WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи





ЛАРСКАЯ КСЕНИЯ СЕРГЕЕВНА



РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ АНАЛИЗА БУТОКОНАЗОЛА НИТРАТА В ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ


14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ

КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

ПЯТИГОРСК 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном  учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Научный руководитель:  доктор фармацевтических наук,профессор

  Гаврилин Михаил Витальевич

       



Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

  Лазарян Джон Седракович, ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой токсикологической химии

кандидат фармацевтических наук, профессор

Олешко Григорий Иванович, ГБОУ ВПО Пермская ГФА Минздравсоцразвития России, профессор кафедры фармакогнозии

Ведущая организация:  Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Защита состоится «__» _______20__ года в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.069.01. при ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан «____»______20__ г.

Ученый секретарь диссертационного совета                        Компанцева Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Грибковые поражения слизистой оболочки влагалища являются достаточно распространенным гинекологическим заболеванием. Несмотря на имеющийся арсенал противогрибковых препаратов число больных с этой патологией имеет тенденцию к росту. Поэтому поиск новых, более эффективных противогрибковых лекарственных средств ведется во многих странах.Одним из них является бутоконазола нитрат. Сведения, опубликованные в научной литературе, показывают, что бутоконазола нитрат превосходит по противогрибковой  активности в отношении грибов рода Candida другие лекарственные средства. Однако в Российской Федерации препараты бутоконазола нитрата не производятся. На фармацевтическом рынке имеются два препарата зарубежного производства: Гинофорт и Гиназол (совместное производство США и Венгрии), один из которых (Гинофорт) зарегистрирован в России.

Для производства препарата на основе бутоконазола нитрата для гинекологической практики в нашей стране необходимо решение не только технологических вопросов, но и разработки надежных методов оценки качества. Полный набор критериев качества препарата помимо содержания основного вещества должен включать также оценку содержания вспомогательных веществ (консервантов), посторонних примесей,  определение биодоступности, оценку специфической активности, а также сроков хранения (годности) препарата.

Известно, что использование сепарационных методов анализа (хроматографические, электрофоретические методы) позволяет эффективно решать вопросы стандартизации лекарственных препаратов сложного состава. Однако возможность их применения для анализа лекарственных форм бутоконазола нитрата в России не исследована. Изучение возможности применения химических и физико-химических методов анализа позволит разработать методики контроля качества нового лекарственного препарата, содержащего бутоконазола нитрат. Это в значительной степени будет способствовать его скорейшему внедрению в медицинскую практику.

Поэтому разработка методик анализа и оптимизация уже имеющихся, а также стандартизация нового лекарственного препарата бутоконазола нитрата, крема вагинального 20 мг/г, является актуальной задачей для фармации.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является разработка аналитических методик для  оценки качества лекарственного препарата на основе бутоконазола нитрата, его стандартизации, установления сроков годности, изучения фармакокинетических параметров.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

  1. Изучить возможность использования хроматографических методов для качественного и количественного анализа бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола, входящих в состав изучаемого лекарственного препарата, а также оценки степени его чистоты.
  2. Обосновать параметры пригодности системы для хроматографического разделения бутоконазола, нипагина и нипазола в лекарственном препарате  «Бутоконазол, крем вагинальный, 20 мг/г»
  3. Провести валидационную оценку предлагаемых методик контроля качества препарата по основным критериям: специфичность, линейность, прецизионность, точность, правильность, диапазон применения, робастность.
  4. Определить робастность методики количественного определения бутоконазола нитрата и консервантов по изменениям показателей прецизионности и правильности в процессе рутинного анализа с использованием контрольных карт Шухарта. Установить контрольные границы среднего значения открываемости и размахов для данной  методики.
  5. Изучить возможность использования капиллярного электрофореза для качественного и количественного определения бутоконазола нитрата в биологических жидкостях. Провести сравнительную оценку фармакокинетических параметров, противогрибковой активности и мукоадгезивных свойств  бутоконазола нитрата, крема вагинального, 20 мг/г и препарата–прототипа «Гинофорт».

Научная новизна.

Разработана методика качественного и количественного определения бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола в креме при совместном присутствии. Показана зависимость коэффициентов разделения пиков бутоконазола и консервантов, а также коэффициентов их асимметрии от состава подвижной фазы. Разработана методика определения посторонних примесей в препарате методом ВЭЖХ. Проведеннная валидационная оценка методик показала приемлемость их применения для анализа готового продукта и его стандартизации.

