WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Тумилович Екатерина Юрьевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИЦИКЛОВЕРИНА ГИДРОХЛОРИДА И ТРОПИКАМИДА В МОЧЕ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:        кандидат фармацевтических наук, доцент

Карпенко Юлия Николаевна

Официальные оппоненты:        доктор фармацевтических наук, профессор,

Ярыгина Татьяна Ивановна

ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

доктор химических наук, профессор

Прибыткова Людмила Николаевна

ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «18» сентября 2012 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru «___» июля 2012 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России http://www.pfa.ru  «___» июля 2012 г.

Автореферат разослан «___» июля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы

Лекарственные средства из группы холиноблокаторов широко применяются в медицинской практике. В терапевтических дозах препараты обладают слабым влиянием на ЦНС, однако, при употреблении высоких доз возможно развитие «холинолитического синдрома», который характеризуется двигательным и психическим возбуждением, беспокойством, галлюцинациями и другими нежелательными эффектами. Немедицинское применение данной группы средств связано с их способностью вызывать яркие зрительные галлюцинации и необычные «телесные ощущения».

Первым холинолитиком, который использовался для достижения состояния одурманивания, был циклодол. Однако в последние годы обозначилась тенденция к злоупотреблению другими, более доступными препаратами «Триган Д» и «Тропикамид», которые можно свободно приобрести в аптеке.

«Триган Д» относится к ненаркотическим анальгетикам. В своем составе препарат содержит холинолитическое вещество дицикловерина гидрохлорид и парацетамол. Препарат «Тропикамид» широко применяется в офтальмологии в виде глазных капель (0,5 и 1%) в качестве мидриатика.

Следует отметить, что препарат «Триган Д» в основном используется подростками на этапе поиска доступных одурманивающих средств. «Тропикамид» же популярен у наркозависимых лиц «со стажем». Большинство потребителей вводит «Тропикамид» внутривенно в сочетании с другими наркотическими средствами и психотропными веществами, в основном с героином. Однако «Тропикамид» применяется и как индивидуальный «наркотик».

По данным химико-токсикологической лаборатории Пермского краевого наркологического диспансера за последние три года зафиксировано 25 случаев обнаружения дицикловерина в образцах мочи, поступившей на химико-токсикологическое исследование.

Аналитическими службами Пермского края в 2011 году выявлено четырехкратное увеличение случаев обнаружения тропикамида в биологических объектах по сравнению с 2010 годом. За 2011 г. в ХТЛ ПКНД было выявлено 222 случая обнаружения тропикамида в образцах мочи (в 2010 г. – 62 случая). По данным судебно-химического отделения Пермского Бюро судебно-медицинской экспертизы за 2011 год выявлен 181 случай обнаружения тропикамида в биообъектах (в 2010 г. – 56 случаев).

Препараты «Триган Д» и «Тропикамид» в качестве средств одурманивания используются относительно недавно, поэтому актуальна разработка методик определения психоактивных веществ в биологических объектах для установления факта их немедицинского употребления и в случаях острых отравлений.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы является разработка методик обнаружения и количественного определения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в моче для целей химико-токсикологического анализа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

  • Разработать методики предварительного обнаружения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в экстрактах из мочи методом тонкослойной хроматографии для этапа скрининговых исследований.
  • Изучить возможность совместного определения тропикамида и опиатов в моче методом тонкослойной хроматографии.
  • Для этапа подтверждающих исследований разработать высокочувствительные методики качественного и количественного определения изучаемых веществ в извлечениях из биожидкости с использованием современных инструментальных методов (ВЭЖХ, ГЖХ, ГХ/МС).
  • Изучить условия экстракции дицикловерина гидрохлорида и тропикамида из водных растворов органическими растворителями с учетом ряда влияющих факторов и разработать оптимальную методику извлечения исследуемых веществ из мочи.
  • Оценить пригодность разработанных методик обнаружения и количественного определения изучаемых веществ в практике химико-токсикологического анализа путем их апробации на реальных образцах мочи, поступивших на исследование в химико-токсикологическую лабораторию ГБУЗ «Пермский краевой наркологический диспансер» на наличие дицикловерина гидрохлорида и тропикамида.

Личный вклад автора

Автором самостоятельно проведены исследования в качестве оператора аналитического оборудования и осуществлен анализ полученных экспериментальных данных. Автором выполнены исследования по установлению хроматографических параметров дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в условиях анализа методами тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также изучены условия экстракции исследуемых веществ из водных растворов и определены оптимальные условия их изолирования из мочи. На основе полученных данных разработаны методики идентификации и количественного определения исследуемых веществ.

