва; на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» 24-25 марта 2011 года, СПб; на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения заболеваний системы крови» 16-17 ноября 2011 года, СПб; в материалах Всероссийской научно-практической конференции «Инфекции и инфекционная безопасность в гематологии и службе крови», посвященной 70-летию лаборатории бактериологии Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии 22-23 марта 2012 года СПб; на конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», посвященной 80-летию Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии  24-25 октября 2012 года СПб.

Внедрение результатов исследований в практику. Результаты диссертационной работы используются в Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии, в учебном процессе на кафедре трансфузиологии и кафедре клинической лабораторной диагностики Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, кафедре микробиологии ИМО Новгородского государственного университета им. Ярослава Мудрого. При проведении данной работы нами была предложена подложка для биочипа на основе халькогенидных стекол. Получен Патент на полезную модель № 121081 (заявка № 2012109347, приоритет полезной модели от 12 марта 2012 года).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 3  в изданиях, поименованных перечнем ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 138 источников (49 отечественных и 89 иностранных). Диссертация иллюстрирована 11 рисунками и 12 таблицами.

Личный вклад автора. Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора. Автором лично выполнено молекулярно-биологическое выявление герпесвирусов методом полимеразной цепной реакции, включая выделение ДНК, проведение амплификации и индикация продуктов у всех обследованных больных и доноров. Проведен клинико-лабораторный анализ, статистическая обработка, анализ полученных данных и обобщение результатов исследования.

  СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика обследованных контингентов

Обследовали 487 больных в возрасте от 18 лет до 81 года (женщин - 235, мужчин - 252) с различными формами гемобластозов и депрессий кроветворения, находившихся на лечении в Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии (табл.1)

  Таблица 1

Характеристика обследованных больных

Клинический диагноз

MM

ОЛ

ХЛ

МДС

НХЛ

Апластическая анемия

ОЛЛ

ОМЛ

ХЛЛ

ХМЛ

65

156

72

14

50

105

25

Примечание: см. список сокращений.

  Диагноз у всех наблюдаемых больных подтверждался данными исследования периферической крови, пунктата костного мозга, трепанобиоптата подвздошной кости, изучением цитогенетических, молекулярно-биологических и иммунологических показателей крови и костного мозга, результатами рентгенологического исследования органов грудной клетки и костей скелета, ультразвукового исследования органов брюшной полости и забрюшинного пространства. Диагностический процесс при Неходжкинских лимфомах (НХЛ) включал в себя также иммуногистохимическое исследование опухолевой ткани лимфатического узла и компьютерную томографию органов брюшной полости и грудной клетки.

Серологические (в ИФА) и молекулярно-биологические (в ПЦР) маркеры вирусов группы герпеса исследовали у  456 здоровых доноров крови донорского отдела Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

  1. Лабораторные методы

Биологические материалы

  В качестве материала для исследования  использовались следующие клинические материалы: венозная кровь, мазки из зева и носа, ликвор, мокрота, моча.

Штаммы вирусов, использованных в работе.

Вирус простого герпеса 1-го типа, штамм ЕС, получен из коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, титрование вируса осуществляли на культуре клеток Vero и  выражали в тканевых цитопатических единицах  (ТЦПД /50).

Цитомегаловирус, штамм AD 169 получен  из Американской коллекции тканевых культур (АТСС). Титрование вируса осуществляли на культуре диплоидных клеток эмбриона человека (FLECH 385)  и  выражали в тканевых цитопатических единицах  (ТЦПД  /50)

Культуры клеток

Линия клеток NC-37 – лимфобласты периферической крови внешне здорового донора, имеющие в каждой клетке в среднем 60 копий генома ВЭБ;

Линия клеток Vero – клетки почки зеленой мартышки;

Линия клеток  FLECH 385- клетки фибробластов легких эмбриона человека.

Клеточные культуры представлены лабораторией тканевых культур  ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития РФ.

