WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ДОЛОТИНА

Наталья Владимировна

РЕАКЦИЯ КОСТНОГО МОЗГА ПРИ

ВОЗДЕЙСТВИИ ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕРМИИ

В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.03.03 патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Томск 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении Высшего профессионального обучения «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ

Научный руководитель:        

доктор медицинских наук,

профессор                САМСОНОВА Елена Николаевна

Официальные оппоненты:        

доктор медицинских наук,

профессор                                        ЦЫРЕНДОРЖИЕВ Дондок Дамдинович

доктор медицинских наук                ПЕРШИНА Ольга Викторовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной

лимфологии Сибирского отделения РАМН

Защита диссертации состоится  ______________2012 г. в ____ на заседании  диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук  НИИ  фармакологии  СО  РАМН (634028,  г.  Томск,  пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан «____» ___________ 2011 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук                                                        Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Воздействие высокой температуры на организм млекопитающих, как и действие многих стресс-факторов, вызывает значительные изменения нейро-эндокринной и иммунной системы, метаболических и обменных процессов на молекулярном, клеточном и тканевом уровне (Алимов Н. И., 2003; Тулеутаев М. Е., 2003; Шевченко В. П. с соавт., 2003; Антонов А. Р. с соавт., 2004; Быкова Е. В. с соавт., 2004; Ефремов А. В. и соавт., 2004, 2006; Сувернев А.В. и соавт., 2009; Chen S.C., Evans S.S., 2005; Repasky E.A., Lee M., 2008).

Системе крови принадлежит существенная роль в формировании адаптивного ответа при действии на организм различных по своей природе чрезвычайных факторов (Корнилов Н.В. и соавт. 1994; Гаркави Л.Х. и соавт., 1998; Воробьев А.И., 2002; Гольдберг Е.Д. и соавт., 2003, 2007). Воздействие экстремальных факторов, приводит к формированию комплекса неспецифических изменений в системе крови (Гольдберг Е.Д. и соавт., 1999, 2007). В многочисленных исследованиях было показано, что при действии общей гипертермии на организм млекопитающих происходит усиление фагоцитарной (Лобанова Е.М., Таганович А.Д., 2005), окислительно-метаболической (Ефремов А.В. и соавт., 2006; Lee J-F. et al., 2008) адгезивной, миграционной (Burd R. et al., 1998; Wang X.Y. et al., 1998; Appenheimer M.M. et al., 2005; Chen S.C., Evans S.S., 2005) и цитокин-продуцирующей (Zhou Y. et al., 2007; Evans S.S. et al., 2008) функций иммунокомпетентных клеток крови и тканей.

Однако, анализ научной литературы показал, что до сих пор остаются слабо изученными реакции системы крови и механизм развития костномозговых кроветворных предшественников при действии гипертермии. Имеющиеся данные свидетельствуют о повышении чувствительности костномозгового кроветворения к действию высокой температуры. При экспозиции клеток in vitro при температуре от 42 до 45оС в работах Van Zant G. с соавт. (1983), O’Hara M.D. с соавт. (1990) и Wierenga P.K., Konings A.W.T. (1993) был установлен эффект подавления активности эритропоэза в большей степени, чем миелопоэза. При этом была установлена прямая зависимость выраженности супрессии костномозгового кроветворения от длительности экспозиции клеток в условиях высокой температуры (Xiong Q-B. и соавт., 1996).

Как известно, регуляция кроветворения осуществляется единой сложноорганизованной системой, включающей в себя взаимосвязанные дистантные и локальные контролирующие факторы, действующие: а) на стволовые и полипотентные клетки - фактор стволовой клетки (SCF); б) на полипотентные клетки – ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ГМ-КСФ; в) на би- и унипотентные клетки - Г-КСФ, М-КСФ, ИЛ-5, эритропоэтин, тромбопоэтин, цитокины (ИЛ-1, -2, -3, -4, -6, -7, -9, -10 и т.д.) и г)  на клетки микроокружения (стимуляция продукции ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ, ИЛ-6) – ИЛ-1, ФНО (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002; Гольдберг Е.Д. и соавт., 2003, 2007).

В литературных источниках имеются лишь единичные работы, в которых исследованы факторы регуляции костномозгового кроветворения при действии гипертермии (Franzke A., 2006; Capitano T. et al., 2008).

В связи с вышесказанным, необходимость в изучении биологических эффектов высокой температуры на клетки крови и костного мозга продиктована тем, что полученные результаты позволят понять характер мобилизации системы крови и уточнить механизмы позитивного или негативного эффекта действия общей гипертермии. На основе этих результатов появится возможность для патогенетического обоснования принципов клинического применения методов общей управляемой гипертермии  в схеме комплексного лечения больных с различными заболеваниями.

Цель исследования: изучить реакции системы крови и механизмы их развития при воздействии общей гипертермии на организм экспериментальных животных.

Задачи исследования:

1. Оценить изменения численности и клеточного состава периферической крови и костного мозга крыс Вистар на разных сроках после воздействия общей гипертермии.

2. Изучить окислительно-метаболическую функцию лейкоцитов крови и клеток костного мозга крыс на разных сроках после воздействия общей гипертермии.

3. Исследовать влияние общей гипертермии на рост гранулоцитарно-макрофагальных (КОЕ-ГМ), эритроидных (КОЕ-Э) и эритроидно-гранулоцитарно-макрофагальных (КОЕ-ЭГМ) колоний в культуре клеток костного мозга. 

