WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Тарасов Вадим Владимирович

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИМЕРНЫХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ ПРЕПАРАТОВ НЕЙРОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ

14.04.01 - Технология получения лекарств

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва 2012

Работа выполнена  в  ГБОУ  ВПО  Первый  Московский государственный медицинский  университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук,

профессор          Краснюк Иван Иванович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, начальник лаборатории химико-фармацевтических препаратов №1 Испытательного центра ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»  Минздравсоцразвития России

  Боковикова Татьяна Николаевна

доктор фармацевтических наук, ведущий специалист отдела обеспечения качества ЗАО «Ретиноиды» 

Гузев Константин Сергеевич

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» РАСХН.

Защита состоится «20» июня 2012 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при  Первом Московском  государственном  медицинском университете имени И.М. Сеченова по адресу: 119991 г. Москва ул. Трубецкая, д.8, стр. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной  медицинской библиотеке Первого МГМУ им. И.М.Сеченова по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан «11» мая 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор фармацевтических наук,

профессор                                                        Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

 

Актуальность темы

Современный ритм жизни, неблагоприятные экологические условия, сложная социальная обстановка в мегаполисах приводят к увеличению числа нервно-психических расстройств непсихотического типа («пограничных состояний»), и, как следствие, увеличение потребления препаратов нейротропного действия, таких как анксиолитики, препараты снотворного действия, психостимуляторы.  При этом эффективность терапии во многом остается недостаточной, что объясняется следующими причинами. С одной стороны, длительный прием таких препаратов, как бензодиазепины,  приводит к развитию толерантности, что, в свою очередь, влечет за собой увеличение количества принимаемого препарата и, соответственно, как следствие, усиление токсического действия. С другой стороны, большинство лекарственных веществ, обладают неселективным действием и в незначительной степени проникают через ГЭБ.

Одним из способов решения данной проблемы является использование высокоселективных  нейротропных веществ, к числу которых относятся соединения  эндогенного происхождения, в частности пептидной структуры или их искусственные аналоги. Эндогенные пептиды обладают высокой селективностью действия к определенным группам рецепторов, подвергаются естественной биологической деградации и не оказывают токсического эффекта на организм. В этой связи разработка пептидных препаратов для терапии пограничных состояний является перспективным направлением фармакологии и фармацевтической технологии.

Однако, использование лекарственных средств на основе пептидов связано со сложностями, в частности с протеолизом пептидазами крови при введении  в организм.

Возможный способ решения данной проблемы – создание наноразмерных систем доставки. Наночастицы позволяют осуществить доставку веществ направленно: внутрь клеток, через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и т.п.. При этом обеспечивается защита сорбированного или включенного в наночастицы вещества от воздействия агрессивных факторов внутренней среды организма, таких как хлористоводородная кислота и ферменты, входящие в состав желудочного сока; от разрушения протеазами крови и др.,  что позволяет увеличивать эффективность препарата.

Перенос через ГЭБ актуален для такого вещества, как рекомбинантный эритропоэтин человека (РЭЧ), способного предотвращать гибель нейронов in vitro и  in vivo, однако высокая молекулярная масса и  значительная степень гликозилирования молекулы РЭЧ существенно снижают его проникновение в мозг при внутривенном введении.

Использование наноразмерных носителей актуально и при применении традиционных анксиолитиков бензодиазепинового ряда, в частности феназепама, т.к. позволяет снизить присущие им нежелательные эффекты: миорелаксацию и седацию.

Таким образом, в работе предлагается использовать преимущества наноразмерных форм препаратов для повышения эффективности новых и традиционных лекарственных препаратов нейротропного действия, а также снижения выраженности нежелательных эффектов.

               Цель исследования

       Теоретически и экспериментально обосновать технологические и фармакологические аспекты применения наноразмерных систем доставки препаратов нейротропного действия.

       Задачи исследования

  1. Разработать подходы к целенаправленному синтезу пептидов с анксиолитическими свойствами.
  2. Разработать технологию получения наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.
  3. Разработать подходы к стандартизации  наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.
  4. Изучить основные технологические факторы, влияющие на получение наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.
  5. Провести сравнительное фармакологическое изучение полученных наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.

               Научная новизна результатов исследования

В результате проведенных исследований синтезирован оригинальный тетрапептид (ТП) структуры Phe--Ala-Gly-Trp-NH2 и показана его анксиолитическая активность, получен патент «Тетрапептид, обладающий анксиолитическим действием» (№2429003 от 20.09.2011).

Впервые на основе комплекса  физико-химических, технологических и биофармацевтических исследований  разработаны составы наночастиц  (НЧ) на основе полибутилцианоакрилата (ПБЦА) с тетрапептидом и феназепамом, получена экспериментальная форма наночастиц с эритропоэтином на основе ПБЦА, а также разработаны технологические схемы получения стабильных лиофилизатов наночастиц тетрапептида и феназепама.