Впервые для определения робастности предложенной методики анализа использованы контрольные карты Шухарта. Так же с их помощью выбран допустимый диапазон изменений состава элюента, внутри которого величины основных валидационных характеристик статистически не меняются.

Выбраны условия электрофоретического определения бутоконазола нитрата в биологических жидкостях с учетом его физико–химических свойств (низкая растворимость в водной среде как основания, так и его соли). С помощью метода капиллярного электрофореза (КЭФ) проведено сравнительное исследование фармакокинетических характеристик бутоконазола нитрата, при различных путях введения. Изучены мукоадгезивные свойства предлагаемого крема в сравнении с прототипом - Гинофортом.

Практическая значимость результатов исследования. Доказана возможность использования метода ВЭЖХ для параллельного количественного определения  бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола при совместном присутствии и из одной навески, а также определения посторонних примесей в препарате.

Предложена методика анализа с использованием КЭФ бутоконазола нитрата, которая может  считаться альтернативной широко распространенному методу ВЭЖХ.

С помощью КЭФ исследована динамика накопления бутоконазола в плазме крови крыс при интравагинальном введении исследуемого крема на его основе в сравнении с Гинофортом, а также внутрибрюшинным введением раствора субстанции.

Проведено сравнение мукоадгезивных свойств кремов бутоконазола и Гинофорта. Установлено, что по всем изученным параметрам предлагаемый препарат сопоставим с Гинофортом.

Показана возможность использования контрольных карт Шухарта для оценки робастности методик анализа как во время их разработки, так и в процессе рутинного анализа.

Проведено изучение стабильности препарата бутоконазола. Установлено, что  препарат сохраняет свою стабильность в течение трех лет при соблюдении условий хранения.

Внедрение результатов исследования в практику. Совместно с ЗАО «Валента Фармацевтика» разработан  проект ФСП на Бутоконазол, крем вагинальный, 20 мг/г, передан на регистрацию в Министерство здравоохранения и социального развития РФ.

Апробация и публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы доложены на региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск, 2008 и 2009 гг.), а также на 65-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Волгоград, 2007 г.). По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в т.ч. 2 - в журналах, рекомендуемых ВАК.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 158 странице печатного текста, содержит 43 таблицы и 42 рисунка, состоит из «Введения», «Обзора литературы» и 4-х глав собственных исследований, общих выводов, а также списка литературы, включающего 142 источника, в том числе 106 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Нижеприведенные исследования проводились с использованием образцов крема, предоставленных ЗАО «Валента Фармацевтика» следующего состава (таблица 1):

Таблица 1 -  Состав Бутоконазола, крема вагинального, 20 мг/г

Компонент

Масса, г

Бутоконазола нитрат

2,0

Масло вазелиновое

17,0

Твин 80

5,0

Моноглицериды дистиллированные

1,0

ПЭО 400

9,0

ПЭО 1500

6,0

Сорбит

1,50

Мочевина

3,0

Пропиленгликоль

20,0

Нипагин

0,08

Нипазол

0,02

Вода очищенная

до 100,0


Выбор условий количественного определения бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола при совместном присутствии

Проведенный литературный поиск показал, что значительное количество работ как отечественных, так и зарубежных ученых посвящено исследованию фармакологической активности препарата бутоконазола, тогда как информации об использовании аналитических методик невелико. Согласно фармакопее США  (USP) количественное определение бутоконазола нитрата и консервантов (нипагина и нипазола) проводят с использованием метода ВЭЖХ в различных условиях. В обоих случаях применяется изократический режим хроматографирования и предусмотрено использование внутреннего стандарта (таблица 2).

Таблица 2 - Условия количественного анализа бутоконазола нитрата и парабенов в препарате Гинофорт в соответствии с USP (2007)

Методика 1

Методика 2

Бутоконазола нитрат

Парабены

Состав ПФ:

Состав ПФ:

Метанол

65%

Ацетонитрил

35-40%

Ацетатный буфер 0,054М, рН 4,3

35%

Вода

65-60%

Детектирование

УФ, 225 нм

Детектирование

УФ, 254 нм

Внутренний стандарт

Бензимидазол

Внутренний стандарт

Этилпарабен

Первым этапом исследований стало изучение возможности использования метода ВЭЖХ для качественного и количественного анализа бутоконазола, нипагина и нипазола при совместном присутствии. Объектами исследования являлись растворы модельной смеси, содержащие бутоконазола нитрат, нипагин и нипазол, а также растворы СО этих веществ.