4. Определить содержание регуляторных медиаторов костномозгового кроветворения (ГМ-КСФ, ИЛ-1 и эритропоэтина) в сыворотке крови крыс Вистар после воздействия общей гипертермии.

Научная новизна.

Впервые показано, что воздействие общей гипертермии приводит к лейкоцитозу в периферической крови и уменьшению количества клеток костного мозга крыс, свидетельствующее об усилении их выхода в периферическую кровь. При воздействии общей гипертермии впервые выявлено фазовое изменение активности костномозговых кроветворных предшественников: на ранних сроках наблюдения происходит активация КОЕ-ЭГМ и угнетение эритроидных и гранулоцитарно-макрофагальных предшественников с последующей их активацией.

Впервые установлены разнонаправленные изменения концентраций сывороточных гемопоэз-регулирующих медиаторов при воздействии общей гипертермии на крыс. В динамике после воздействия общей гипертермии выявлен рост концентрации ГМ-КСФ и ИЛ-1 в сыворотке крови крыс. Содержание эритропоэтина в сыворотке крови крыс на ранних сроках после воздействия общей гипертермии снижается, затем возрастает и к концу эксперимента нормализуется. Впервые установлено, что разнонаправленные изменения концентраций сывороточных гемопоэз-регулирующих медиаторов (ГМ-КСФ, ИЛ-1 и эритропоэтина) определяют фазовый характер реагирования костномозговых кроветворных предшественников при воздействии общей гипертермии на крыс.

Установлено, что воздействие общей гипертермии стимулирует окислительно-метаболическую функцию лейкоцитов крови и клеток костного мозга крыс.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Результаты исследования позволяют расширить современное представление о роли костного мозга в адаптивных и компенсаторных реакциях организма крыс при действии общей гипертермии.

Результаты исследования позволили выявить особенности реакции системы крови и их костномозговых предшественников при действии общей гипертермии на организм экспериментальных животных.

При воздействии общей гипертермии установлена зависимость изменений со стороны частично детерминированных (КОЕ-ЭГМ) и коммитированных кроветворных (КОЕ-ГМ и КОЕ-Э) предшественников от специфических регуляторных медиаторов (ГМ-КСФ и эритропоэтина).

Результаты исследования могут быть использованы для разработки теоретических принципов патогенетического обоснования клинического применения методов локальной и общей гипертермии.

Внедрение результатов исследования.

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедрах патологической физиологии и клинической патофизиологии, биологической химии и нормальной физиологии ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития РФ, а также в  Сибирском НИИ гипертермии (г. Новосибирск).

Положения, выносимые на защиту.

1. Воздействие общей гипертермии характеризуется лейкоцитозом в периферической крови и депрессией костномозгового эритро- и грануломоноцитопоэза. Восстановление клеточности костного мозга (зрелые клетки, коммитированные предшественники) связано с активацией КОЕ-ЭГМ.

2. Разнонаправленное изменение концентрации сывороточных гемопоэз-регулирующих медиаторов (ГМ-КСФ, ИЛ-1 и эритропоэтина) определяет специфический характер ответа костномозговых КОЕ-ГМ, КОЕ-Э и коммитированных предшественников в условиях воздействия общей гипертермии.

3. Воздействие общей гипертермии стимулирует окислительно-метаболическую функцию лейкоцитов крови и клеток костного мозга крыс. Гемопоэз-регулирующие медиаторы ГМ-КСФ и ИЛ-1 стимулируют, а эритропоэтин - подавляет окислительно-метаболическую функцию клеток костного мозга крыс.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна» (Новосибирск, 2010, 2011); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009, 2010, 2011); на заседании Проблемной комиссии НГМУ «Функциональные основы гомеостаза» (Новосибирск, 2011).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 13 научных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах печатного текста, содержит 9 таблиц и 26 рисунков. Работа состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материал и методы исследования», «Результаты собственных исследование», «Обсуждение результатов исследования»  и выводов. Библиографический указатель включает 228 названий (из них 115 отечественных).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 126 крысах-самцах линии Вистар массой от 220 до 250 г и в возрасте 2,5 мес, полученных из вивария ЦНИЛ Новосибирского государственного медицинского университета Минздравсоцразвития РФ. Животные содержались в условиях вивария при температуре воздуха 20-22оС при стандартном рационе и свободном доступе к воде. Все экспериментальные исследования проводились в зимний период в одно и то же время – с 9 до 12 ч.

Животных, находившихся под эфирным наркозом, выводили из эксперимента путём декапитации на 1, 3, 7, 14 и 21 сут после воздействия общей гипертермии. На каждом сроке исследования были по 18 крыс.

В контрольную группу были включены 36 крыс, которые не подвергались воздействию общей гипертермии.

Содержание и уход за животными, и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.77 № 755).

Экспериментальную модель воздействия общей гипертермии (ОГ) производили согласно методу, предложенного А.В. Ефремовым и соавт. (2001). Все животные нагревались однократно в полном соответствии с описанной методикой до стадии теплового удара (ректальная температура 43,5оС).

В качестве материала исследования использовались периферическая кровь, сыворотка крови и клетки костного мозга животных.

Методы исследования. Кровь для оценки численности и состава клеток брали из ретроорбитального синуса крыс (Лабораторные….., 1987).

Костный мозг для исследования получали из бедренной кости животного по методу Е.Д. Гольдберга и соавт. (1992). Для подсчета миелоцитограмм, костный мозг получали из грудины животного. Качественный анализ клеток крови и костного мозга проводили в мазках, окрашенных по Папенгейму. Абсолютное содержание различных типов костномозговых клеток рассчитывали традиционными методами и выражали в 106/бедро (Зубахин А.А., 1999).