Изучены физико-химические и технологические характеристики полученных экспериментальных наносомальных форм тетрапептида, феназепама и рекомбинантного эритропоэтина человека.

Изучена специфическая активность полученных экспериментальных форм на лабораторных животных. Показано, что применение наночастиц тетрапептида Phe--Ala-Gly-Trp-NH2 обеспечивает повышение анксиолитической активности и пролонгирование действие вещества в сравнении с субстанцией, а в случае использования наноносителей феназепама снижение нежелательных миорелаксантного и седативного действия при сохранении выраженного анксиолитического эффекта.

На модели ПБЦА-НЧ с рекомбинантным эритропоэтином  человека показано, что использование наночастиц, нагруженных биологически активными веществами, обеспечивает  их доставку через неповрежденный ГЭБ при внутривенном введении.

               Практическая значимость полученных результатов

На основании проведенных исследований  разработаны:

  • Оригинальное лекарственное вещество – тетрапептид структуры: Phe--Ala-Gly-Trp-NH2;
  • Состав экспериментальной лекарственной формы наночастицы с феназепамом (лиофилизат для инъекций)
  • Состав наноразмерной формы тетрапептида анксиолитического действия  (лиофилизат для приготовления назальных капель);
  • Состав наноразмерной формы рекомбинантного эритропоэтина человека;
  • Технология получения лиофилизата наночастиц тетрапептида (Лабораторный регламент, апробированный в лаборатории биологически-активных соединений НИИ фармации).

Положения, выносимые на защиту

  • результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию стратегии синтеза соединения – тетрапептида  Phe--Ala-Gly-Trp-NH2 , а также состава и технологии получения его экспериментальной формы с наночастицами;
  • результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию состава и технологии получения экспериментальной формы феназепама с наночастицами;
  • результаты  теоретических и экспериментальных исследований  по разработке  технологии получения наноразмерной формы эритропоэтина;
  • результаты исследований физико-химических и технологических характеристик полученных наноразмерных форм биологически-активных соединений;
  • результаты изучения специфической активности полученных наноразмерных форм на лабораторных животных.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на заседании №4 от 15.11.2011 межкафедральной  научно-практической конференции на кафедре фармацевтической технологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

Положения и практические результаты работы доложены на VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность (Москва, 2009 г.).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической  реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 – Технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств.

Связь задач исследования с проблемным планом

Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер Государственной регистрации 01.2.00606352).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ полностью отражающих ее содержание, в том числе 2 статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ и патент «Тетрапептид, обладающий анксиолитическим действием» (№2429003 от 20.09.2011).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 183  страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы  «Материалы и методы», экспериментальной части  (результаты собственных исследований  и их обсуждение), выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 53 рисунками.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе (обзор литературы), представлены основные направления в области разработки и применения препаратов пептидной структуры, фармацевтических нанотехнологий; оценивается перспективность применения пептидов и наночастиц в качестве потенциальных лекарственных средств, а также возможности модификации препаратов, применяющихся в клинической практике.

Во второй главе (материалы и методы) изложены материалы и методы, использовавшиеся при проведении технологических исследований по получению наноразмерных форм, изучению их фармакологической активности.

В третьей главе (результаты собственных исследований) представлены полученные в ходе экспериментальной работы данные по разработке наноразмерных форм препаратов нейротропного действия, а также дано подтверждение их эффективности на моделях с лабораторными животными.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

       Экспериментальная часть исследования проводилась в лаборатории биологически-активных соединений НИИ фармации ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

Методы исследования

1 Методы синтеза, идентификации и количественного определения тетрапептида в субстанции и экспериментальных формах

1.1 Методика синтеза тетрапептида

Синтез тетрапептида с аминокислотной последовательностью Phe--Ala- Gly-Trp-NH2был выполнен на твердой фазе с использованием пептидного синтезатора Applied Biosystems 433А, применяли Fmoc-стратегию.

1.2 Анализ структуры и чистоты пептида

Проводили методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором на аналитической колонке (хроматограф Agilent Technologies 1200, США) путем измерения времени удерживания для главного пика, которое затем сравнивали с расчетным. Пробу пептида растворяли в смеси ацетонитрил : тетрагидрофуран : вода в соотношении 40:40:20 и анализировали методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием, при этом влияние растворителя (1% АсОН в воде) оценивали по хроматограмме, полученной  в первую  минуту  наблюдения как при  положительных ионах (0,5 мин), так и в отрицательных ионах (0,5 мин).  Масс спектр пептида получали прямым вводом с электроионизацией в режиме снятия положительных ионов.         