Использование метода пробного градиента позволило провести оптимизацию условий хроматографирования модельной смеси. Оптимальным оказался градиентный режим элюирования анализируемого раствора: от 20 до 40% ацетонитрила за 5 минут, затем до 70% за 10 минут. Предложенная система позволила достоверно отделить друг от друга все пики анализируемых компонентов (рис. 1).

Рисунок 1 - Хроматограмма раствора модельной смеси нипагина, бутоконазола и нипазола

Однако, несмотря на удовлетворительные параметры разрешения хроматографической системы, неприемлемыми остались значения асимметрии пиков бутоконазола и нипагина (2,94 и 0,54,  соответственно).Поэтому следующим шагом эксперимента стало улучшения показателей хроматографической системы с использованием динамических модификаторов. Нормативные документы на субстанцию бутоконазола и Гинофорт в качестве модификаторов предписывают использовать уксусную кислоту и кислоту ортофосфорную. Экспериментально установлено, что при использовании последней пик бутоконазола имеет более правильную форму, чем при применении ацетатного буферного раствора. Поэтому в качестве водного компонента подвижной фазы было решено использовать раствор кислоты ортофосфорной.

Следующим этапом работы стало определение оптимального диапазона концентрации водной фазы элюента. Для этого хроматографировали раствор модельной смеси в режиме градиентного элюирования (от 20 до 40% ацетонитрила за 5 минут, затем до 70% за 10 минут) с использованием в подвижной фазе растворов кислоты ортофосфорной различной концентрации.

Рисунок 2 - Графики зависимости значений RSD пиков бутоконазола, нипагина и нипазола от концентрации кислоты ортофосфорной

Рисунок 3 - Графики зависимости значений коэффициентов асимметрии пиков бутоконазола, нипагина и нипазола от концентрации кислоты ортофосфорной

На хроматограммах фиксировали площади пиков компонентов и коэффициенты их асимметрии. Для площадей пиков вычисляли относительное стандартное отклонение. На основании полученных данных строили графики зависимости изучаемых критериев от состава ПФ (рис. 2-3). Результаты позволяют сделать вывод, что коэффициенты асимметрии пиков для всех компонентов имеют удовлетворительные значения при использовании кислоты ортофосфорной с концентрацией от 0 до 0,08 М.

Относительное стандартное отклонение площадей пиков исследуемых веществ соответствует рекомендуемым требованиям при использовании кислоты с концентрацией 0,03 – 0,06 М.

В этой связи, оптимальным составом водной фазы элюента следует считать раствор кислоты ортофосфорной с концентрацией 0,03-0,06 М.

Таким образом, при использовании градиентного режима элюирования раствора модельной смеси бутоконазола, нипагина и нипазола: от 20 до 40% ацетонитрила за 5 минут, затем до 70% за 10 минут и использовании раствора кислоты ортофосфорной с концентрацией от 0,03-0,06 М в качестве водной фазы элюента, все пики определяемых веществ на хроматограмме  достоверно отделены друг от друга. Параметры пригодности хроматографической системы соответствуют рекомендуемым требованиям. Хроматограмма, полученная в описанных условиях, представлена на рис. 4.

Рисунок 4 - Хроматограмма раствора модельной смеси нипагина (1), бутоконазола (2) и нипазола (3)

Однако, несмотря на полученные результаты, затруднено достоверное количественное определение нипазола в креме. Это связано с его низким содержанием в препарате по сравнению с бутоконазолом, что приводит к значительному увеличению величины относительного стандартного отклонения площадей пиков. Вместе с тем, при повышении концентрации нипазола в растворе растет и содержание бутоконазола, что отрицательно влияет на форму его пика: коэффициент асимметрии выходит за установленные рамки 0,75-2,5. Поэтому целесообразно было провести сравнительную оценку показателей пригодности хроматографической системы для каждого компонента на различных уровнях концентраций. Приготовленные растворы хроматографировали, определяли коэффициенты разрешения, коэффициенты асимметрии, относительные стандартные отклонения площадей пиков.