Научная новизна

Впервые изучены условия экстракции дицикловерина гидрохлорида и тропикамида из водных растворов и определены оптимальные условия их изолирования из мочи.

Установлены оптимальные условия разделения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Сорбфил», обоснован способ детектирования, определена чувствительность предлагаемых детекторов к исследуемым веществам. Предложена схема обнаружения тропикамида методом тонкослойной хроматографии при совместном присутствии с опиатами в извлечении из биожидкостей.

Разработаны методики обнаружения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида методами ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ и ГХ-МС, определены пределы обнаружения исследуемых веществ.

Разработаны методики количественного определения дицикловерина гидрохлорида методом газо-жидкостной хроматографии, тропикамида – методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Предложены схемы химико-токсикологического исследования дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в моче для установления факта их немедицинского употребления.

Практическая значимость

Разработанные методики изолирования, обнаружения и количественного определения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в моче апробированы и внедрены в работу судебно-химического отделения ГУЗ «Самарское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» (акт внедрения от 07.12.2011 г.), химико-токсикологических лабораторий ГБУЗ «Пермский краевой наркологический диспансер» (акт внедрения от 12.12.2011 г.), ГБУЗ АО «Амурский областной наркологический диспансер» (акт внедрения от 28.11.2011 г.), ГУЗ СПб «Межрайонный наркологический диспансер №1» (акт внедрения от 05.12.2011 г.), токсикологической лаборатории МБУЗ «Городская клиническая больница скорой медицинской помощи», г. Пенза (акт внедрения от 15.12.2011 г.).

Материалы работы внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической химии ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» (акт внедрения от 22.11.2011 г.), биохимии с курсом токсикологической химии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» (акт внедрения от 01.12.2011 г.), фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» (акт внедрения от 28.11.2011 г.).

По материалам исследования подготовлено два информационных письма: «Определение компонентов препарата Триган Д в моче при химико-токсикологическом анализе» и «Химико-токсикологическое исследование мочи на наличие тропикамида», утвержденные ученым советом ФГБУ РЦСМЭ Минздравсоцразвития России (протокол № 4 от 22 ноября 2011 г.).

Апробация работы

Основные материалы работы доложены на межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений» (Санкт-Петербург, 2009), Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009), 74-ой итоговой студенческой научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения проф. А.М. Дыхно (Красноярск, 2010), межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию судебно-медицинской службы в Кировской области «Актуальные вопросы судебно-медицинской науки и практики» (Киров, 2010), 85-ой Всероссийской студенческой научной конференции памяти академика АН РТ, проф. Д.М. Зубаирова (Казань, 2011), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы судебно-химических и химико-токсикологических исследований» на базе ГБУЗ СО «Бюро судебно-медицинской экспертизы» (Екатеринбург, 2011), научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию ПГФА «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских ВУЗов: от разработки до коммерциализации» (Пермь, 2011).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.50 007417). Тема диссертации утверждена на заседании Ученого Совета Пермской государственной фармацевтической академии 27 декабря 2007 г., протокол № 5.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 11 статей, из которых 4 – в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (6 глав), общих выводов, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, включает 22 таблицы, 49 рисунков и 51 страницу приложения. Список использованной литературы содержит 139 наименований, из них 42 источника зарубежной литературы.





Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определена цель и задачи исследования, показана научная новизна и практическая значимость работы, приведены основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе (обзор литературы) рассмотрены классификация и общая характеристика антихолинергических средств, фармакологическая характеристика дицикловерина гидрохлорида и тропикамида, проведено информационно-аналитическое изучение немедицинского применения холиноблокирующих средств. Рассмотрены методы, используемые в фармацевтическом и химико-токсикологическом анализе антихолинергических веществ, вызывающих одурманивание, а также способы их изолирования из биоматериала.

Во второй главе дано краткое описание объектов и методов исследования.

Третья глава посвящена исследованиям по изучению хроматографического поведения и выбору оптимальных условий предварительного обнаружения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида методом тонкослойной хроматографии.

В главе 4 приведены исследования по разработке методик определения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида методом газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В главе 5 описаны исследования по экстракции дицикловерина гидрохлорида и тропикамида из водных растворов органическими растворителями с учетом влияющих факторов, выбраны оптимальные условия и экстрагенты. Предложены методики изолирования исследуемых веществ из мочи.