1.3 Методика очистки тетрапептида

Очистку проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Условия ВЭЖХ: колонка Waters DeltaPak, C18, 5 м, 100 , 3,9 x 150 мм; детекторная ячейка: аналитическая; скорость потока – 1.0 мл/мин; длина волны: 214 нм; диапазон детектирования: 0,5 AUFS; величина петли: 100 л (петля заполняется 150 [± 10] л образца, объем впрыска = 100 л); элюент A: 5.0% ацетонитрила, 0.1% трифторуксусной кислоты, в воде; элюент В: 60% ацетонитрила, 0.085% трифторуксусной кислоты, в воде; градиент: 0-60% B в течение 60 мин.

1.4 Методика определения степени сорбции тетрапептида на НЧ

Степень сорбции ТП (%) на поверхности наночастиц определяли как отношение количества ТП, связанного с наночастицами, к общему количеству ТП, введенного в полимеризационную среду по следующей формуле:

%= С(а) - С(f) где, 

С(а)

С(а) – исходная концентрация ТП в суспензии,  С(f) – концентрация ТП в супернатанте.

Для расчета % свободный и связанный ТП сепарировали методом ультрацентрифугирования в течение 30 минут при 80000 g (центрифуга BECKMANMODELL 5, USA). Концентрацию ТП в супернатанте определяли методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором.

2 Методы идентификации и количественного определения феназепама в субстанции и экспериментальных формах

2.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография

Для проведения  качественного анализа использовали хроматограф жидкостный – 1200 («Agilent Technologies», США) с  фотодиодно-матричным детектором.

Условия хроматографирования: Колонка Zorbax SB-C18,5мкм, 50*4,6мм. Подвижная фаза : ацетонитрил/раствор додецилсульфата натрия в воде (3,5мМ), подкисленной ортофосфорной кислотой (0,1%)-37/63 % об.

2.2 Спектрофотометрический анализ субстанции феназепама

Концентрацию феназепама в НЧ определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-121 «ЛОМО» (спектральный диапазон от 200 до 760 нм). Для построения калибровочного графика, измеряли оптическую плотность феназепама в растворе диметилсульфоксида (ДМСО) и находили максимум поглощения феназепама в р-ре ДМСО для последующих измерений концентраций феназепама в образцах.

3 Методы изучения свойств наночастиц

3.1 Определение размера наночастиц.

Размер определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии (наносайзер Coulter N4MD, Coulter Electronics, U.K). Лиофилизат из 1 мл растворяли в 2 мл воды, отбирали аликвоту (50 мкл) и помещали в кювету, содержащую 3 мл бидистиллированной воды. Величину частиц определяли немедленно при следующих рабочих параметрах: scattering angle 900, температура 250С, вязкость 0,01 пуаз., показатель преломления 1,333.

3.2 Сканирующая электронная микроскопия

Для изучения структуры наночастиц применяли сканирующую электронную микроскопию, работу выполняли  на приборе «JEOL JSM-T330» (Япония) при напряжении 20 кВ. При приготовлении образец суспензии наночастиц 0,2 мл помещали на стеклянную подложку. После высушивания на образец напыляли тонкий слой коллоидного золота (толщиной порядка 70) при помощи прибора «JEOL JFS -1100» (Япония).

4 Изучение специфической активности

4.1 Методика изучения анксиолитического эффекта

Анксиолитическое действие изучали в тесте «драка животных». Исследования проводили на белых беспородных мышах самцах, массой 20-25 г. Животных делили на три группы по 10 особей в каждой. Поведение мышей  на электродном полу изучали по изменению порогов агрессивной реакции. Пороги определяли при раздражении пары мышей постепенно увеличивающимся по силе прерывистым электротоком, подаваемым на электродный пол камеры [Т.А. Воронина, С.Б. Середенин. Методические указания по изучению анксиолитического действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. Р.У. Хабриева. М.: Медицина, 2005. С. 253-263].

4.2 Методика изучения седативного эффекта

Седативное действие оценивали с помощью метода «открытое поле» [Т.А. Воронина, С.Б. Середенин. Методические указания по изучению анксиолитического действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. Р.У. Хабриева. М.: Медицина, 2005. С. 253-263.].