а)

б)

в)

Рисунок 5 - Графики зависимости параметров пригодности хроматографической системы (1-асимметрия пика, 2-разрешение, 3-RSD площадей пиков) от концентрации раствора бутоконазола (а), нипагина (б) и нипазола (в)


На основании полученных данных строили графики зависимости параметров пригодности хроматогрфической системы для каждого компонента от его концентрации в растворе (рис. 5).

Как показано на представленных рисунках, область оптимальных аналитических  концентраций для всех компонентов при совместном присутствии, составляет интервал 1,25-2,0 мг/мл для бутоконазола, 0,05-0,08 мг/мл для нипагина и 0,0125-0,02 мг/мл для нипазола. Это объясняется тем ,что в этом интервале концентраций параметры пригодности хроматографической системы удовлетворяют рекомендуемым требованиям для всех компонентов.

Валидационная оценка методики количественного определения бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола

Следующим этапом работы стала валидационная оценка предлагаемой методики по основным показателям: специфичность, линейность, прецизионность, правильность, точность (таблица 3).

Таблица 3 - Валидационные характеристики ВЭЖХ методики количественного определения компонентов крема

Показатель

Бутоконазола нитрат

Нипагин

Нипазол

Линейность

y=7472,3x+14,5

r=0,9999

y=28694x+57,2

r=0,9992

y=29087x+5,2

r=0,9986

Прецизионность

=20,11 мг/г

SD=0,19

RSD=0,95%

=0,81 мг/г

SD=0,01

RSD=1,29%

=0,24 мг/г

SD=0,008

RSD=3,36 %

Точность

=99,74%

SD=0,95

RSD=0,95

R=±0,81

=100,41%

SD=1,48

RSD=1,48

R=±1,27

=100,26

SD=2,92

RSD=2,91

R=±2,50

Правильность

=100,27%

SD=0,19

=1,2%

t=0,65

=100,00%

SD=0,01

=2,1%

t= 1,14

=100,00%

SD=0,008

=2,3%

t= 1,00

Диапазон применения

0,5 – 1,5 мг/мл

0,02 – 0,06 мг/мл

0,005 – 0,015 мг/мл

Результаты свидетельствуют о соответствии предлагаемой методики основным валидационным требованиям. Однако, наряду с достаточно подробным описанием процедур оценки большинства валидационных показателей, нет единого систематизированного подхода к исследованию робастности. Робастность подразумевает изучение стабильности результатов анализа веществ в зависимости от изменения тех или иных параметров выполнения эксперимента. Однако, наряду с параметрами, которые могут изменяться контролируемо (состав  подвижной фазы, аналитическая концентрация раствора, наклон градиента и т.п.), существуют такие факторы, влияние которых на результаты анализа не поддается контролю. Это так называемые «случайные» факторы.

Поэтому изучение робастности методики заключалось в изучении влияния «случайных» причин (температура окружающей среды, атмосферное давление, освещенность и т.п.) на результаты рутинного анализа. В основу эксперимента легла концепция контрольных карт Шухарта. Их целью является определение того, отличаются ли наблюдаемые значения размахов параллельных эксперименов и их средних значений от соответствующих стандартных значений больше, чем можно ожидать при действии только случайных причин.

Для определения робастности методики в процессе рутинного анализа выясняли стабильность показателей прецизионности и точности в зависимости от фактора «время», подразумевающего изменение таких параметров, как температура, давление, влажность, освещенность и т.п. Для выполнения эксперимента каждый день готовили по две модельные смеси с точно известным содержанием бутоконазола, нипагина и нипазола, которые анализирвали методом ВЭЖХ в условиях количественного определения.

В первую очередь для оценки стабильности методики анализировали R – карту (карту размахов), поскольку она показывает изменчивость вариаций внутри подгрупп и позволяет оценить стабильность прецизионности методики. Для построения карты размахов были рассчитаны центральная линия и контрольные границы с использованием формул и коэффициентов, приведенных в таблицах 4-5.

Таблица 4 - Формулы расчета контрольных границ для карт Шухарта

Тип карты

Центральная линия (CL)

Контрольные границы

R – карты

или

X – карты

или

Таблица 5 - Коэффициенты для вычисления линий контрольных карт

Число наблюдений в подгруппе

Коэффициенты для вычисления контрольных границ

А

2

1,128

0,000

3,686

2,121

3

1,693

0,000

4,358

1,732

Расчет проводили с использованием относительного стандартного отклонения, полученного в результате определения прецизионности методики (0,95) (табл. 6).