Методы исследования

      Инфекционные осложнения диагностировали на основании клинических и лабораторных данных. В период глубокой нейтропении 4 степени  инфекционные осложнения клинически диагностировали на основании однократного повышения температуры тела более 38,5°С или повторное повышение более 38,0°С в течение 24 часов, не объяснимых течением основного заболевания и проводимой терапией. 

  Бактериологическое исследование клинического материала

проводили в соответствии с нормативной документацией (Приказ МЗ СССР № 535 от 22 апреля 1985 г.  «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений»).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Для обнаружения геномов возбудителей респираторных инфекций использовали разработанные в  ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора наборы реагентов на основе  ПЦР в мультипраймерном формате с детекцией в режиме реального времени: респираторно-синцитиального (РС) вируса, четырех типов вируса парагриппа (ПГ), риновирусов, коронавирусов (ОС43, 229Е, NL63, HKU1), метапневмовируса, аденовирусов и бокавируса человека. Кроме того применяли коммерческие наборы реагентов «АмплиСенс» для выявления вирусов гриппа А и В, A/H1N1 свиной, Chlamydophila pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae.

Определение ДНК герпесвирусов в клинических образцах проводили с помощью коммерческих наборов реагентов производства ООО «ИнтерЛабСервис»:  «ДНК-сорб-Б» , «АмплиСенс-СМV», «АмплиСенс- ЕBV», «АмплиСенс НSV I,II», и «АмплиСенс ННV 6»  согласно инструкциям фирмы производителя.

Иммуноферментный анализ. Для иммуноферментного анализа использовали тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Определение IgM и  IgG-ЦМВ  проводили с помощью  наборов “ВектоЦМВ-IgM” и “ЦМВ-IgG-ИФА-Бест”. Выявляли также IgM и IgG антитела к предраннему белку ЦМВ с использованием набора “ВектоЦМВ- IEA-антитела”.

Характеристика антител к ВЭБ  и включала в себя качественное определение IgM и IgG антител к  капсидному антигену VCA и IgG антител к  раннему антигену EA (тест системы ВектоВЭБ-VCA-IgM ,  ВектоВЭБ-VCA-IgG и ВектоВЭБ-EA-IgG). 

Исследования проводили согласно инструкции производителя.

Методы, использованные при разработке олигонуклеотидного биочипа

Выделение ДНК. ДНК выделяли методом фенольной экстракции по стандартной методике (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д.., 1984). Измерение концентрации ДНК проводили на спектрофотометре NanoDrop (“NanoDrop Technologies”, США).

Полимеразная цепная реакция. Реакцию проводили в 30 мкл реакционной смеси (5 ед. Taq-полимеразы в 1 Taq-буфере, 4 мМ MgCl2, 250 мкM дНТФ, 0,4 мкМ прямого и обратного праймеров, 2 мкл ДНК) в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: 94°С — 5 мин; 42 цикла: 94°С — 20 сек, 57,5°С — 20 сек, 72°С — 20 сек; 72°С — 7 мин. ПЦР для выявления -актина человека проводили в тех же условиях по программе: 94°С — 5 мин; 28 циклов: 94°С — 1 мин, 59°С — 1 мин, 72°С — 1 мин; 72°С — 7 мин.

Электрофорез ДНК. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов проводили в 1 % агарозном геле с использованием 1 трис-боратного буфера в камере Mini-Sub Cell GT (“Bio-Rad”, США). Гели документировали с помощью системы Kodak Image Station (США).

Печать биочипа. Олигонуклеотидные зонды (300 нг/мкл в 3 SSC-буфере) иммобилизовали на альдегидные слайды Vantage Aldehyde Slides методом контактной печати с использованием иглы 946MP4 на споттере SpotBot® 3 Protein Edition (“ArrayIt”, США) в условиях 55 % влажности при температуре +18 °С. Схема расположения спотов на подложке - рис.1.

Рисунок 1. Биочип для выявления ВГЧ. А — общая схема биочипа, состоящего из 16 идентичных массивов. Б — схема расположения точек в массиве. ОК — отрицательный контроль, ПК — положительный контроль.