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Синтез оригинального тетрапептида анксиолитического действия

1.1 Разработка подходов к целенаправленному синтезу пептида

Стратегия конструирования биологически-активных веществ пептидной структуры основана на расшифровке аминокислотной последовательности эндогенных пептидов, обнаружении биологически-активных фрагментов, соответствующих рецептору, и выявлении действующей конформации пептида (Гудашева Т.А., 2003). Обычно дизайн оригинальных пептидомиметиков разрабатывают посредством оптимизации исходного пептида за счет замены функциональных групп в аминокислотных остатках, компонентов основной последовательности. Важную роль играет определение структуры белка-рецептора, мест связывания его с лигандом, механизма его функционирования. Используя разработанную (на основании соединений с известной активностью) количественную модель “структура-активность” (QSAR - Quantitative Structure-Activity Relationship), предсказывающую необходимые структурные формулы, ограничивали круг синтезируемых соединений в поиске БАВ. В итоге по структурной формуле соединения аналога прогнозируются его агонистические или антагонистические свойства. Таким образом, создается модель, содержащая в себе важную структурную информацию, необходимую для достижения оптимальной биологической активности. Эта модель может служить стартовым началом для создания новых пептидомиметиков (Шульгин С.В., 2008).

Связывание молекулы ССК-4 с рецептором ССК2  обусловлено принятием ею определенной биологически активной конформации (БАК) (Никифорович Г.В. и др., 1983), . Методами молекулярного моделирования была получена вероятная БАК ССК-4. Она характеризовалась свернутой Z-образной конформацией пептидной цепи, тремя внутримолекулярными водородными связями, наличием С-концевой протонированной амидной группы (-С(О)-NH3+), сближением «активных» групп (-СОО-группы Asp32 и NH3+-группы Phe33)  и образованием водородной связи между их атомами.

Для создания аналогов ССК-4 с анксиолитической активностью был применен топохимический принцип, сформулированный в 1969 году Шемякиным М.М., Овчинниковым Ю.А. и Ивановым В.Т. Согласно этому принципу пептид, состоящий из D-аминокислот (АК), расположенных в порядке, обратном природному, и исходный пептид из L-аминокислот могут обладать одинаковой активностью.

В результате анализа этого принципа было сделано предположение, что только обращение конфигурации  всех аминокислотных остатков (АКОС) пептида, либо только изменение направления хода пептидной цепи с сохранением конфигурации АКОС приведёт к обращению знака биологической активности. Таким образом, в результате применения топохимического принципа к структуре ССК-4 (L-Trp-L-Met-LAsp-L-Phe-NH2) был сконструирован его ретро-аналог L-Phe-L-Asp-L-Met-L-Trp-NH2, структура которого легла в основу будущего нового анксиолитика.

Решением задач  исследования явился синтез пептида-анксиолитика, аналога холецистокинина-4 (ССК-4). Основываясь на данных Moran T.H. 1968, Smadja C. 1995, Kayser V. 1998, определили, что индолильный и фенильный фрагменты боковых радикалов аминокислот триптофана (Trp) и фенилаланина (Phe) являются главными фармакофорными элементами, участвующими в гидрофобном взаимодействии с рецептором. Эти аминокислоты были сохранены в разработке аналога ССК-4. Для соединения этих аминокислот использовали  безрадикальный спейсер, состоящий из -аланина (-Ala) и глицина (Gly). Такие фрагменты молекулы позволяют получить желаемую конформацию молекулы и повысить биологическую активность молекулы пептида. Таким образом, в качестве аналога ССК-4 синтезирован тетрапептид Phe--Ala-Gly-Trp-NH2

1.2 Подтверждение структуры тетрапептида

Для подтверждения структуры тетрапептида использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате проведенного эксперимента были получены следующие данные, представленные на Рис.1. и Рис.2

Рис.1 Масс-хроматограмма пептида Phe--Ala-Gly-Trp-NH2

Рис.2 Масс-спектры пептида Phe--Ala-Gly-Trp-NH2

Представленные данные на Рис. 1 и  Рис.2 подтверждают, что полученное соединение соответствует предполагаемой структуре. Масса  пептида Phe--Ala-Gly-Trp-NH2 – 478.

2 Разработка технологии получения и состава наноразмерных форм

В настоящее время среди систем для адресной доставки лекарственных препаратов особый интерес представляют полимерные наночастицы (НЧ) размером от 10 до 1000 нм, сочетающие такие важные для носителей качества, как стабильность и высокая емкость в отношении широкого спектра лекарственных веществ. При размере менее 1000 нм, наночастицы способны проходить через мельчайшие капилляры тела, а также проникать в различные органы, способствуя переносу лекарственных веществ.

С целью обоснования оптимального состава и технологии  наночастиц были изучены физико-химические и технологические свойства тетрапептида, феназепама и РЭЧ, что позволило сделать предположение о  перспективности  выбора  полимеризационных методов изготовления наночастиц, позволяющих использовать устойчивые в кислой среде вещества, а также их способность сорбироватся на поверхности полимера.