Таблица 6 - Контрольные границы карты размахов при оценке стабильности показателя прецизионности ВЭЖХ - методики анализа бутоконазола нитрата

Центральная линия (CL)

Предел действия

=1,1280,95=1,07

=0,953,686=3,5

LCL-отсутствует

Карта размахов представлена на рис. 6. Она свидетельствует о том, что разность между значениями открываемости бутоконазола при анализе модельных смесей однородна в течение длительного времени.

Рисунок 6 - Контрольная карта размахов содержания бутоконазола в модельной смеси, полученных в условиях повторяемости

Это позволяет говорить о стабильных показателях прецизионности данной методики. Контрольные границы, рассчитанные для карты, являются численным выражением критериев  робастности.  Можно сделать заключение, что полученные результаты для двух параллельных определений будут являться достоверными, если разница между значениями открываемости не превышает 3,5 %.

Для изучения изменений показателей точности строили карту средних значений, контрольные линии которых приведены в таблице 7.

Таблица 7 - Контрольные границы карты средних значений при оценке стабильности показателя точности

Тип карты

Центральная линия (CL)

Контрольные границы

UCL

LCL

- карта

100+2,1210,95=102,01

100-2,1210,95=97,99

Расчет контрольных границ для ее построения выполняли с использованием относительного стандартного отклонения точности, полученного в результате валидации. Параметры контрольной карты средних значений рассчитывали исходя из того, что истинное содержание вещества в препарате составляет 100%.

Эта карта (рис. 7) показывает, насколько близки полученные результаты к истинному значению. Как видно из представленного рисунка, нежелательные изменения между подгруппами отсутствуют, так как разброс средних значений открываемости однороден. Ни одна из точек не выходит за пределы контрольных границ, и все они расположены равномерно относительно центральной  линии, что говорит о стабильности показателя правильности. Контрольные границы, рассчитанные для данной карты, являются допустимыми границами открываемости методики, которые составляют интервал от 98 до 102%.

Рисунок 7 - Контрольная карта средних значений открываемости бутоконазола в модельной смеси

Таким образом, текущие контрольные карты свидетельствуют об отсутствии значимого влияния «случайных» факторов на результаты анализа.

Аналогичная процедура определения робастности была проведена и для других анализируемых компонентов крема: нипагина и нипазола. Рассчитанные значения для построения контрольных карт приведены в таблице 8. В качестве использовалось относительное стандартное отклонение, полученное в результате определения прецизионности методики.

Таблица 8 - Контрольные границы карт средних значений и размахов при оценке робастности методики анализа нипагина и нипазола в креме  вагинальном

Тип карты

Центральная линия (CL)

Контрольные границы

UCL

LCL

Нипагин

R - карта

1,128·1,362=1,54

3,686·1,362=5,02

Отсутствует

X - карта

100+2,121·1,362=102,89

100-2,121·1,362=97,11

Нипазол

R - карта

1,128·3,06=3,45

3,686·3,06=11,28

Отсутствует

X - карта

100+2,121·3,06=106,49

100-2,121·3,06=93,51

По полученным результатам строили контрольные R- и Х- карты для контроля робастности методики анализа нипагина (рисунки 8-9) и нипазола (рисунки 10-11).

Рисунок 8 – Контрольная карта размахов открываемости нипагина в модельной смеси, полученных в условиях повторяемости

Рисунок 9 – Контрольная карта средних значений открываемости нипагина в модельной смеси, полученных в условиях повторяемости

Рисунок 10 – Контрольная карта размахов открываемости нипазола в модельной смеси, полученных в условиях повторяемости

Рисунок 11 – Контрольная карта средних значений открываемости нипазола в модельной смеси, полученных в условиях повторяемости

Из представленных данных следует, что предложенная ВЭЖХ-методика количественного определения бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола стабильна (робастна) в условиях изменяющегося фактора «время».

Таким образом, предложенная методика количественного определения бутоконазола, нипагина и нипазола является валидной по всем показателям и может быть рекомендована к использованию в серийном анализе.