Оценку окислительно-метаболической функции лейкоцитов крови и клеток костного мозга проводили с помощью хемилюминесцентного (ХЛ) метода исследования (Tono-Oka et al., 1983). ХЛ исследование проводили в спонтанном и зимозан-индуцированном режиме. Измерения интенсивности хемилюминесценции проводили на биохемилюминометре «СКИФ-0306М» (СКТБ «Наука»,  Красноярск, Россия). В качестве люминофора был использован очищенный препарат люминола (5-амино-2,3- дигидрофталазиндион-1,4) («Serva», США).

Результаты выражали в количестве импульсов на пике ХЛ-ответа (Imax) и светосумму (Isum) ХЛ в течение 30 мин регистрации.

Активность кроветворных предшественников изучали с помощью метода оценки колониеобразующих единиц. Культивирование клеток костного мозга производили в 24-х луночных планшетах. В состав культуральной среды входила базовая метилцеллюлозная среда М3434, содержащей stem-cell factor (SCF), эритропоэтин, ИЛ-3, ИЛ-6 («Stem Cell Technology», Канада). Культивирование проводили в стандартных условиях при температуре 37оС, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. Эритроидные (БОЕ-Э+КОЕ-Э) колонии подсчитывались под инвертированным микроскопом через 3 сут, гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ГМ) и эритроидно-гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ЭГМ)  – через 14 сут после культивирования.

ГМ-КСФ и ИЛ-1 в сыворотке крови животных определяли согласно инструкции соответствующих наборов GM-CSF-rat и Rat-IL-1 («IBL Intern. GmbH», Германия). Эритропоэтин (ЭПО) в сыворотке крови животных определяли согласно инструкции набора фирмы «Stem Cell  Technologies» (Канада). Все измерения проводили с помощью автоматического вертикального фотометра «Multiscan MCC 340» при длине волны 450 нм, устанавливая нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Количественное содержание регуляторных медиаторов в сыворотке крови выражали в пкг/мл.

Методы статистической обработки. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью лицензионных пакетов прикладных программ «Statistica 5.0» и «Microsoft Ecxel 7.0». При этом определяли средние арифметические величины (М), стандартную ошибку средней величины (m). Проводили проверку данных по характеру распределения с помощью программы  «Statistica 5.0». Оценку вероятности достоверности различий двух сравниваемых средних арифметических величин производили по t-критерию Стъюдента, а также проводили корреляционный анализ между исследуемыми показателями по Пирсону. Различия сравниваемых показателей считались достоверными при p<0,05 (Реброва О.Ю., 2003).

Личный вклад автора. Диссертация, материал исследования получен, проанализирован и написан лично автором.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Система крови принимает активное участие в формировании адаптивного ответа при действии на организм млекопитающих различных по своей природе чрезвычайных факторов (Воробьев А.И., 2002), в том числе гипертермии (Сувернев А.В. и соавт., 2009). При экстремальных воздействиях, к которым относятся перегревание и переохлаждение организма, происходят изменения гомеостатических констант и, прежде всего, относящихся к системе крови (Новиков В.С., 1998). Различные по своей природе экстремальные воздействия приводят к формированию комплекса неспецифических изменений в системе крови. Сдвиги в системе крови в ранний период реакции на стресс, включают в себя нейтрофильный лейкоцитоз, эозинопению и снижение численности лимфоцитов (Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992; Гаркави Л.Х. и соавт., 1998).

Результаты исследования показали, что через 1 сут после воздействия ОГ численность лейкоцитов в крови крыс в среднем составила 2,9±0,25 х109/л, что была достоверно ниже, чем у животных контрольной группы (3,83±0,25 х109/л, p<0,05). К 3 сут после воздействия ОГ число лейкоцитов возрастало до уровня контрольных величин (3,11±0,35 х109/л). На 7 и 14 сут наблюдения их количество было достоверно выше, чем у крыс контрольной группы и соответственно составило 5,28±0,13 х109/л (p<0,01) и 6,38±1,0 х109/л (p<0,03). К концу срока наблюдения, т.е. к 21 сут после воздействия ОГ численность лейкоцитов снижалась и практически достигала до уровня контрольных значений (4,14±0,41 х109/л). На раннем сроке (1 сут) после воздействия общей гипертермии (ОГ) происходило снижение численности лейкоцитов в основном за счет уменьшения количества нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов. В дальнейшем происходило постепенное увеличение численности нейтрофилов и моноцитов крови, которое достигало максимума к 7 сут после действия ОГ, тогда как максимальная численность лимфоцитов была зафиксирована на 14 сут наблюдения (табл. 1).

Таблица 1.

Изменение абсолютного количества клеточных элементов периферической крови крыс Вистар на разных сроках после воздействия общей гипертермии

Клеточные элементы, х109/л

Контроль

Срок исследования (сут)

1

3

7

14

21

Эозинофилы

0,06±0,02

0,01±0,01

0

0,05±0,02

0,11±0,03

0,06±0,01

Базофилы

0,01±0,01

0

0

0

0

0,01±0,01

Юные

0

0

0,01±0,01

0,01±0,01

0,01±0,01

0

П/ядерные

0,03±0,02

0,02±0,02

0,04±0,01

0,14±0,03*

0,12±0,03*

0,02±0,01

С/ядерные

1,11±0,18

0,96±0,02

0,55±0,12*

1,74±0,24*

1,64±0,37

0,85±0,17

Лимфоциты

2,57±0,18

1,88±0,19

2,35±0,33

3,18±0,23

4,39±0,8*1

3,11±0,34

Моноциты

0,06±0,02

0,02±0,01

0,11±0,01

0,17±0,04*

0,11±0,03

0,1±0,03

Примечание: * - достоверные различия по сравнению с результатами у крыс контрольной группы (контроль) (p<0,05).