Для получения наноразмерных форм был выбран бутилцианоакрилат, обладающий низкой токсичностью, эффективно сорбирующий биологически-активные вещества. В водной среде наночастицы из полибутилцианоакрилата (ПБЦА-НЧ) , размером 150-500 нм, образуют коллоидные системы, которые могут быть использованы для парентерального, интраназального и других путей введения.

Ввиду поликомпонентности составов, исследуемых при получении наночастиц,  в качестве определяющих критериев качества были выбраны: размер наночастиц, степень включения/сорбции веществ в наночастицы,  наличие агломератов в наноразмерной системе и стабильность образующейся наносуспензии.

Для получения наночастиц использовали методику анионной полимеризации в водной среде, позволяющую варьировать значительное количество технологических параметров, среди которых рН дисперсионной среды, концентрация поверхностно-активных веществ (ПАВ), продолжительности инкубации, концентрации полисорбата-80 (ПС-80).

Одним из важнейших параметров для получения наночастиц является рН дисперсионной среды. При  значениях рН более 3,5 полимеризация проходит слишком быстро, молекулярная масса остается на определенном уровне, начинается агломерация частиц. При  рН ниже 1,5 полимеризация проходит медленно, наночастицы увеличиваются за счет свободного мономера, что также приводит к агрегации.  Ниже представлены результаты измерения размеров наночастиц (Рис. 3) на основе бутилцианоакрилата в образцах, полученных в диапазоне рН 1,9-3,0. Аппроксимация была проведена способом линейного сглаживания (у=тх+b), причём величина достоверности (R2) больше 0.8 линейного (R2 = 0.8764).

Рис. 3  Зависимость между уровнем рН полимеризационной среды и средним размером формирующихся наночастиц

Выявленная зависимость размера наночастиц от рН реакционной среды позволила ограничиться именно этим интервалом значений рН (1,93), который обеспечивал возможность синтеза ПБЦА-НЧ заданного размера (190500 нм). Из данных, представленных на Рис. 3 видно, что снижение рН среды с 3 до 1,9 приводило к повышению среднего размера наночастиц с 231±17 до 541±23 нм.

3 Исследование морфологической структуры наночастиц

Структура  ненагруженных наночастиц, а также образцов с максимальной сорбцией была изучена методом электронной микроскопии. Установлена высокая степень полидисперсности наночастиц из ПБЦА, наличие агломератов  и обнаружено, что отдельные наночастицы имеют правильную шаровидную форму (Рис. 4 и 5) и значительно различаются по величине и плотности, причем плотность крупных частиц значительно выше плотности мелких. Некоторые частицы ассоциированые в агрегаты могут быть соединены между собой фибриллярным материалом.

Рис. 4 Трансмиссионная электронная микроскопия суспензии ненагруженных ПБЦА-НЧ

Рис. 5 Трансмиссионная электронная микроскопия суспензии ПБЦА-НЧ с сорбированным тетрапептидом

4 Разработка технологии получения наночастиц с тетрапептидом

Степень сорбции вещества на наночастицах зависит от ряда факторов, в частности от размера, типа и концентрации поверхностно-активного вещества, вводимого при формировании частиц, продолжительности инкубации, и концентрации полисорбата-80, вводимого после сорбции вещества на поверхности.

Анализируя данные представленные на Рис. 6, можно отметить, что степень сорбции для тетрапептида зависит от размера частиц. При этом максимальные значения сорбции тетрапептида достигаются в диапазоне 231-311 нм. По результатам экспериментов для дальнейших исследований были выбраны частицы размером 311±23 нм, полученные при рН=2,6.

Рис. 6 Зависимость степени сорбции тетрапептида от размера наночастиц

Оценку влияния природы ПАВ, а также их концентрации на характеристические параметры образования наноразмерных частиц и степень сорбции тетрапептида, использовали полоксамер-188 и полисорбат-80 (ПС-80) в диапазоне концентраций 0,5-1,5%. Полученные данные представлены на Рис 7.

Рис. 7 Зависимость степени сорбции тетрапептида от типа и концентрации ПАВ

Полученные экспериментальные данные позволили сделать вывод о целесообразности использования полоксамера-188 в концентрации 1% , обеспечивающем получение НЧ  со средним размером 311±23 нм.  Полученную суспензию фильтровали через фильтр Millipore Millex HA  (450 нм). Фильтрат собирали и передавали на следующую стадию. Осадок на фильтре, состоящий из агломератов полимера, полоксамера-188 растворяли в ацетоне и отбрасывали. Суспензию наночастиц нейтрализовали 0,1 М р-ром NaOH до рН=7,0 и центрифугировали 50 мин при 20000 g (центрифуга J21, Beckman). Далее, методом декантации удаляли надосадочную жидкость (водную фракцию). Центрифугированные наночастицы разводили водой очищенной, вводили криопротектор D-маннитол 3%  по массе и перемешивали на магнитной мешалке в течение 15 мин при скорости 500 об/мин до его равномерного распределения. Затем частицы передавали на стадию инкубации.