По окончании печати слайды оставляли на ночь в споттере при комнатной температуре, после чего облучали ультрафиолетом при 254 нм (0,09 Дж/см2). Проверку качества печати проводили методом рассеивающего сканирования при длине волны 633 нм на флуоресцентном сканере ScanArrayExpress (“PerkinElmer”, США). Слайды хранили при температуре +4 °С.

Подготовка флуоресцентно меченых кДНК и проведение гибридизации с биочипом. Флуоресцентное мечение кДНК проводили в процессе ПЦР, как описано выше, за исключением того, что в реакционную смесь вместо 250 мкM смеси дНТФ добавляли по 250 мкМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, 100 мкМ дЦТФ и 17 мкМ Cy5-дЦТФ. Получаемые Cy5-кДНК проверяли путем электрофоретического разделения в 1 % агарозном геле с последующей регистрацией флуоресценции с помощью фотосистемы Kodak Image Station при длине волны 670 нм. Далее к Cy5-кДНК добавляли 5 мкл 1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА), 7,5 мкл 20 SSC-буфера, 5 мкл 1 % додецилсульфата натрия (SDS), 10 мкл 99 % формамида, доводили объем до 50 мкл dH2O и инкубировали в твердотельном термостате при 99°С 2 мин, затем охлаждали во льду 2 мин. Параллельно денатурировали олигонуклеотиды на биочипе путем кипячения слайда в dH2O 1 мин, затем слайд инкубировали в 96 % этаноле (с –20  С) 1 мин и высушивали центрифугированием при 300 g 2 мин. Гибридизацию с биочипом проводили с использованием рамок производства “Whatman” (США) в течение 2 часов при 37 °C с перемешиванием при 250 об/мин в термошейкере Biosan PST-60 HL plus (“BioSan”, Латвия). После гибридизации слайды отмывали в 3 SSC-буфере 2 мин и 1 SSC-буфере 2 мин. Затем рамку снимали, слайд отмывали в dH2O 2 мин и высушивали центрифугированием.

Компьютерная обработка полученных результатов. Сканирование биочипов проводили на сканере ScanArray Express с разрешением 5 мкм при значении PMT равном 90, длине волны возбуждения 650 нм и длине волны регистрации 670 нм. Обработку получаемых изображений проводили с использованием программного обеспечения ScanArray (“PerkinElmer”, США).

Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной статистики, анализ таблиц сопряженности (критерий хи-квадрат Пирсона) и корреляционного анализа (коэффициент корреляции Спирмена). Результаты считались достоверными при р<0,05. Обработка данных проводилась с использованием программы STATISTICA 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Этиологические и клинические особенности герпесвирусных и  респираторных инфекционных осложнений  при гемобластозах

Исследование маркеров герпесвирусных инфекций у больных  гематологического стационара и доноров  крови

Для изучения удельного веса герпесвирусов в структуре вирусных инфекционных осложнений было проведено  обследование больных, госпитализированных в гематологическую клинику института с различными формами гемобластозов и депрессиями кроветворения. Частота выявления молекулярных маркеров герпесвирусов в крови представлена в таблице 2.

Таблица 2.

Частота выявления геномов герпесвирусов у онкогематологических больных

Клинический диагноз

Выявленный геном, абс  (%)

ЦМВ

ВПГ 1/2

ВГЧ-6

ВЭБ

MM
n = 56

2 (3,6%)

0 (0%)

1 (1,7%)

5 (8,9%)

ОЛ

(ОЛЛ, ОМЛ)
n = 148

7 (4,7%)

5 (3,4%)

22 (14,9%)

36 (24,3%)

ХЛ

ХЛЛ, n = 53

ХМЛ, n = 11

Итого:

3 (5,7%)

1 (9,0%)

4 (6,2%)

1 (1,8%)

0 (0%)

1(1,6%)

9 (17,0%)

0 (0%)

9 (14,0%)

5 (9,4%)

6 (54,5%)