В шестой главе предложены схемы анализа дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в моче для целей химико-токсикологического анализа, а также представлены результаты по апробации комплекса разработанных методик на экспертном материале, поступившем на исследование в ХТЛ Пермского краевого наркологического диспансера.

На защиту выносятся следующие положения:

  • Результаты экспериментальных исследований по разработке методик обнаружения и количественного определения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в извлечениях из мочи с использованием современных хроматографических методов: ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ, ГХ/МС.
  • Данные исследований по изучению условий экстракции дицикловерина гидрохлорида и тропикамида из водных растворов и модельных смесей мочи с учетом рН среды и природы органического растворителя.
  • Алгоритм химико-токсикологического исследования мочи на наличие дицикловерина гидрохлорида и тропикамида при острых отравлениях и для целей установления факта их немедицинского применения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

  1. Методы обнаружения и количественного определения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида

Тонкослойная хроматография

При разработке методики идентификации исследуемых веществ методом ТСХ было изучено их поведение на пластинках «Сорбфил» в хроматографических системах, широко используемых в химико-токсикологическом анализе группы «лекарственных ядов»:

  • диоксан–хлороформ–ацетон–25% раствор аммиака (47,5:45:5:2,5) – общая система для идентификации веществ основного характера;
  • толуол–ацетон–этанол–25% раствор аммиака (45:45:7,5:2,5) – универсальная система для экспресс-анализа острых интоксикаций;
  • этилацетат–метанол–25% раствор аммиака (17:2:1) – частная система для обнаружения опийных алкалоидов.

Поскольку в состав препарата «Триган Д» помимо дицикловерина гидрохлорида входит парацетамол, который может обнаруживаться в извлечениях из мочи, в обозначенных системах исследовался и стандартный раствор парацетамола.

Значения Rf исследуемых веществ представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Значения Rf исследуемых веществ при хроматографировании на пластинках «Сорбфил» в различных системах растворителей (n=6)

Состав хроматографической системы

Дицикловерина гидрохлорид

Парацетамол

Тропикамид

«Сорбфил»  ПТСХ-П-В-УФ

толуол-ацетон-этанол-25% р-р аммиака

0,82±0,02

0,52±0,02

0,52±0,02

этилацетат-метанол-25% р-р аммиака

0,87±0,02

0,57±0,02

0,69±0,03

диоксан-хлороформ-ацетон-25% р-р аммиака

0,83±0,02

0,70±0,02

0,75±0,03

«Сорбфил»  ПТСХ-АФ-А-УФ

толуол-ацетон-этанол-25% р-р аммиака

0,84±0,02

0,51±0,02

0,51±0,02

этилацетат-метанол-25% р-р аммиака

0,89±0,02

0,53±0,02

0,78±0,03

диоксан-хлороформ-ацетон-25% р-р аммиака

0,83±0,02

0,65±0,02

0,78±0,03

Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемые вещества имеют удовлетворительные значения Rf во всех выбранных системах на обоих видах пластинок «Сорбфил». Значения Rf дицикловерина гидрохлорида и парацетамола указывают на их хорошее разделение в данных системах в случае совместного присутствия в биологических пробах.

С целью выбора оптимального способа детектирования зон адсорбции дицикловерина гидрохлорида, тропикамида и парацетамола на хроматографических пластинках было изучено отношение исследуемых веществ к ряду потенциальных детектирующих агентов: УФ-свет (254, 365 нм), реактивы Драгендорфа (модифицированный по Мунье), Манделина, Марки, Фреде, железа (III) хлорида раствор 30%, реактив FPN, меди сульфата и калия йодида растворы 1 моль/л, меди сульфата раствор 10% и аммиака раствор 2% в соотношении 5:1.

По результатам исследований оптимальным способом детектирования тропикамида является облучение пластинки УФ-светом при длине волны 254 нм с последующим опрыскиванием реактивом Драгендорфа.

Оптимальный способ детекции компонентов препарата «Триган Д» заключается в поэтапной обработке хроматограммы:

  • облучением в УФ–свете (254 нм) – наблюдается зона поглощения темно-синего цвета (парацетамол);
  • раствором железа (III) хлорида 30% – обнаруживается парацетамол в виде пятна синего цвета;
  • реактивом Драгендорфа – дицикловерин обнаруживается в виде пятна оранжево-коричневого цвета, окраска пятна парацетамола переходит из синей в оранжево-коричневую.