Одним из важнейших параметров, влияющих на степень сорбции тетрапептида, является продолжительность инкубации с наночастицами. Во время инкубации вводят полисорбат-80, препятствующий процессу опсонизации наночастиц и захвату клетками ретикуло-эндотелиальной системой (РЭС), а также способствующий проникновению наночастиц через гемато-энцефалический барьер. Помимо положительных качеств указанных выше, вводят полисорбат-80 обладает сильными десорбирующими свойствами, что приводит к снижению сорбции тетрапептида на полимере. В связи с этим, следующий этап исследований по разработке технологии получения НЧ был посвящен поиску оптимальной концентрации твина-80 в реакционной среде.

Рис. 8 Зависимость степени сорбции тетрапептида от продолжительности инкубации с ПБЦА-НЧ

В результате экспериментов было установлено, что оптимальная концентрация ПС-80 составляет 0,2% по массе, а  длительность  процесса инкубации НЧ с веществом составляет 16 ч, при этом  максимальная степень сорбции достигает 67,2±3,7% (Рис. 8).

Оценку специфической активности полученных образцов наночастиц с тетрапептидом изучали на лабораторных животных – белых беспородных крысах самцах, массой 200-250 г.

Результаты исследований представлены на Рис. 9 и Рис. 10. 

Рис. 9 Изменение анксиолитической активности ТП-НЧ в сравнении с отрицательным и положительным контролем

* - различие с отрицательным контролем (0,9% р-р NaCl) достоверно при p < 0,05;

# - различие с положительным контролем (тетрапептид) достоверно при p < 0,05

Рис. 10 Изменение выраженности анксиолитической активности ТП и ТП-НЧ внутри группы

* - различие со столбцом «до введения» достоверно при p < 0,05

В ходе проведения исследований выявлены отличия в активности образцов: через час после введения препаратов у контрольной группы отмечали снижение сопротивляемости животных с 64±5 до 52±3 В, 1% р-р тетрапептида увеличивал сопротивляемость животных к напряжению с 67±4 до 81±6 В, а ТП-НЧ с 65±6 до 97±5 В. Через два часа у контрольной группы снижалась сопротивляемость до 45±3, у группы, получавшей ТП, напряжение оставалось статистически более высоким, чем было до введения. Животные, получавшие ТП-НЧ вступали в драку лишь при 92±4 В, что достоверно выше, чем в группе с ТП. После трех часов наблюдений в группе, получавшей ТП анксиолитический эффект не  регистрируется, в то время как у группы, получавшей ТП-НЧ присутствует выраженный анксиолитический эффект.

5 Разработка технологии получения наночастиц с феназепамом

Для разработки оптимальной технологии получения наночастиц с феназепамом важно было определить ряд параметров,  в частности зависимость степени включения от рН среды, времени введения субстанции после начала полимеризации, соотношения вещество/органический растворитель, нагрузку на полимер.

Влияние рН среды на степень включения феназепама представлено на Рис. 10. Отмечается, что при повышении рН с 2,11 до 3 степень включения феназепама падает. Полученные данные могут быть объяснены следующим: повышение рН дисперсионной среды ускоряет процесс формирования наночастиц, соответственно, при рН~3 к моменту введения феназепама в суспензию  большая часть наночастиц уже в основном сформирована, и диффузия ФЗ внутрь частицы затруднена. В этом случае включение становится менее эффективным. В связи с этим, в дальнейших экспериментах была проведена полимеризация при значении рН 2,11, когда степень включения максимальна. При более высоких значениях рН быстрее достигается равновесие, как по размеру, так и по молекулярной массе.

Важным технологическим параметром также является период технологического процесса, при котором вводится субстанция феназепама. При получении наночастиц методом анионной полимеризации основная часть мономера полимеризуется при рН 2 в диапазоне 30-60 минут, при рН 2,5 и 3 – еще быстрее.

 

Рис. 11 Зависимость степени включения феназепама от рН среды

Полученные данные можно интерпретировать следующим образом: при введении феназепама в промежутке 30-45 мин после начала полимеризации происходит их активное включение в матрикс наночастиц. К 60 мин, когда процесс формирования частиц в основном закончен, диффузия лекарственного вещества внутрь наночастиц затруднена. Введение субстанции феназепама в ацетоне на 45 мин после начала полимеризации можно считать оптимальным и обеспечивающим максимальную степень включения в матрикс наночастиц, что и подтверждено результатами эксперимента, приведенными на Рис. 11.

Рис. 11 Зависимость степени включения феназепама от времени введения субстанции после начала полимеризации.