11 (17,2%)

МДС
n = 50

2 (4,0%)

0 (0%)

5 (10,0%)

10 (24,0%)

НХЛ
n = 94

5 (5,3%)

6 (6,4%)

9 (9,5%)

40 (42,5%)

Апластическая анемия
n = 25

1 (4,0%)

1 (4,0%)

2 (8,0%)

5 (20%)

Всего: 437

21 (4,8%)

13 (3,0%)

48 (11%)

109 (24,9%)

Всего было обследовано 437 больных. В целом наиболее часто в крови выявляли геном ВЭБ (24,9%), причем чаще всего при хронических лейкозах (ХЛ) и множественной миеломе (ММ). Реже обнаруживали ВГЧ-6 (11,0%). Геном ЦМВ и ВПГ выявлен в 4,8 и 3,0% соответственно. Из исследованных форм гемобластозов ЦМВ инфекция достоверно чаще наблюдалась у больных хроническим лейкозом.

Далее было проведено сравнительное исследование частоты выявления молекулярных маркеров герпесвирусных инфекций у онкогематологических больных и доноров крови. На репрезентативных группах, включавших 893 обследованных, показана более высокая частота обнаружения всех четырех исследованных герпес вирусов у больных гемобластозами (табл. 3).

Таблица 3.

Частота выявления геномов герпесвирусов в крови у онкогематологических больных и доноров крови.

Группа обследованных

Выявленный геном, абс. %

ЦМВ

ВПГ

ВГЧ-6

ВЭБ

Онкогематологические больные
n = 437

21 (4.8%)

13 (3%)

48 (11%)

109 (24,9%)

Доноры крови
n = 456

0 (0%)

1 (1,2%)

8 (1,75%)

17 (3,7%)

p

<0,05

<0,05

<0,05

<0,05

Геном ЦМВ не был обнаружен ни у одного донора, в то время как он был выявлен у 4,8% онкогематологических больных. Вирус герпеса простого был выявлен  у одного донора и у 13 больных.  Несколько чаще в крови доноров выявляли ВГЧ 6 и ВЭБ, однако частота обнаружения этих вирусов была достоверно выше у больных. Эти результаты, указывают на значительную распространенность герпесвирусов у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения. Следует отметить, что число возможных возбудителей инфекционного процесса  достаточно велико. Это бактерии, грибы, микоплазмы и вирусы. Установление этиологии инфекционного процесса играет первостепенную роль для их  своевременной и целенаправленной терапии. В большинстве работ рассматривается роль только определенных групп возбудителей - бактерий, грибов или вирусов - без учета их возможной роли в развитии ассоциированных инфекций. В нашей работе при обследовании больных был использован комплекс диагностических тестов на основе ПЦР в реальном времени, позволяющий обнаруживать основные возбудители респираторных инфекций, известных в настоящее время. Было выделено 2 группы пациентов с различными формами гемобластозов. Первую группу составили больные, у которых диагностированы инфекционные осложнения (n=50). Во 2 группу вошли больные, у которых не были клинически выявлены инфекционные осложнения (группа сравнения) (n=35). Применение ПЦР в совокупности с культуральными бактериологическими и микологическими методами позволило установить этиологию инфекционных осложнений у 62% больных с клинически диагностированными инфекционными осложнениями (табл. 4)  и только у 22,8% – в группе сравнения. В 42% случаев респираторные инфекции протекали на фоне выявления геномов герпесвирусов в крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полученные данные дают нам основание предположить, что герпесвирусные инфекции значительно повышают риск развития респираторных инфекционных осложнений и указывают на необходимость тщательного мониторинга респираторных и герпесвирусных инфекций у онкогематологических больных.