После воздействия ОГ число клеток костного мозга (КМ) снижалось до 7 сут, а затем к 14 и 21 сут - нормализовалось. Так, на 1, 3 и 7 сут наблюдения количество клеток КМ в среднем составило 25,9±5,91 х106/л, 30,7±5,50 х106/л  и 28,3±5,30 х106/л, соответственно (во всех случаях p<0,05). К 14 и 21 сут количество клеток КМ достигало до контрольного уровня (60,7±4,48 х106/л  х106/л) и в среднем составило 54,3±6,84  х106/л и 57,1±6,64  х106/л, соответственно. Изменение численности клеток КМ после воздействия ОГ происходило как за счет уменьшения численности молодых и юных, так и зрелых клеточных форм костномозгового кроветворения (табл. 2). Так, количество миелобластов, промиелоцитов, миелоцитов и метамиелоцитов в КМ через 1 сут (срок максимального уменьшения числа клеток КМ) после воздействия ОГ снизилось в 7,4, 7,95, 4,0 и 2,98 раза, соответственно (p<0,001).

Количество зрелых клеток КМ палочко- и сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов на этом сроке исследования снизилось в 2,6, 2,5, 1,4 и 3,7 раза, соответственно. На поздних сроках (14 и 21 сут) после воздействия ОГ число этих клеток восстанавливалось за счет активации как миелоидного, так и эритроидного ростков КМ (табл. 2).

Таблица 2

Изменения числа юных и зрелых клеточных форм в костном мозге крыс Вистар после воздействия общей гипертермии (M±m)

Сроки, сут

Клеточные элементы 106/мл

Молодые и юные формы клеток

Миелобласт

Промиелоцит

Миелоцит

метамиелоцит

Контроль

0,52±0,13

1,67±0,16

12,7±2,70

5,48±0,76

1

0,07±0,03*

0,21±0,04*

3,15±0,61*

1,84±0,47*

3

0,31±0,15

0,68±0,16*

6,18±1,28*

3,09±0,54*

7

0,30±0,18

0,64±0,12*

8,35±2,77

3,91±1,36

14

0,21±0,08

0,79±0,10*

9,86±1,75

4,85±1,01

21

0,31±0,11

1,31±0,18

11,96±1,84

4,69±0,49

Зрелые формы клеток

Сроки, сут

Нф

Лц

Мон

Эоз

П/ядерные

С/ядерные

Контроль

5,05±0,41

14,65±1,00

1,33±0,24

0,77±0,10

1,99±0,26

1

1,92±0,81*

5,86±1,86*

0,96±0,29*

0,21±0,09*

1,51±0,39

3

3,02±0,80*

5,66±1,48*

0,66±0,11

0,62±0,22

1,32±0,44

7

3,76±0,77

8,45±1,44*

1,06±0,35

0,49±0,09*

2,03±0,61

14

5,18±0,91

14,05±1,5

1,69±0,17

0,74±0,12

2,91±0,68

21

4,47±1,32

9,44±1,49*

2,20±0,52

1,02±0,12

3,02±0,95

Примечание: В каждой точке эксперимента были 6 крыс; Нф – нейтрофильные гранулоциты, ЛФ – лимфоциты, Мон – моноциты, Эоз – эозинофилы; * - p<0,05 по сравнению с соответствующими данными в контроле.

После воздействия ОГ в КМ крыс также происходило снижение количества клеток эритроидного ряда. При этом снижение числа клеток эритроидного ряда в КМ крыс происходило в основном за счет уменьшения количества эритробластов (1 сут) и базофильных нормоцитов. К 21 сут наблюдения происходила нормализация численности эритроидных клеток КМ (табл. 3).

Таблица 3

Изменение численности молодых и юных клеток эритроидного ряда в

костном мозге крыс Вистар после воздействия общей гипертермии (M±m)

Сроки, сут

Клеточные элементы 106/мл

Эритробласт

Базофильный нормоцит

Полихроматофильный нормоцит

Оксифильный нормоцит

Контроль

0,48±0,16

5,98±0,74

9,22±1,51

0,18±0,08

1

0,12±0,06*

1,35±0,36*

8,39±2,10

0,10±0,04

3

0,25±0,07

2,29±0,54*

5,71±1,08

0,41±0,20

7

0,22±0,06

2,12±0,16*

6,11±0,80

0,14±0,07

14

0,22±0,05

3,65±0,63*

7,48±0,88

1,10±0,52

21

0,49±0,21

6,07±1,33

11,30±1,64

0,40±0,17

Примечание: В каждой точке эксперимента были 6 крыс; * - достоверные различия по сравнению с соответствующими данными в контроле (p<0,05).

Изменения количественного и качественного состава клеток периферической крови при действии различных стрессирующих факторов могут происходить за счет перераспределения циркулирующих и пристеночных пулов, усиления их миграции в ткани (Wang X.Y. et al., 1998)  а также активации костномозгового кроветворения (Маянский Д.Н., 2007).