Предел обнаружения тропикамида при облучении УФ-светом составляет 1 мкг, при детектировании реактивом Драгендорфа – 0,5 мкг вещества в наносимом пятне.

При обработке реактивом Драгендорфа дицикловерина гидрохлорид обнаруживался при содержании в пятне 1 мкг и выше (предел обнаружения – 1 мкг).

Анализ статистических данных указывает на то, что в биопробах тропикамид часто встречается в виде комбинации с опиатами. Поэтому нами была определена возможность идентификации тропикамида совместно с морфином в частной системе для опийных алкалоидов. Поэтапная детекция компонентов осуществлялась путем обработки пластинки УФ-светом при 254 нм (отмечали зоны поглощения темно-синего цвета в зонах расположения тропикамида и морфина), далее пластины обрабатывали реактивами Марки и Фреде. При этом морфин детектировался в виде пятен красно-фиолетового цвета и сине-фиолетового цвета соответственно с Rf 0,20±0,02. После обработки пластины реактивом Драгендорфа визуализировались зоны адсорбции морфина и тропикамида в виде оранжево-коричневых пятен с Rf 0,20±0,02 и 0,69±0,03.

Газо-жидкостная хроматография

Исследования по установлению оптимальных условий газохроматографического определения дицикловерина гидрохлорида на хроматографе «Кристалл 2000М» сводились к выбору типа колонки (НЖФ), способа детектирования и режима программирования температуры анализа.

На основе проведенных исследований были выбраны следующие условия анализа (рис. 1):

  • колонка НР-5 (30 м 0,25 мм);
  • детектор – термоионный;
  • температурный режим: температура детектора 280 °С; температура испарителя 260 °С; температура колонки программируемая: 160 °С – 2 минуты, подъем до 240 °С со скоростью 20 °С в минуту, далее до конца анализа температура без изменений;
  • газ-носитель – азот;
  • скорость потока газа через колонку – 1,50 мл/мин.;
  • вспомогательные газы: водород, воздух;
  • объем вводимой пробы – 1 мкл;
  • время хроматограммы – 10 минут.

Рис. 1 – Хроматограмма стандартного раствора дицикловерина гидрохлорида (10 мкг/ мл) в метаноле на колонке НР-5 (детектор ТИД)

В данных условиях дицикловерина гидрохлорид элюируется в виде симметричного пика со временем удерживания – 7,7±0,1 мин. Для проверки специфичности предложенных условий анализировались экстракты из модельных смесей дицикловерина гидрохлорида и мочи (10 мкг/мл), а также экстракт холостой пробы мочи. Установлено, что в выбранных условиях наблюдается четкое разделение пика исследуемого вещества и пиков соэкстрактивных веществ (коэффициент разделения пика дицикловерина гидрохлорида и ближайшего пика на хроматограмме Rs=3,6).

Для количественного определения дицикловерина в экстрактах из мочи предложен метод внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта выбран дифениламин, поскольку он хорошо разделяется с анализируемым веществом в разработанных условиях, имеет близкое время удерживания и не является объектом злоупотребления. Помимо этого дифениламин хорошо растворяется в метаноле и хлороформе, которые используются на различных этапах пробоподготовки объекта к анализу.

Для построения калибровочного графика готовили модельные смеси мочи с содержанием дицикловерина от 1 до 25 мкг в пробе (10 мл). В каждую пробу добавляли 25 мкг дифениламина. Экстракты анализировали методом ГЖХ. Пример калибровочной хроматограммы и градуировочный график количественного определения дицикловерина приведены на рис. 2 и 3.

Зависимость между концентрацией растворов и соотношением площадей хроматографических пиков дицикловерина и дифениламина описывается уравнением Sв-ва/Sвн.ст.=0,045c. Линейность градуировочного графика наблюдается во всем интервале выбранных концентраций (коэффициент корреляции составляет 0,999). Чувствительность метода – 1 нг во вводимой пробе (1 мкл).

Рис. 2 – Пример калибровочной хроматограммы модельной смеси мочи, содержащей дицикловерина гидрохлорид и внутренний стандарт

Рис. 3 – Градуировочный график количественного определения дицикловерина гидрохлорида методом внутреннего стандарта

При исследовании тропикамида методом газовой хроматографии в различных условиях были получены ассиметричные пики с малыми площадями. Это обусловило необходимость подбора условий дериватизации тропикамида для улучшения его хроматографических характеристик и увеличения чувствительности метода.