Введение нерастворимых веществ в методике анионной полимеризации проводят при помощи метода «испарения растворителя». Нерастворимое вещество, в частности феназепам, растворяется в ацетоне и вводится в систему с наночастицами. При этом соотношение феназепам/органический растворитель оказывает влияние на степень включения вещества в матрикс частиц. Это связано со скоростью испарения растворителя и переходом ФЗ из ацетона в дисперсионную среду.

В результате проведенных экспериментов был сделан вывод, что степень включения ФЗ в наночастицы зависит от соотношения компонентов, при этом оптимальными соотношениями феназепам/ацетон (мг/1 мл) являются 10:1 и 20:1, что объясняется относительно быстрым испарением ацетона из системы. С целью минимизации использования органического растворителя для дальнейшей работы было выбрано соотношение компонентов 20 мг феназепама в 1 мл ацетона (Рис. 12).

Рис. 12 Влияние соотношения компонентов феназепам/ацетон на степень включения.

Одним из основных критериев оценки качества наносомальных форм является нагрузка субстанции на полимер. После выявления основных технологических параметров была изучена степень нагрузки на полимер в полученной наносомальной форме (Рис. 13) и выявлено, что максимальная нагрузка феназепама на бутилцианоакрилат составляет 30 мг/100 мкл.

Рис. 13 Зависимость степени включения феназепама от количества вводимой субстанции

Таким образом, в ходе экспериментов разработана оптимальная технология получения наночастиц с феназепамом, позволяющая получать наночастицы со степенью включения 85,7%±4,5, степенью нагрузки феназепама на полимер 280-310 мг/г полибутилцианоакрилата при размере частиц 225±24,5 нм.

Исследование седативного и анксиолитического действия феназепама как в виде ПБЦА-НЧ, так и виде субстанции изучали на экспериментальных животных – белых беспородных крысах-самцах массой 200-250 г, при введении его внутрибрюшинно  в дозах 0,5 и 1 мг/кг  соответственно (Рис. 14 и 15).

Рис. 14 Анксиолитическое действие ПБЦА- НЧ с феназепамом и феназепама- субстанции в тесте конфликтной ситуации в дозе 0,5 и 1 мг/кг в опытах на крысах

* - различие с контролем достоверно при p <0,05

Рис. 15  Седативное действие ПБЦА НЧ с феназепамом и феназепама в субстанции в тесте открытое поле в дозе 1 мг/кг в опытах на крысах

* - различие с контролем достоверно при p <0,05

В ходе экспериментальных исследований было выявлено, что феназепам в субстанции в дозе 0,5 и 1 мг/кг  обладает выраженным анксиолитическим эффектом в тесте конфликтной ситуации, седативным действием в тесте открытого поля и вызывает нарушение координации движений в тесте вращающегося стержня.

Феназепам, включенный в матрикс наночастиц, в дозах 0,5 и 1 мг/кг оказывал анксиолитический эффект сходный по выраженности с феназепамом - субстанцией в тесте конфликтной ситуации. Однако, его проявление было более выраженным при сравнении  образцов препарата вводимых в одинаковых дозах (Рис. 14) В то же время седативный эффект, определенный по угнетению поведения в тесте «открытое поле», приведении  ПБЦА НЧ с феназепамом в дозе 1 мг/кг не выявлен (Рис. 15).

6 Разработка и фармакологическое изучение наноразмерной формы РЭЧ

Получение наноразмерной формы рекомбинантного эритропоэтина человека (РЭЧ) проводили аналогично получению тетрапептида. В результате были найдены оптимальные технологические параметры, позволяющие получать ПБЦА-НЧ с сорбированным РЭЧ. При этом степень сорбции составляет 46±6,3%, нагрузка на полимер составляет 195-230 мг/г полибутилцианоакрилата, размер частиц 329±26 нм.

В результате измерения концентрации РЭЧ в образцах тканей мозга экспериментальных животных, отобранных на 45 минуте после введения тестируемых веществ и комбинаций, было обнаружено статистически достоверное увеличение уровня РЭЧ в мозге мышей, получавших РЭЧ, сорбированный на ПБЦА-наночастицах, покрытых ПС-80, в сравнении с группой контроля (группа животных, получавших 0,9% раствор натрия хлорида) (Табл. 1).

Наименование образца

Физиологический раствор

ПБЦА-НЧ

РЭЧ

РЭЧ-ПС-80

РЭЧ ПБЦА

Концентрация нг/мл

0,2±0,1

0,3±0,2

1,8±0,4

2,2±0,7

6,2±0,9*

Табл. 1 Содержание РЭЧ в тканях головного мозга экспериментальных животных после внутривенного введения разных форм РЭЧ  ( * - статистически достоверное отличие  от группы физиологического раствора t критерий Стьюдента p<0,01 n=14 ). 