При различных экстремальных воздействиях в организме млекопитающих активируются окислительно-восстановительные процессы, ведущие к образованию липо- и гидроперекисей (Трахтенберг И. М., Иванова Л. А., 1999; Зенков Н.К. и соавт., 2001; Chen С. Y., Lin T. Н., 2001; Huang Y. L. et al., 2001).

Результаты проведенного исследования показали, что после воздействия ОГ происходило фазовое изменение окислительно-метаболической функции лейкоцитов крови и клеток КМ, которое характеризовалось: а) повышением продукции АМК этими клетками на ранних сроках наблюдения; б) резким снижением окислительно-метаболической функции этих клеток на 3 сут; в) повторным подъемом значений Isum ХЛ ответа клеток на 7 сут наблюдения; г) нормализацией этих показателей к концу срока наблюдения (21 сут)  (табл. 4). При этом на всех сроках исследования изменение значений Imax и Isum ХЛ ответа клеток крови и КМ имели однонаправленный характер. Не исключено, что при воздействии ОГ усиление окислительно-метаболической функции лейкоцитов крови и клеток КМ, представленных, в частности, миелоидными клетками различной степени дифференцировки начинают продуцировать АМК под действием цитокинов. При этом стоит отметить, что по активности окислительно-метаболической функции клеток КМ можно косвенно судить о степени их дифференцировки, поскольку существует мнение о том, что ранние предшественники кроветворных клеток не обладают АМК-продуцирующей способностью и только по мере созревания костномозговые клетки приобретают это свойство  (Зенков Н.К. и соавт., 2001).

  Таблица 4

Суммарный хемилюминесцентный ответ (Isum) лейкоцитов крови и клеток костного мозга крыс Вистар после воздействия общей гипертермии,  (M±m)

Сроки, сут

ХЛ ответ лейкоцитов, 

х105 имп/103 кл

ХЛ ответ клеток КМ, 

х105 имп/103 кл

Спонтанный

ЗГ-индуцированный

Спонтанный

ЗГ-индуцированный

Контроль

4,4±0,4

5,7±0,89

1,84±0,23

3,14±0,43Х

1

6,3±0,64

8,3±1,2

2,20±0,28

3,21±0,53

3

3,7±0,1

4,0±0,87

0,89±0,14*

1,24±0,30*

7

7,4±0,5*

11,2±1,2*/ Х

3,11±0,19*

5,62±0,29*/ Х

14

4,2±0,18

4,7±0,4

2,14±0,28

3,54±0,48

21

4,1±0,18

4,9±0,3

1,45±0,19

2,21±0,35

Примечание: В каждой точке эксперимента были 6 крыс; * - достоверные различия по сравнению с соответствующими значениями в контроле  и Х – по сравнению с соответствующими значениями спонтанного ХЛ ответа (p<0,05).

Оценку активности костномозгового кроветворения у крыс Вистар после воздействия ОГ проводили по характеру роста КОЕ-ГМ, БОЕ-Э+КОЕ-Э и частично детерминированных гемопоэтических предшественников (КОЕ-ЭГМ) в культуре клеток КМ.

В результате исследования было показано, что после воздействия ОГ происходили фазовые изменения активности миелоидного и эритроидного ростков костномозгового кроветворения. Так, через 1 сут после воздействия ОГ число КОЕ-ГМ достоверно (p<0,05) снизилось и в среднем составило 17,0±1,46 на 105 клеток костного мозга (в контроле - 22,7±1,56 на 105 клеток костного мозга). Однако уже на 3 сут наблюдения число КОЕ-ГМ восстанавливалось до 22,5±2,2 на 105 клеток КМ. Затем к 7 сут и 14 сут число КОЕ-ГМ возрастало соответственно до 42,0±1,93 и 32,0±2,86 на 105 клеток КМ, что в среднем превышали контрольные величины данного показателя в 1,85 и 1,4 раза (p<0,05) соответственно. К концу срока наблюдения (21 сут) число КОЕ-ГМ достигало до уровня контрольных значений и в среднем составило 23,3±1,2 105 клеток КМ (рис. 1).

Рис. 1. Изменение числа КОЕ-ГМ и БОЕ-Э+КОЕ-Э в культуре клеток костного мозга крыс Вистар на разных сроках после воздействия общей гипертермии.

* - достоверные различия по сравнению с крысами контрольной группы (контроль) (p<0,05).

При исследовании колониеобразующей активности ранних (БОЕ-Э) и поздних (КОЕ-Э) эритроидных предшественников после воздействия ОГ выявлены подобные изменения, как и КОЕ-ГМ.  Так, через 1 и 3 сут после воздействия ОГ число БОЕ-Э+КОЕ-Э достоверно (p<0,05) снизилось и в среднем составило соответственно 11,3±0,7 и 13,3±2,9 на 105 клеток КМ (в контроле - 19,7±1,7 на 105 клеток КМ). В то же время уже на 7 сут наблюдения число БОЕ-Э+КОЕ-Э в культуре клеток КМ не только восстанавливалось, но и выросло до 43,5±1,2 на 105 клеток КМ. Затем к 14 сут и 21 сут после воздействия ОГ число БОЕ-Э+КОЕ-Э снижалось соответственно до 25,0±0,82 и 20,5±1,28 на 105 клеток КМ (рис. 1).

Таким образом, к концу срока наблюдения (21 сут) активность ранних и поздних эритроидных предшественников КМ крыс нормализовалась.