Таблица 4

Частота выявления геномов  возбудителей  респираторных инфекций у онкогематологических больных с различными инфекционными осложнениями

Геном, выявленный методом ПЦР

Клинический диагноз

ММ

(n=9)

ОЛ

ХЛ

НХЛ

(n=11)

ОЛЛ

(n=2)

ОМЛ

(n=6)

ХЛЛ

(n=19)

ХМЛ

(n=3)

РС-вирус

0

0

1

1

0

0

Грипп А

2

0

0

0

0

2

Грипп В

0

0

0

0

0

0

ГриппА/H1N1Sw

0

0

0

1

1

1

ПГ-1

0

0

0

0

0

0

ПГ-2

0

0

0

0

0

1

ПГ-3

1

0

1

0

0

1

ПГ-4

0

0

0

0

0

0

Риновирусы

2

1

0

6

0

2

Аденовирусы

0

0

0

0

0

0

Коронавирусы

1

0

0

2

0

0

Метапневмовирус

0

0

0

1

0

0

Бокавирус

0

0

0

0

0

1

Chlamydophila pneumoniae

0

0

0

0

0

0

Mycoplasma pneumoniae

0

1

0

1

0

0

Полученные результаты указывают, что у больных гемобластозами, помимо бактериальных, часто выявляются респираторные вирусные и микоплазменные инфекции. Это свидетельствует о необходимости проводить больным гемобластозами более углубленные исследования по определению возбудителей риска возникновения инфекционных осложнений. Такие исследования будут способствовать раннему назначению адекватной терапии. Зачастую вирусные инфекции трудно диагностировать клинически, что указывает на необходимость тщательного мониторинга этих больных. При определении практической значимости выявления того или иного инфекционного возбудителя необходима комплексная клинико-лабораторная оценка. Методом выбора для уточнения этиологии конкретного случая инфекционного осложнения является мультиплексная ПЦР в реальном времени.

Наряду с обследованием больных важной задачей нашего исследования было изучение распространенности герпесвирусных инфекций у доноров крови. Гемотрансфузионная терапия широко используются для лечения онкогематологических больных и других пациентов с иммуносупрессиями.  Для этой категории пациентов опасность представляют возбудители, безвредные в большинстве случаев для иммунокомпетентных реципиентов. К таким возбудителям в первую очередь относятся вирусы группы герпеса. Современные методы контроля донорской крови позволили до минимума снизить риск гемотрансфузионных инфекций. В тоже время тестирование доноров на ЦМВ и другие герпес вирусы существующими в России нормативными документами не предусмотрено. Уже при планировании исследований по изучению распространенности герпес вирусов у доноров мы предполагали, что частота выявления их молекулярных маркеров в крови  будет ниже, чем у онкогематологических больных. В процессе проведения работы это предположение подтвердилось (см. табл. 3).  Поэтому при  обследовании доноров, для более полного представления о распространенности герпес вирусных инфекций, было решено исследовать молекулярные маркеры как в крови, так и в мазках из зева, а также изучить распространенность серологических маркеров ЦМВ и ВЭБ.  Результаты определения геномов герпесвирусов в крови и мазках  из зева представлены в таблице 5. 

Таблица 5.

Частота выявления геномов герпесвирусов в крови и мазках из зева у доноров

Материал

Выявленный геном, абс. (%)

ЦМВ

ВГП 1/2

ВГЧ-6

ВЭБ

Кровь
n = 456

0 (0%)

1 (0,2%)

8 (1,75%)

20 (4,6%)

Мазки из зева

0 (0%)
n = 349

11 (3.1%)
n = 349

19 (5.4%)
n = 349

54 (39.7%)
n = 130

p

p<0,05

p<0,05

p<0,05

Установлено, что ДНК ЦМВ не была выявлена ни в одном случае. Геномы ВПГ, ВГЧ 6 и ВЭБ были обнаружены как в крови, так и в мазках из зева. Причем в зеве все указанные инфекционные агенты встречались достоверно чаще, чем в крови.

       Изучение серологических маркеров ЦМВ и ВЭБ проведено у 147 доноров. Серостатус доноров оценивали по наличию или отсутствию  IgG к ЦМВ и ВЭБ в сыворотке крови. Установлено, что ЦМВ серонегативными (т.е. без IgG антител к ЦМВ) в группе доноров РосНИИ гематологии и трансфузиологии являются 13,6%.  Серонегативность в отношении ВЭБ была выявлена только у одного донора (0,7%). Полученные результаты иллюстрирует рисунок 2 а и б. 