Поскольку тропикамид содержит в своей структуре свободную гидроксильную группу, были предложены схемы дериватизации ацилированием с помощью уксусного и пентафторпропионового ангидрида. Газохроматографическое определение вели в условиях, разработанных для дицикловерина гидрохлорида.

Установлено, что образующиеся дериваты имеют более симметричную форму хроматографического пика. Производное тропикамида с ПФПА имеет время удерживания – 8,68±0,2 минуты, производные тропикамида и уксусного ангидрида – 11,96±0,2 мин. Чувствительность метода составила 3 нг во вводимой пробе (1 мкл) для пентафторпропионового производного тропикамида, и 5 нг – для ацетильного производного.

Газовая хроматография с масс-селективным детектированием

Исследования проводились на газовом хроматографе Agilent 7890A с масс-спектрометрическим детектором Agilent 5975С на капиллярной неполярной колонке НР-5МS. Ввод пробы (1 мкл) осуществлялся автоматически без деления потока газа-носителя. Масс-детектор работал в режиме сканирования спектров электронного удара при 70 эВ в интервале от 50 до 550 а.е.м.

При разработке методики варьировали скорость потока газа-носителя, температурные режимы инжектора и хроматографической колонки. Предложены следующие условия анализа методом ГХ/МС:

  • Скорость потока газа-носителя (гелий) – 1 мл/мин.
  • Ввод пробы производится автоматически без деления потока газа-носителя.
  • Температура инжектора – 250 °С.
  • Температура интерфейса – 320 °С.
  • Температурная программа колонки: начальная температура – 70 °С (выдержка 5 минут), повышение температуры со скоростью 10 °С/мин. до 320 °С с выдержкой при конечной температуре 8 минут.

Время удерживания дицикловерина гидрохлорида составило 14,00±0,10 мин. (рис. 4).

Рис. 4 – Хроматограмма по полному ионному току стандартного раствора дицикловерина гидрохлорида в метаноле (10 мкг/мл)

Масс-спектр дицикловерина гидрохлорида приведен на рисунке 5. Характеристические ионы в масс-спектре дицикловерина гидрохлорида: 86, 99, 71, 83 m/z (данные приведены в порядке уменьшения m/z).

Рис. 5 – Масс-спектр дицикловерина гидрохлорида

При анализе тропикамида методом ГХ/МС необходима предварительная дериватизация. Пентафторпропионовое производное тропикамида имеет время удерживания 15,2±0,10 мин., ацетильное производное тропикамида – 17,3±0,15 мин. (рис. 6 и 7). Хроматомасс–спектрометрические характеристики дериватов тропикамида представлены в таблице 2.

Рис. 6 – Хроматограмма пентафторпропионового производного тропикамида (режим Scan)

Рис. 7 – Хроматограмма ацетильного производного тропикамида (режим Scan)

Таблица 2 – Хроматомасс-спектрометрические характеристики дериватов тропикамида

Дериватизирующие агенты

Пентафторпропионовый ангидрид и пентафторпропанол

Уксусный ангидрид и этилацетат

м/z

Относительная интенсивность характеристического иона, %

м/z

Относительная интенсивность характеристического иона, %

92

100

92

100

163

45,9

104

31,2

119

12,4

163

21,1

266

18,0

266

19,6

65

9,3

65

9,5

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Наличие хромофорных групп в структуре тропикамида обусловило возможность его анализа методом ВЭЖХ со спектрофотометрической детекцией. Разработку методики идентификации и количественного определения тропикамида проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02».

Аналитическую длину волны детектирования подбирали, исходя из анализа УФ-спектра тропикамида. В спектре аналита максимум поглощения наблюдается при 254 нм. Однако в исследованиях в качестве рабочей нами была выбрана длина волны 210 нм, при использовании которой чувствительность метода значительно повышается (рис. 8).

Рис. 8 – УФ-спектр стандартного раствора тропикамида (100 мкг/мл), снятый в режиме обзорного хроматографирования

По результатам исследований выбраны следующие условия хроматографического определения тропикамида на основе градиентного элюирования:

  • неподвижная фаза «ProntoSIL 120-5 С18». Диаметр зерен сорбента – 5 мкм;
  • подвижная фаза: перхлоратный буфер – ацетонитрил;
  • скорость потока элюента – 100 мкл/мин;
  • режим элюирования – градиентный: градиент от 10% до 85% ацетонитрила за 10 мин;
  • объем вводимой пробы – 4 мкл;
  • детектирование многоволновое при 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм;
  • температура колонки – 35С.

Время удерживания тропикамида в данных условиях составляет 8,15 минуты (рис. 9).