На ранних сроках (1 и 3 сут) после воздействия ОГ, в отличие от КОЕ-ГМ и БОЕ-Э+КОЕ-Э число КОЕ частично детерминированных предшественников (КОЕ-ЭГМ) не менялось, а к 3 сут наблюдения, напротив, возрастало. Так, через 1 сут после воздействия число КОЕ-ЭГМ в среднем составило 0,67±0,21 на 105 клеток КМ, что практически не отличалось от контрольных цифр (контроль -  0,67±0,2 на 105 клеток КМ). На 3 сут после воздействия ОГ число  КОЕ-ЭГМ возросло в 3,5 раза (p<0,01) и в среднем составило 2,33±0,46 на 105 клеток КМ. Высокая активность частично детерминированных предшественников сохранялась и на 7 сут наблюдения: число КОЕ- КОЕ-ЭГМ в среднем составило 1,5±0,34 на 105 клеток КМ (p<0,05); к 14 и 21 сут наблюдения активность ранних гемопоэтических предшественников нормализовалась. Так, численность КОЕ-ЭГМ на этих сроках исследования в среднем составила 0,83±0,31 и 0,67±0,33 на 105 клеток КМ (рис. 2).

       

Рис. 2. Изменение числа КОЕ-ЭГМ в культуре клеток костного мозга крыс Вистар на разных сроках после воздействия общей гипертермии.

* - достоверные различия по сравнению с крысами контрольной группы (контроль) (p<0,05).

Как известно, регуляция кроветворения осуществляется единой слож-ноорганизованной системой, включающей в себя взаимосвязанные дистантные и локальные контролирующие структуры (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002; Гольдберг Е.Д. и соавт., 2003, 2007). Ряд цитокинов, такие как интерлейкины -1, -3 (мульти-КСФ), -4, -6, -9, -13, фактор некроза опухолей (ФНО), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и т.д., а также ЭПО прямо или синергично с другими гемопоэтинами регулируют эритро-, гранулоцито- и моноцитопоэз (Гольдберг Е.Д. и соавт., 2004).

На рис. 3 представлены результаты оценки изменения концентраций ГМ-КСФ  и ИЛ-1 в сыворотке крови крыс на разных сроках после воздействия ОГ. Результаты исследования показали, что уровень ГМ-КСФ через 1 сут после воздействия ОГ возрастал в 6,9 раза по сравнению с его содержанием у крыс контрольной группы, и в среднем составил 123,3±4,24 пкг/мл (в контроле - 17,9±1,4 пкг/мл) (p<0,01). На 3 и 7 сут наблюдения содержание ГМ-КСФ в сыворотке крови крыс достигло соответственно до 570,4±44,4 пкг/мл и 376,3±29,3 пкг/мл, что было 31,9 и 21 раз выше, чем у животных контрольной группы (p<0,001). На поздних сроках исследования, т.е. на 14 и 21 сут после воздействия ОГ концентрация ГМ-КСФ в сыворотке крови крыс снижалась относительно предыдущих сроков наблюдения и в среднем составила соответственно 57,3±4,46 и 95,1±7,4 пкг/мл (p<0,05) (рис. 3А).

Рис. 3. Изменение концентрации ГМ-КСФ (А) и ИЛ-1 (Б) в сыворотке крови крыс на разных сроках после воздействия общей гипертермии.

* - достоверные различия по сравнению с крысами контрольной группы (контроль).

Результаты исследования показали, что уровень ИЛ-1  в сыворотке крови крыс через 1 сут после воздействия ОГ возрастал в 1,5 раза по сравнению с его содержанием у крыс контрольной группы, и в среднем составил 38,8±1,7 пкг/мл (в контроле - 22,7±1,3 пкг/мл) (p<0,01). На 3 и 7 сут наблюдения содержание ИЛ-1  в сыворотке крови крыс достигало соответственно до 79,3±3,8 пкг/мл и 126,7±11,4 пкг/мл, что было 3,5 и 5,6 раза выше, чем у животных контрольной группы (p<0,001). На поздних сроках исследования, т.е. на 14 и 21 сут после воздействия ОГ концентрация ИЛ-1 в сыворотке крови крыс относительно предыдущих сроков наблюдения снижалась и в среднем составила соответственно 53,4±2,8 и 41,5±3,3 пкг/мл (p<0,05) (рис. 3Б).

Результаты исследования показали, что после воздействия ОГ в сыворотке крови крыс происходило фазовое изменение содержания ЭПО (рис. 4). Содержание ЭПО в сыворотке крови крыс контрольной группы в среднем составило 11,8±0,72 пкг/мл. Через 1 сут после воздействия ОГ содержание ЭПО в среднем составило 14,5±1,12  пкг/мл. На 3 сут наблюдения его содержание ЭПО в среднем составило 442,6±24,2 пкг/мл, а к 7 сут – отмечено некоторое снижение его уровня до 137,7±12,3 пкг/мл. К 14 сут после воздействия ОГ содержание ЭПО в сыворотке крови крыс вновь возрастало и в среднем составило 195,5±14,9 пкг/мл. К концу срока исследования (21 сут) наблюдали повторное снижение концентрации ЭПО в сыворотке крови крыс до 80,3±3,3 пкг/мл (рис. 4).

Таким образом, результаты исследования показали, что после воздействия ОГ в сыворотке крови происходили разнонаправленные изменения уровней регуляторных медиаторов ГМ-КСФ, ИЛ-1 и ЭПО. Содержание ГМ-КСФ и ИЛ-1 возрастало, начиная с 1 сут после воздействия ОГ, и достигало максимальных значений в первом случае к 3 сут, а ИЛ-1 – к 7 сут наблюдения. Рост ЭПО в сыворотке крови крыс после воздействия ОГ, в отличие от  ГМ-КСФ и ИЛ-1, несколько «запаздывал» и имел фазовый характер изменений.