Выбор условий ВЭЖХ-анализа для определения посторонних примесей в бутоконазоле, креме вагинальном, 20 мг/г

Следующим этапом работы стало изучение возможности использования метода ВЭЖХ для определения посторонних примесей в лекарственном препарате. В оригинальном препарате Гинофорт допускается содержание единичной примеси не более 0,2%, и суммарное содержание примесей не должно превышать 1% по отношению к бутоконазола нитрату.

Выбор условий хроматографирования осуществлялся с использованием растворов субстанции бутоконазола нитрата и модельной смеси. В связи с отсутствием стандартных образцов примесей и невозможности приготовления модельных смесей с последними, бутоконазола нитрат и парабены были подвергнуты деструктированию с использованием хлористоводородной кислоты концентрированной.

Анализируемые образцы подвергали хроматографированию в условиях количественного определения. При этом было установлено, что на хроматограмме раствора бутоконазола нитрата, подвергнутого деструкции, наблюдаются пики, совпадающие по временам удерживания с нипагином и нипазолом на хроматограмме раствора модельной смеси. Этот факт позволяет сделать вывод о непригодности данной хроматографической системы для определения посторонних примесей.

В связи с этим была проведена работа по поиску таких условий анализа, которые позволили бы провести достоверное разделение возможных примесей в препарате в присутствии парабенов. В результате был выбран режим градиентного элюирования с использованием 0,05 М раствора кислоты ортофосфорной: от 20 до 70% ацетонитрила за 50 минут. Типичная хроматограмма деструктированного бутоконазола нитрата в присутствии нипагина и нипазола показана на рисунке 12.

Рисунок 12 – Хроматограмма раствора смеси бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола, подвергнутых деструкции

Как видно на представленном рисунке, все пики предполагаемых примесей отделены друг от друга и от пиков консервантов, что позволяет использовать полученную методику для достижения поставленных целей.

Следует отметить, что количественное определение бутоконазола с использованием данной методики затруднено, поскольку параметры пригодности хроматографической системы для его пика не соответствуют рекомендуемым критериям, а именно: коэффициент асимметрии пика значительно превышает величину 2,5. Пики примесей же, содержащихся в ощутимо меньших количествах, имеют удовлетворительные значения параметров пригодности хроматографической системы и могут быть проанализированы.

Проведенная валидационная оценка предлагаемой методики определения посторонних примесей показывает, что она специфична, и предел обнаружения ее составляет мг/мл. Это позволяет сделать вывод о пригодности ее для использования.

В результате анализа образцов шести серий вагинального крема бутоконазола, которые были предоставлены ЗАО «Валента Фармацевтика», было установлено, что суммарное содержание примесей не превышало 1,0% от массы бутоконазола нитрата в препарате.

Стандартизация Бутоконазола, крема вагинального, 20 мг/г

Нормы качества Бутоконазола, крема вагинального, установленные на 6 сериях с использованием разработанных методик, представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Нормы качества на препарат Бутоконазол, крем вагинальный

Показатель

Метод

Требования

Описание

Визуальный

Масса белого цвета с желтоватым оттенком и  специфическим запахом

Подлинность

ВЭЖХ

Времена удерживания пиков на хроматограмме раствора крема должны совпадать с таковыми на хроматограммах растворов СО: нипагина, бутоконазола нитрата, нипазола

Посторонние примеси

ВЭЖХ

Сумма посторонних примесей должна быть не более 1,0% по отношению к бутоконазола нитрату

Количественное содержание

-Бутоконазол

ВЭЖХ

90-110%

от 18,0 до 22,0 мг/г

-Нипагин

ВЭЖХ

90-110%

от 0,72 до 0,88 мг/г

-Нипазол

ВЭЖХ

90-110%

от 0,18 до 0,22 мг/г

Срок годности

3 года

С учетом выявленных нормативов в условиях естественного хранения изучена стабильность исследуемого препарата и установлено, что срок его годности составляет 3 года.

Исследование  степени всасывания бутоконазола из  различных лекарственных препаратов  и изучение мукоадгезивных свойств изучаемых кремов

Следующим этапом работы стало изучение степени всасывания бутоконазола из  различных лекарственных препаратов  и изучение мукоадгезивных свойств препарата «Бутоконазол, крем вагинальный, 20 мг/г» в сравнении с Гинофортом. В найденных литературных источниках отсутствует информация о методах  обнаружения и изучении накопления бутоконазола нитрата в биологических жидкостях, в частности, плазме крови. В этой связи была изучена возможность использования капиллярного электрофореза для этой цели.