В группе 2 (ПБЦА-наночастицы) увеличения концентрации РЭЧ по сравнению с группой 1 не наблюдали. В группе животных, получавших водный изотонический раствор РЭЧ, статистически значимого увеличения уровня РЭЧ в ЦНС экспериментальных животных не отмечали (рис 3). В группе 4 (РЭЧ-ПС80) отметили устойчивую тенденцию к росту уровня РЭЧ в тканях мозга мышей, однако статистически достоверной разницы не наблюдали.

Таким образом установлено, что ПБЦА-НЧ обеспечивают доставку РЭЧ через неповрежденный ГЭБ при внутривенном введении, достоверно увеличивая его содержание в тканях мозга мышей.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

  1. Разработаны подходы к целенаправленному синтезу пептидов с анксиолитическими свойствами, синтезирован тетрапептид Phe--Ala-Gly-Trp-NH2, выявлена его анксиолитическая активность.
  2. Разработаны подходы к стандартизации наноразмерных форм, выявлены основные параметры определяющие качество полученных наноразмерных форм: размер частиц, степень включения/сорбции действующего вещества, агрегационная устойчивость.
  3. Разработана технология получения наноразмерных форм препаратов  нейротропного действия: ПБЦА-НЧ феназепама со степенью включения 85,7%±4,5; ПБЦА-НЧ тетрапептида структуры Phe--Ala-Gly-Trp-NH2 со степенью сорбции  биологически активного вещества 67,2±3,7%; ПБЦА-НЧ эритропоэтина со степенью сорбции - 46±6,3%. Выявлено, что частицы с включенным феназепамом и сорбированным тетрапептидом устойчивы при хранении в течение 27 месяцев при температурах +4о С и +20о С.
  4. Изучены основные технологические факторы, влияющие на получение наноразмерных форм препаратов нейротропного действия. Выявлено, что среди факторов, оказывающих влияние на получение наноразмерных форм существенно влияют: значение рН полимеризационной среды, соотношение полимер/растворитель, скорость и продолжительность перемешивания в процессе полимеризации, время введения субстанции (для феназепама), продолжительность инкубации и концентрация полисорбата-80 (для тетрапептида и эритропоэтина).
  5. В ходе проведенных исследований выявлена способность ПБЦА наночастиц статистически достоверно увеличивать анксиолитическую активность тетрапептида и пролонгировать действие; установлено изменение спектра нейропсихотропного действия наноразмерной формы феназепама (отсутствие миорелаксантного и седативного эффектов); показана способность наноразмерной формы облегчать транспорт эритропоэтина через гематоэнцефалический барьер.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Тарасов В.В., Павлова Л.А., Краснюк И.И. Снижение негативных эффектов феназепама путем создания наносомальной лекарственной формы. // Сборник материалов VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». – 2009. – С. 219-220
  2. Тарасов В.В., Белушкина Н.Н., Дегтярева О.Г. и др. Разработка наноформ препаратов антиагрегационного действия на основе RGD-пептидов. // Сборник тезисов и статей «Наномедицина и нанотоксикология». – 2009. – С. 4-6
  3. Тарасов В.В., Павлова Л.А., Краснюк И.И., Аляутдин Р.Н. Создание и исследование наноразмерных лекарственных форм для анксиолитиков пептидной структуры. // Сборник тезисов и статей «Наномедицина и нанотоксикология». – 2009. – С. 24-26
  4. Тарасов В.В., Дегтярева О.Г., Павлова Л.А., Краснюк И.И. Перспективы применения препаратов пептидной структуры в патоэндосаногенетической терапии тревожных расстройств // Клиническая патофизиология. 2011. № 1-3. С. 18-28
  5. Тарасов В.В., Солев И.Н., Елизарова О.С., Балабаньян В.Ю., Аляутдин Р.Н.. Применение полимерных систем доставки для направленного транспорта рекомбинантного эритропоэтина человека через гемато-энцефалический барьер // Естественные и технические науки. - 2011. № 5. С. 196-201
  6. Тарасов В.В., Солев И.Н., Елизарова О.С., Балабаньян В.Ю., Аляутдин Р.Н.. Разработка технологии получения наноформ рекомбинантного эритропоэтина человека // Фармация. 2011. №6. С. 36-38
  7. Патент № 2429003 от 20 сентября 2011 г. Тетрапептид, обладающий анксиолитическим действием. Опубликован: 20.09.2011. Бюл. № 26. Авторы: Белушкина Н.Н., Ковтун А.Л., Махлай А.А, Павлова Л.А., Петров В.Е., Ульянов А.М., Дегтярева О.Г., Гайдуков И.О., Тарасов В.В.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.