Рис. 4. Изменение содержания эритропоэтина в сыворотке крови крыс Вистар на разных сроках после воздействия общей гипертермии.

* - достоверные различия по сравнению с крысами контрольной группы (контроль).

Выявленные в настоящем исследовании изменения окислительно-метаболической функции клеток КМ и активности костномозгового кроветворения,  возможно, связаны с усилением продукции и действием основных регуляторных медиаторов гемопоэза - ГМ-КСФ, ИЛ-1 и ЭПО. Так, было показано, что у крыс после воздействия ОГ увеличиваются концентрации ИЛ-1 и ГМ-КСФ, которые прямо коррелировали с показателем активности окислительно-метаболической функции лейкоцитов крови и клеток КМ (Isum ХЛ ответ). В то же время, было показано, что между содержанием ЭПО и Isum ХЛ ответом клеток КМ крыс контрольной группы были выявлены отрицательные корреляционные связи. После воздействия ОГ эти связи значительно менялись, но к концу исследования (21 сут) вновь приобретает отрицательный характер связей. Эти результаты согласуются с данными, свидетельствующими о том, ЭПО обладает антиоксидантными свойствами (Саенко Ю.В. и соавт., 2009).

Анализ результатов исследования выявил высокую положительную корреляцию между КОЕ-ГМ и регуляторными медиаторами (ГМ-КСФ и ЭПО) у крыс контрольной группы. Эти результаты, вероятно, свидетельствуют о том, что указанные медиаторы работают «сбалансированно» в зависимости от физиологических потребностей организма.

Как известно, система мононуклеарных фагоцитов играет важную роль в регуляции функции гемопоэтических клеток (Захаров Ю.М., Рассохин  А.Г., 2002, Sadahira Y. et al., 1999, Yokoyama T. et al., 2003). Моноциты-макрофаги костного мозга, являясь центральной клеткой эритробластического островка, обладают высоким аффинитетом по отношению к эритроидным клеткам (Fabriek B.O., 2007), регулируют их пролиферацию и дифференцировку (Ingley E. et al., 2004), создают специфическое гемопоэтическое микроокружение (Захаров Ю.М., Тишевская Н.В., 2003), продуцируют биологически активные гуморальные факторы (Фрейдлин И.С., 1995), обеспечивая адаптивные реакции кроветворной ткани при экстремальных воздействиях.

Основным фактором, запускающим эритропоэтические функции центрального макрофага эритроидного островка, является ЭПО. Центральный макрофаг эритроидного островка подвержен также регулирующим эффектам цитокинов и лимфоцитов, взаимодействие эритробластических островков, с которыми значительно меняется при разных функциональных состояниях эритрона. Однако, основным фактором, определяющим выраженность эритропоэтической функции эритробластического островка, является воздействие на его компоненты ЭПО (Захаров Ю.М., Тишевская Н.В., 1997; Гольдберг Е.Д. и соавт., 2004).

Как известно, ЭПО, стимулирующий пролиферацию эритроидных прекурсоров, секретируется не только моноцитами и резидентными макрофагами, но и в почках. В работе было показано, что после воздействия ОГ уровень ЭПО в сыворотке крови крыс возрастает не сразу, и достигает максимального уровня к 3-м сут, что, прежде всего, может быть связано с развитием гипоксии, поскольку ОГ приводит к неконтролируемой вазодилятации, снижению насыщенности тканей кислородом и ацидозу (Marczynski B. et al., 2001). Основным фактором активации эритропоэза являются пролиферативные процессы во вновь образованных эритробластических островках, сопровождающиеся накоплением эритроидных клеток в костном мозге (Улитко М.В., Юшков Б.Г., 2003).

Таким образом, проведенное исследование свидетельствует, что КМ активно реагирует на изменение температурных условий (воздействие ОГ) с активацией костномозгового кроветворения. Получены новые данные о характере изменения, как костномозгового кроветворения, так и его регуляторных медиаторов ГМ-КСФ и ЭПО при действии общей гипертермии.

 

ВЫВОДЫ

1. В динамике после воздействия общей гипертермии происходило однонаправленное изменение количественного и качественного состава лейкоцитов крови и клеток костного мозга крыс. На ранних сроках (1 и 3 сут) после воздействия общей гипертермии численность лейкоцитов крови и клеток костного мозга крыс снижалась, а на 7 и 14 сут - возрастала. 

2. При воздействии общей гипертермии выявлен фазовый характер изменения активности костномозговых кроветворных предшественников крыс. На ранних сроках после воздействия общей гипертермии происходило угнетение эритропоэза (снижение БОЕ-Э+КОЕ-Э) и миелопоэза (снижение КОЕ-ГМ). После фазы угнетения происходила активация и последующая нормализация миелоидного и эритроидного ростков костномозгового кроветворения. В основе восстановления количества коммитированных кроветворных предшественников в костном мозге крыс после воздействия общей гипертермии лежит активация КОЕ-ЭГМ.

3. После воздействия общей гипертермии происходило разнонаправленное изменение концентрации гемопоэз-регулирующих медиаторов в сыворотке крови крыс: выявлено увеличение концентрации ГМ-КСФ и ИЛ-1 и снижение содержания эритропоэтина на ранних сроках (1, 3 и 7 сут) в сыворотке крови. К 14 сут после воздействия общей гипертермии концентрация эритропоэтина в сыворотке крови крыс возрастала и к концу эксперимента - нормализовалось.