  а б

Рис. 2 — Серостатус доноров в отношении ЦМВ(а)  и  ВЭБ (б).

Из группы герпесвирусов наиболее серьезной проблемой является ЦМВ инфекция. Это распространенный инфекционный агент, который может передаваться при переливании гемокомпонентов. По данным наших исследований  серопозитивными являются 86,4% обследованных  доноров  хотя геном ЦМВ с помощью ПЦР ни разу не был обнаружен в крови.

В нашей стране обследование на ЦМВ инфекцию доноров не предусматривается. Вместе с тем известно, что при переливании крови от серопозитивных доноров заражается от 15 до 40% детей и 2-3%  взрослых  (Степанова Е.В. 2009).

В тоже время  использование «ЦМВ безопасной» серонегативной крови является стандартным методом обеспечения гемокомпонентами пациентов, входящих в группу риска развития ЦМВ болезни, в большинстве развитых стран с начала 90-х годов прошлого столетия (Miller W.J., et al.,1991).

Профилактика гемотрансфузионной ЦМВ инфекции, представляет собой комплексную задачу. Ввиду того, что «ЦМВ безопасные» гемокомпоненты жизненно необходимы только для ограниченных групп пациентов представляется целесообразным и возможным создание реестра серонегативных доноров. Из-за вероятности сероконверсии эти лица требуют периодического контроля. Необходимо информировать донора о важности использования его крови  для  лечения тяжелых иммуносупрессивных больных.

Важной задачей нашего исследования  явилось создание олигонуклеотидного биочипа для индикации геномов вирусов группы герпесов. В основной части работы для диагностики герпесвирусных инфекций у больных и изучения распространенности маркеров герпес вирусов у доноров была использована ПЦР. В целом она удовлетворяет запросы практики и научных исследований.  Используемая в настоящее  время ПЦР  в реальном  времени позволяет проводить мониторинг герпесвирусных инфекций у онкогематологических больных, что очень важно для назначения  своевременной  противовирусной терапии.

Вместе с тем в настоящее время проводятся широкие исследования по совершенствованию методов диагностики, в частности с использованием технологии биочипов. Нами был разработан биочип, который позволил проводить одновременную детекцию восьми вирусов человека: вирусов герпеса простого 1 и 2-го типов, вируса опоясывающего герпеса (ВВО-ОГ), вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), цитомегаловируса (ЦМВ) и герпесвирусов 6, 7 и 8 типов (ВГЧ 6, 7 и 8). Показано, что  с помощью разработанного  биочипа можно выявлять ДНК герпесвирусов как из образцов, полученных при  выращивании на культурах  клеток, так из биологического материала (кровь, моча, ликвор и др.) больных. Проведенное нами исследование показало, что в развитии инфекционного процесса у обследованных больных могут принимать участие, по крайней мере, несколько десятков инфекционных агентов. Поэтому применение биочиповой технологии  для установления этиологии инфекционных осложнений следует признать актуальной задачей.

Однако ее осуществление  требует разрешения ряда методических проблем. Любая  разновидность биочиповой технологии требует мечения исследуемых проб. Флуоресцентные метки имеют ряд недостатков, таких как быстрое затухание флуоресценции, сложность процесса мечения препаратов, невозможность длительного хранения меченых препаратов, необходимость наличия дорогостоящего флуоресцентного сканера.  Возможной альтернативой может являться использование белковых биочипов (Шишкин А.В. и др., 2008). В развитие этого направления нами предложена халькогенидная подложка для биочипа, позволяющая формировать заданные белковые структуры на стеклянной поверхности (Патент на полезную модель № 121081 (заявка № 2012109347, приоритет полезной модели от 12 марта 2012 года). 