Рис. 9 – Хроматограмма стандартного раствора тропикамида (100 мкг/мл) при градиентном режиме элюирования

Для установления специфичности разработанных условий и пригодности их использования в анализе биообъектов анализировались экстракты из модельных смесей мочи с тропикамидом и экстракты холостых проб. В качестве критерия полноты разделения пиков использовали коэффициент разделения пиков Rs. Установлено, в разработанных условиях тропикамид элюируется в виде симметричного пика, а пики соэкстрактивных веществ не мешают определению исследуемого аналита (рис.10).

Рис. 10 – Хроматограмма экстракта из модельной смеси мочи и тропикамида

В таблице 3 приведены хроматографические параметры тропикамида и оценена их приемлемость.

Таблица 3 – Параметры пригодности хроматографической системы

Вещество

Время удерживания*, мин.

Коэффициент емкости

Коэффициент разделения пиков Rs

Коэффициент асимметрии

Эффектив-ность колонки (N)

тропикамид

8,15±0,25

4,1

2,4

1,11

18758 тт

Критерий приемлемости:

[2-10]

Критерий приемлемости:не менее 2

Критерий приемлемости:0,8 – 1,5

Критерий приемлемости:более 2000

*- расчет проводился по 5 хроматограммам раствора

Чувствительность метода составила 1,2 нг во вводимой пробе (4 мкл).

Для определения тропикамида в моче нами был построен градуировочный график с использованием модельных смесей мочи с содержанием тропикамида от 1 до 25 мкг в пробе (10 мл) (рис. 11).

Рис. 11 Градуировочный график количественного определения тропикамида в моче методом абсолютной калибровки

Установлено, что линейность отклика детектора соблюдается в выбранном диапазоне концентраций. Уравнение линейной зависимости имеет вид S=0,236c, коэффициент корреляции составляет 0,993.

  1. Изолирование дицикловерина гидрохлорида и тропикамида

из мочи

Для разработки оптимального метода изолирования исследуемых веществ из мочи нами предварительно были изучены условия экстракции дицикловерина гидрохлорида и тропикамида органическими растворителями из водных растворов. Исследовано влияние на процесс экстракции аналитов следующих факторов: природы органического растворителя и pH буферного раствора.

В качестве экстрагентов применяли следующие органические растворители: диэтиловый эфир, хлороформ, метиленхлорид и смеси хлороформ-изопропанол 9:1. Для создания определенного значения pH в растворе использовали универсальные буферные смеси Бриттона-Робинсона.

Установлено, что при использовании любого из выбранных органических растворителей дицикловерина гидрохлорид имеет высокую степень экстракции (от 50% до 100%) в широком диапазоне рН (от 3 до 12), что может быть обусловлено высоким сродством исследуемого вещества к органической фазе (коэффициент распределения Log Pоктанол/вода равен 3,98).

Поскольку тропикамид часто применяется в сочетании с опиатами, нами в качестве экстрагента апробировалась и смесь хлороформ-бутанол (6:1), широко используемая при экстракции опиатов после гидролиза.

Установлено, что оптимальными экстрагентами для извлечения тропикамида из водных  растворов являются хлороформ и смесь хлороформ-бутанол 6:1. При использовании хлороформа максимальный выход тропикамида составляет 93,37% при рН 9; при использовании смеси хлороформ-бутанол (6:1) извлекается до 90,11% вещества при рН 10.

Путем эксперимента на модельных смесях анализируемых веществ и мочи было установлено, что максимальное извлечение дицикловерина достигается хлороформом при рН 2 (87,61%), тропикамида – хлороформом (86,35%) при рН 9 и смесью хлороформ-бутанол в соотношении 6:1 (71,60%).

По результатам проведенных исследований предложены следующие методики изолирования дицикловерина гидрохлорида и тропикамида из мочи:

Методика изолирования дицикловерина гидрохлорида: 10 мл мочи помещают в стеклянный флакон с навинчивающейся крышкой вместимостью 30 мл. Мочу подкисляют до рН 2 по универсальному индикатору хлористоводородной кислотой разведенной и добавляют 5 мл хлороформа. Содержимое флакона взбалтывают в течение 5 минут на механическом встряхивателе при 150 об/мин. Затем смесь из флакона переносят в делительную воронку, оставляют на 2-3 минуты для расслоения и фильтруют органическую фазу через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом в сухой чистый пенициллиновый флакон. Экстракцию проводят дважды. Фильтр промывают 0,5 мл хлороформа, хлороформное извлечение выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1000 мкл метанола, центрифугируют при 10000 об/мин. в течение 5 минут и подвергают дальнейшему исследованию.