4. При воздействии общей гипертермии происходила активация окислительно-метаболической функции лейкоцитов крови и клеток костного мозга крыс. Увеличение содержания ГМ-КСФ и ИЛ-1 в сыворотке крови крыс после воздействия общей гипертермии сопровождается усилением, а эритропоэтина – со снижением окислительно-метаболической функции клеток костного мозга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Самсонов А.В. Содержание бактериального липополисахарида E. Coli в сыворотке крови у экспериментальных животных на фоне общей гипертермии / А.В. Самсонов, Н.В. Долотина, В.С. Сазонов // Городское здравоохранение – 2009.- Спец. выпуск, посвященный XIV Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине», Казань, 2009.- С. 175.

2. Самсонов А.В. Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови у экспериментальных животных на фоне общей гипертермии / А.В. Самсонов, Н.В. Долотина, В.С. Сазонов // Городское здравоохранение – 2009.- Спец. выпуск, посвященный XIV Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине», Казань, 2009.- С. 175-176.

3. Самсонов А.В. Гемолимфатический индекс параметров липидного обмена у крыс при общей гипертермии / А.В. Самсонов, Е.Б. Белобородова, О.Н. Логачева,  Н.В. Долотина и др. // III Международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения – 2009»: Тез. докл.- Санкт-Петербург, 2009.- С. 203.

4. Самсонов А.В. Фагоцитарная активность клеток крови крыс при общей гипертермии / А.В. Самсонов, Е.Б. Белобородова, О.Н. Логачева,  Н.В. Долотина и др. // III Международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения – 2009»: Тез. докл.- Санкт-Петербург, 2009.- С. 211.

5. Самсонов А.В. Лабораторные критерии эндотоксикоза у экспериментальных животных при общей гипертермии / А.В. Самсонов, Е.Б. Белобородова, О.Н. Логачева,  Н.В. Долотина и др. // III Международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения – 2009»: Тез. докл.- Санкт-Петербург, 2009.- С. 212.

6. Самсонов А.В. К вопросу изучения бактериального липополисахарида E. Coli крыс в динамике после общей гипертермии / А.В. Самсонов, Н.В. Долотина, В.С. Сазонов // Труды I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов».- г. Новосибирск, 2009.- С. 331-333.

7. Самсонов А.В. Оценка фагоцитарной и биоцидной активности нейтрофилов периферической крови / А.В. Самсонов, Н.В. Долотина, В.С. Сазонов // Труды I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов».- г. Новосибирск, 2009.- С. 333-335.

8. Самсонов А.В. Поглотительная способность мононуклеарных фагоцитов печени в динамике после проведения общей гипертермии у экспериментальных животных / А.В. Самсонов, Н.В. Долотина, О.Н. Логачева, В.С. Сазонов // Труды II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов».- г. Новосибирск, 2010.- С. 306-310.

9. Самсонов А.В. Биоцидный потенциал макрофагов бронхо-альвеолярной лаважной жидкости после применения общей гипертермии у экспериментальных животных / А.В. Самсонов, Н.В. Долотина, О.Н. Логачева, В.С. Сазонов // Труды II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов».- г. Новосибирск, 2010.- С. 310-314.

10. Самсонов А.В. Биоцидный потенциал перитонеальных макрофагов после воздействия общей гипертермии у экспериментальных животных / А.В. Самсонов, Н.В. Долотина, О.Н. Логачева, И.А. Кривошапкин, В.С. Сазонов // Труды III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов».- г. Новосибирск, 2011.- С. 287-291.

11. Самсонов А.В. Поглотительная способность мононуклеарных фагоцитов легких в динамике после проведения общей гипертермии у экспериментальных животных / А.В. Самсонов, Н.В. Долотина, О.Н. Логачева, И.А. Кривошапкин, Г.Г. Волков // Труды III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов».- г. Новосибирск, 2011.- С. 292-295.

12. Самсонов А.В. Функциональное состояние легочных макрофагов у экспериментальных животных после применения общей гипертермии / А.В. Самсонов, Н.В. Долотина // Бюллетень СО РАМН.- 2011.- Т. 31, №1.- С. 5-10.

13. Самсонова Е.Н. Реакция клеток костного мозга при действии общей гипертермии / Е.Н. Самсонова, Н.В. Долотина, О.Н. Логачева  // Бюллетень СО РАМН.- 2011.- Т. 31, №1.- С. 40-45.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМК -

активные метаболиты кислорода

БОЕ-Э -

эритроидная бурстообразующая единица

ГМ-КСФ -

гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ИЛ-1, -3, -6  и т.д. -

интерлейкин (ы)-1, -3, -6 и т.д.

КМ -

костный мозг

КОЕ-ГМ -

гранулоцитарно-макрофагальная колониеобразующая единица

КОЕ-Э -

колониеобразующая единица эритроцитов

КОЕ-ЭГМ -

эритроидно-гранулоцитарно-макрофагальная колониеобразующая единица

КСФ -

колониестимулирующий фактор

ОГ -

общая гипертермия

ПОЛ -

перекисное окисление липидов

СМФ -

система мононуклеарных фагоцитов

ФНО -

фактор некроза опухоли

ХЛ -

хемилюминесценция

ЭПО -

эритропоэтин




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.