Объектами исследования являлись раствор бутоконазола нитрата 1 мг/мл в 0,5М фосфатном буферном растворе с 50% ацетонитрила, сыворотка крови интактного животного, прошедшая предварительную пробоподготовку, а так же модельная смесь сыворотки с нитратом бутоконазола. Анализ проводили в среде фосфатного буферного раствора с рН 3,6. Условия анализа и типичная электрофореграмма бутоконазола в сыворотке крови представлена на рисунке 13.

Рисунок 13 - Электрофореграмма модельной смеси сыворотки с бутоконазола нитратом, полученная с использованием 0,5М фосфатного буферного раствора

Из рисунка следует, что предложенная методика КЭФ позволяет достоверно определять бутоконазола нитрат в сыворотке крови в присутствии балластных веществ и может быть использована для изучения фармакокинентики бутоконазола нитрата.

Изучение последней проводили на кафедре биологии  и физиологии Пятигорской ГФА на самках белых крыс линии Wistar. Животные были поделены на три группы. Первой и второй группам  вводили интравагинально крем бутоконазола и Гинофорт.  Третьей группе, контрольной, в эквивалентных дозах внутрибрюшинно водили  2,0% раствор бутоконазола нитрата в диметилсульфоксиде. Кровь  для анализа отбирали после декапитации животных через равные промежутки времени. Анализ сыворотки проводили с использованием метода капиллярного электрофореза. В результате эксперимента получили данные о накоплении бутоконазола в сыворотке крови, на основании которых были построены кинетические кривые бутоконазола нитрата при различных способах введения (таблица 9).

Таблица 9 - Величины площадей под кинетическими кривыми

Способ введения

Рассчитанная величина площади под кривой кинетики мкг/мл*ч

Раствор бутоконазола, внутрибрюшинно

148,82

Гинофорт, крем,  интравагинально

79,35

Бутоконазол, крем, интравагинально

99,59

Рисунок 14 - График накопления бутоконазола нитрата в крови крыс

По полученным результатам рассчитывали площади под кривыми (таблица 9), величины которых позволили сделать вывод о том, что  всасывание субстанции из крема бутоконазола сопоставимо с Гинофортом.

По сравнению с раствором субстанции, вводимом внутрибрюшинно, концентрация обнаруженного в крови бутоконазола, всосавшегося со слизистой влагалища из разработанного препарата и прототипа, значительно ниже. Это говорит о том, что препарат системным действием практически не обладает.

Также была проведена работа по оценке времени нахождения крема бутоконазола в органе-мишени по сравнению с Гинофортом. Исследование проводили in vivo. В качестве подопытных животных были выбраны самки беспородных морских свинок. Животным вводили интравагинально крем бутоконазола или Гинофорт. Затем на 2-6 сутки делали смывы с поверхности влагалищ животных. Полученные смывы хроматографировали в условиях количественного определения, затем рассчитывали концентрацию бутоконазола в смыве. Результаты приведены в таблице 10.

Таблица 10 - Результаты определения бутоконазола нитрата в смыве из влагалищ опытных животных. Расчеты (n=6) проводились с использованием уравнения y=7472,3x+14,5

Сутки

Гинофорт

Бутоконазол

Площади пиков

Концентра-ция в смыве, мкг/мл

Найдено во влагалище, мкг

Площади пиков

Концентра-ция в смыве, мкг/мл

Найдено во влагалище, мкг

2

149,8

20,1

40,2

193,65

25,97

51,94

3

134,52

18,0

36

152,14

20,4

40,8

4

63,0

8,4

16,8

86,6

11,6

23,2

5

40,5

5,4

10,8

60,13

8,1

16,2

6

-

-

-

-

-

-

Как следует из представленных данных,  в течение 5 суток после введения  двух изучаемых препаратов во влагалищах морских свинок присутствует бутоконазола нитрат  в сопоставимых количествах. По истечении 6 дней бутоконазол в смыве не обнаруживали. Таким образом, мукоадгезивные свойства изучаемого препарата можно считать сопоставимыми с таковыми для Гинофорта.