Методика изолирования тропикамида: 10 мл мочи помещают в стеклянный флакон с навинчивающейся крышкой вместимостью 30 мл, прибавляют 25% водный раствор аммиака до рН 9-10 и экстрагируют двукратно хлороформом (порциями по 5 мл). Время каждой экстракции – 5 минут. Органическую фазу отделяют в делительной воронке и фильтруют через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Фильтр промывают 0,5 мл экстрагента, полученное извлечение выпаривают досуха, растворяют в 1000 мкл метанола, центрифугируют при 10000 об/мин. в течение 5 минут и подвергают дальнейшему исследованию.

Данные методики были апробированы на модельных смесях мочи с концентрацией анализируемых веществ – 1; 1,5; 2 и 5 мкг/мл. Результаты количественного определения веществ в биожидкости и метрологическая оценка результатов представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4 – Результаты количественного определения дицикловерина гидрохлорида в модельных смесях мочи методом ГЖХ

Концентрация дицикловерина гидрохлорида в модельной смеси, мкг/мл

Метрологические характеристики (n=5, t=2,78)

S

S

х

1,0

83,48%

3,16

1,41

8,78

3,92

10,52

4,70

1,5

81,63%

3,10

1,38

8,62

3,85

10,56

4,72

2,0

83,86%

2,82

1,26

7,84

3,50

9,35

4,17

5,0

86,98%

2,51

1,12

6,98

3,12

8,02

3,59

Предложенная методика изолирования позволяет выделить в зависимости от концентрации 81,63 – 86,98% дицикловерина гидрохлорида из 10 мл мочи (относительная ошибка определения 3,59 – 4,72).

Предел обнаружения дицикловерина гидрохлорида в моче по данной методике составляет 0,05 мкг/мл. Предел количественного определения 0,1 мкг/мл.

Таблица 5 – Результаты количественного определения тропикамида в модельных смесях мочи методом ВЭЖХ

Концентрация тропикамида

в модельной смеси, мкг/мл

Метрологические характеристики (n=5, t=2,78)

S

S

х

1,0

73,81%

3,31

1,48

9,20

4,11

12,46

5,57

1,5

75,25%

3,14

1,40

8,73

3,90

11,60

5,18

2,0

76,33%

3,01

1,34

8,37

3,74

10,97

4,90

5,0

78,13%

2,54

1,15

7,06

3,15

9,04

4,03

Процент экстракции тропикамида из мочи в зависимости от концентрации составляет 73,81 – 78,13% (относительная ошибка определения 4,03 – 5,57).

Предел обнаружения тропикамида – 0,08 мкг/мл, предел количественного определения 0,1 мкг/мл.

  1. Схемы химико-токсикологического исследования мочи на наличие дицикловерина гидрохлорида и тропикамида

На основании проведенных экспериментальных исследований по разработке условий изолирования, обнаружения и количественного определения предложены следующие схемы химико-токсикологического анализа дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в моче (рис. 12 и 13).

Комплекс разработанных методик апробирован на экспертном материале, поступившем на исследование в ХТЛ Пермского краевого наркодиспансера.

Рис. 12 – Схема химико-токсикологического исследования мочи на наличие дицикловерина гидрохлорида

В исследованных реальных пробах мочи (5 образцов) содержание дицикловерина гидрохлорида варьировалось в диапазоне концентраций от 0,22 до 2,30 мкг/мл.

Рис. 13 – Схема химико-токсикологического исследования мочи на наличие тропикамида

В разработанных условиях исследовали 10 образцов мочи лиц, употребляющих тропикамид с немедицинскими целями. Содержание тропикамида в данных пробах находилось в диапазоне концентраций от 0,5 до 5,90 мкг/мл.