Резюмируя результаты наших исследований по методам диагностики инфекционных осложнений у онкогематологических больных следует признать, что на данный момент методом выбора является  мультиплексная ПЦР в реальном времени. Методы на основе ПЦР, в частности с использованием биочипов,  остаются единственным прямым методом индикации инфекционных агентов, как в кровяном русле, так и в очаге поражения. В то же время серологические исследования с помощью ИФА играют ключевую роль в обследовании доноров для обеспечения «герпесбезопасности»  гемокомпонентной терапии.


Выводы

1. Определена частота и значимость вирусных инфекций у онкогематологических больных. Геном ВЭБ определяется в крови у 24,9% больных, причем чаще при хронических лейкозах и множественной миеломе, реже обнаруживается ВГЧ-6 (11,0%). Геномы ЦМВ и ВПГ 1/2 выявлены в 4,8% и 3,0%, соответственно.

2. В развитии инфекционных осложнений у онкогематологических больных значительную роль играют респираторные вирусы. В целом, возбудители респираторных инфекций обнаруживаются у 62% больных с различными инфекционными осложнениями и только в 22,8% – без них.

3. Респираторные инфекции в 42% случаев протекают на фоне выявления геномов герпесвирусов в крови. Эти данные дают основание утверждать, что герпесвирусные инфекции значительно повышают риск развития инфекционных осложнений и указывают на необходимость тщательного мониторинга респираторных и герпесвирусных инфекций у онкогематологических больных.

4. Разработан олигонуклеотидный биочип, специфически выявляющий 8 известных  герпесвирусов человека, который может быть успешно использован для индикации вирусов в биологическом материале.

5. На основании изучения серологических и молекулярно-биологических маркеров герпесвирусов показана необходимость и возможность выделения группы серонегативных по ЦМВ доноров для обеспечения инфекционной безопасности гемотрансфузий у иммуносупрессивных больных.

Практические рекомендации.

  1. С целью ранней диагностики инфекционных осложнений следует  включить в диагностический алгоритм обследования онкогематологических больных выявление возбудителей респираторных инфекций и вирусов группы герпеса с использованием разработанного олигонуклеотидного биочипа.
  2. Для обеспечения «ЦМВ безопасности» донорской крови, предназначенной для гемокомпонентной терапии иммунокомпрометированных пациентов, необходимо включить в комплекс обследования доноров определение серологических и молекулярных маркеров герпесвирусных инфекций.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бурылев В.В. Этиологические особенности инфекционных осложнений у онкогематологических больных / В.Н.Чеботкевич, С.С.Бессмельцев, В.В.Бурылев, Е.И.Кайтанджан, Е.Р.Шилова, Н.П.Стижак // Вестник гематологии. 2010.том VI.№ 1.С.5-7.

2. Бурылев В.В. Создание биочипа для типирования герпес-вирусов / С.А.Клотченко, В.В.Бурылев, М.А.Плотникова, В.В.Егоров, А.В.Васин, В.Н.Чеботкевич // Вестник гематологии. 2010. том VI. № 1. С.38-39

3. Бурылев В.В. Диагностика респираторных инфекций у иммуносупрессивных больных с использованием Real-Time PCR / В.Н.Чеботкевич, С.С.Бессмельцев, В.В.Бурылев, С.Б.Яцышина, А.В.Кудрявцева // Сб.трудов VII Всероссийской научно-практич.конф. «Молекулярная диагностика-2010» 24-26 ноября 2010. Москва. Том IV. С.221-223.

4. Бурылев В.В. Этиологические и клинические особенности инфекционных осложнений при гемобластозах / В.Н.Чеботкевич, С.С.Бессмельцев, В.В.Бурылев, Е.И.Кайтанджан, Е.Р.Шилова, С.Б.Яцышина, А.В.Кудрявцева // Онкогематология. 2010. № 4. С.14-19.

5. Бурылев В.В. Разработка метода определения экспрессии отдельных генов цитомегаловируса  / С.А.Клотченко, В.В.Бурылев // Вестник гематологии.  2011.  том VII, №1.  С.83.