Таким образом, в результате проведенных исследований изучено хроматографическое поведение бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола. Разработаны способы контроля качества лекарственного препарата бутоконазола в виде вагинального крема, проведена его стандартизация, изучена стабильность, определены сроки годности. Выбраны оптимальные условия электрофоретического определения бутоконазола в биологических жидкостях, в частности сыворотке крови, проведено сравнительное исследование фармакокинетики, противогрибковой активности и мукоадгезивных свойств предлагаемого препарата  и прототипа  - крема Гинофорт.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

  1. Выбраны оптимальные условия хроматографирования для идентификации и количественного определения бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола при совместном присутствии в вагинальном креме. Определена оптимальная аналитическая область концентраций для проведения количественного анализа компонентов крема.
  2. Разработана ВЭЖХ методика определения посторонних примесей, позволяющая достоверно разделить пики примесей (продукты деструкции бутоконазола) от бутоконазола и парабенов. 
  3. Выполнена валидационная оценка методик количественного определения и обнаружения посторонних примесей в бутоконазоле, креме вагинальном, 20 мг/г, по основным показателям. Расчитан предел обнаружения для бутоконазола нитрата и примесей, который составляет 2,310-3 мг/мл.
  4. Изучена робастность методики количественного определения бутоконазола, нипагина и нипазола с использованием карт Шухарта. Установлено, что в условиях изменяющегося фактора «время» показатели прецизионности и точности результатов анализа остаются стабильными
  5. Выбраны оптимальные условия для анализа бутоконазола с использованием капиллярного электрофореза. Методика может быть использована для изучения накопления бутоконазола в сыворотке крови.
  6. Проведены исследования по накоплению бутоконазола нитрата в сыворотке крыс при различных способах введения. Изучены мукоадгезивные свойства бутоконазола, крема вагинального в сравнении с Гинофортом. В результате исследований установлено, что исследуемые объекты сопоставимы по изучаемым свойствам.
  7. Проведена стандартизация бутоконазола, крема вагинального, 20 мг/г согласно требованиям ОСТа 91500.05.001-00, установлены нормы его качества. Проведено исследование  сроков годности бутоконазола, крема вагинального, 20 мг/г. Установлено, что крем  бутоконазола остается стабильным в течение 3 лет наблюдения.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ

  1. Использование метода капиллярного электрофореза для изучения фармакокинетики бутоконазола нитрата/С.П. Сенченко, К.С. Чеченева, М.В. Гаврилин [и др.]// Хим.-фармац. журн.- 2009.- Т.43, №11. - С.7-10.
  2. Ларская, К.С. Разработка методики определения посторонних примесей в бутоконазоле, креме вагинальном, 20 мг/г методом ВЭЖХ/К.С. Ларская// Естественные и технические науки. –- 2011. -Вып. 54. - №4. - С. 291-294.
  3. Сенченко, С.П. Поиск оптимальных условий анализа бутоконазола нитрата в модельной смеси методом ВЭЖХ/ С.П. Сенченко, К.С. Чеченева, М.В. Гаврилин; под ред М.В. Гаврилина// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2008. Вып. 63. С. 331-333.
  4. Изучение противокандидозной активности бутоконазола, крема вагинального 20 мг/г/ Л.И. Карпеня,  Л.С. Ушакова, М.В. Гаврилин, К.С. Чеченева; под ред М.В. Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - Вып.64.- С.430-432.
  5. Изучение специфической активности бутоконазола, крема вагинального 20 мг/г/ Л.И. Карпеня,  Л.С. Ушакова, М.В. Гаврилин, К.С. Чеченева; под ред М.В. Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - Вып.64.- С.432-434.
  6. Ларская, К.С. Выбор условий одновременного количественного определения бутоконазола, нипагина и нипазола в креме вагинальном, 20 мг/г/К.С. Ларская // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: материалы II-Междунар. науч.-практ. конф..-  Владикавказ, 2011. - Ч.1. - С. 254-258.
  7. Ларская, К.С. Использование метода ВЭЖХ для количественного определения бутоконазола нитрата в присутствии консервантов/К.С. Ларская// Аптека 2007: тез. докл.  научн. конф./ 23-26 окт. 2007 г. -С. 159-160.

ЛАРСКАЯ КСЕНИЯ СЕРГЕЕВНА



РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ АНАЛИЗА БУТОКОНАЗОЛА НИТРАТА В ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ

КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Подписано к печати______ 20__г. Формат бумаги 60х84 1/16.

Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ №

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»(357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.