6. Бурылев В.В. Разработка биочипа для выявления вирусов группы герпеса / С.А.Клотченко, М.А.Плотникова, К.С.Теперева, В.В.Васин // Вестник гематологии.  2011.  том VII. №1. С.85.

7. Бурылев В.В. Выявление герпесвирусов с помощью олигонуклеотидного биочипа / С.А.Клотченко, В.В.Бурылев, К.С.Теперева, М.А.Плотникова, Т.Д.Смирнова, В.В.Егоров, В.Н.Чеботкевич, А.В.Васин // Medline.ru: Российский биомедицинский журнал.Том 12.  СТ. 77. 2011. С. 924-935.

8. Бурылев В.В.  Распространенность маркеров герпесвирусной инфекции у доноров/ С.Д.Волкова, В.Н.Чеботкевич, Е.И.Кайтанджан, В.В.Бурылев, Т.А.Матвеева, М.В.Беркос, Г.Ю.Кирьянова, И.М.Царапкин // Вестник гематологии. 2011. том VII. №4. С.57.

9. Бурылёв В.В. Проблема цитомегалосвирусной инфекции в Трансфузиологии (Обзор литературы) / И.М.Царапкин, С.Д.Волкова, С.С.Бессмельцев,  В.В.Бурылев, Г.Ю.Кирьянова // Вестник службы крови России. 2011. № 4. С.42-48.

10. Бурылев В.В. Герпесвирусные инфекции и проблемы инфекционной безопасности гемотрансфузий у иммуносупрессивных больных  / В.Н.Чеботкевич, Е.И.Кайтанджан, С.Д.Волкова, Г.Ю.Кирьянова, И.М.Царапкин // Трансфузиология. 2012. № 1. т.13. С 22-41.

11. Бурылев В.В. Герпесвирусные инфекции у иммуносупрессивных больных и инфекционная безопасность гемотрансфузий / Е.И.Кайтанджан, С.Д.Волкова, В.В.Бурылев, В.Н.Чеботкевич // Вестник гематологии.2012. т.VIII.№ 1.С.4-10.

12. Бурылев В.В. Маркеры герпесвирусов среди доноров крови и проблемы инфекционной безопасности гемокомпонентной терапии  / С.Д.Волкова, В.В.Бурылев, Е.И.Кайтанджан, Г.Ю.Кирьянова, Т.А.Матвеева, В.Н.Чеботкевич. // Трансфузиология. 2012.  № 3. том 13. С.42-43.

Список сокращений:

ATCC        -Американская коллекция тканевых культур

ЕА        - ранний антиген вируса

IEA  - предранний антиген вируса

IgG        - иммуноглобулины класса G

IgM        - иммуноглобулины класса М

VCA        - вирусный капсидный антиген 

ВВО-ОГ        - вирус ветряной оспы – опоясывающего герпеса

ВГЧ-6        - вирус герпеса человека 6-го типа

ВГЧ-7        - вирус герпеса человека 7-го типа

ВГЧ-8        - вирус герпеса человека 8-го типа

ВПГ-1        - вирус простого герпеса 1-го типа

ВПГ-2        - вирус простого герпеса 2-го типа

ВЭБ        - вирус Эпштейна-Барр

ДНК        -дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА        - иммуноферментный анализ

МДС        -миелодиспластический синдром

ММ        - множественная миелома

НХЛ        - Неходжкинская лимфома

ОЛ        - острый лейкоз

ОЛЛ        - острый лимфобластный лейкоз

ОМЛ        - острый миелобластный лейкозХ

ПГ        - вирус парагриппа

ПЦР        - полимеразная цепная реакция

РНК        - рибонуклеиновая кислота

РС        - респираторно-синцитиальный вирус

ТЦПД        -тканевые цитопатические единицы

ХЛ        - хронический лейкоз

ХЛЛ        - хронический лимфолейкоз

ХМЛ        - хронический миелолейкоз

ЦМВ        - цитомегаловирус человека






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.