ВЫВОДЫ

  1. Разработаны методики предварительного обнаружения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в экстрактах из мочи методом тонкослойной хроматографии для этапа скрининговых исследований: выбраны оптимальные системы растворителей, предложена поэтапная схема детектирования, определена чувствительность используемых детектирующих агентов по отношению к определяемым веществам.
  2. Предложены условия совместного определения тропикамида и опиатов в моче методом тонкослойной хроматографии в частной системе этилацетат–метанол–25% раствор аммиака 17:2:1.
  3. Для этапа подтверждающих исследований разработаны методики идентификации дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в извлечениях из биожидкости с использованием современных инструментальных методов.
  4. Выбраны оптимальные условия анализа исследуемых веществ методом газо-жидкостной хроматографии на приборах «Кристалл 2000М» с термоионным детектором и Agilent 7890A с масс-спектрометрическим детектором. Изученные газохроматографические и масс-спектральные характеристики веществ могут быть применены для их идентификации. Установлена необходимость предварительной дериватизации тропикамида и предложены схемы ацилирования уксусным и пентафторпропионовым ангидридом.
  5. Для количественного определения дицикловерина гидрохлорида предложен метод газо-жидкостной хроматографии на приборе «Кристалл 2000М» с использованием внутреннего стандарта – дифениламина.
  6. Для идентификации и количественного определения тропикамида предложен метод ВЭЖХ на приборе «Милихром А-02» со спектрофотометрическим детектированием. Выбраны оптимальные условия хроматографирования и приведены параметры идентификации. Для количественного анализа предложен метод абсолютной калибровки.
  7. Установлены валидационные характеристики предложенных методик по показателям специфичность, линейность, воспроизводимость, пределы обнаружения и количественного определения.
  8. На основании изучения условий экстракции дицикловерина гидрохлорида и тропикамида из водных растворов органическими растворителями разработаны методики извлечения исследуемых веществ из мочи на основе жидкость-жидкостной экстракции. Установлено, что оптимальными экстрагентом для дицикловерина гидрохлорида является хлороформ при рН 2, для тропикамида – хлороформ при рН 9. Разработанные методики в зависимости от концентрации позволяют выделить 81,63-86,98% дицикловерина гидрохлорида и 73,81-78,13% тропикамида.
  9. Показана эффективность извлечения тропикамида из мочи смесью хлороформ-бутанол (6:1) при рН 9-10 в случае совместного присутствия в пробе с опиатами. Процент экстракции тропикамида – 71,60%.
  10. Составлены схемы химико-токсикологического исследования мочи на наличие дицикловерина гидрохлорида и тропикамида.
  11. Оценена пригодность разработанных методик обнаружения и количественного определения изучаемых веществ в практике химико-токсикологического анализа путем их апробации на реальных образцах мочи, поступивших на исследование в химико-токсикологическую лабораторию ГБУЗ «Пермский краевой наркологический диспансер» на наличие дицикловерина гидрохлорида и тропикамида.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

  1. Тумилович, Е.Ю. Определение компонентов препарата Триган Д в моче при химико-токсикологическом анализе / Е.Ю. Тумилович, Ю.Н. Карпенко, О.Н. Дворская // Наркология. – 2010. – №9. – С. 46-51.
  2. Химико-токсикологическое исследование мочи на наличие тропикамида / Е.Ю. Тумилович, Ю.Н. Карпенко, Л.Н. Курдина, О.Н. Дворская, Н.Ю. Порсева // Наркология. – 2011. – №10. – С. 64-69.
  3. О проблеме немедицинского использования лекарственного препарата тропикамид в Пермском крае / О.Н. Дворская, Ю.Н. Карпенко, Е.Ю. Тумилович, Н.Ю. Порсева // Медицинская экспертиза и право. – 2011. – №1. – С. 17-19.
  4. Применение холинолитиков в немедицинских целях / Н.Ю. Порсева, А.В. Солонинина, О.Н. Дворская, Ю.Н. Карпенко, Е.Ю. Тумилович // Фармация. – 2012. – №2. – С. 51-53.
  5. Тумилович, Е.Ю. Метод газожидкостной хроматографии в анализе препарата Триган Д / Е.Ю. Тумилович, М.И. Фомина Ю.Н. Карпенко // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2009. №5. – С. 160-162.
  6. Тумилович, Е.Ю. Разработка методик хроматографического анализа для определения дицикловерина в биожидкостях / Е.Ю. Тумилович, Ю.Н. Карпенко, О.Н. Дворская // Тезисы докладов Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений» (23-24 апреля 2009 г) / СПб. : Издательство СПХФА, 2009. – С. 62-63.
  7. Тумилович, Е.Ю. Изучение условий экстракции дицикловерина гидрохлорида из водных растворов органическими растворителями / Е.Ю. Тумилович, Ю.Н. Карпенко // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (28 сентября – 3 октября 2009 г). – Пермь, 2009. – С. 97-99.
  8. Тумилович, Е.Ю. Выбор условий дериватизации тропикамида для исследования методом газо-жидкостной хроматографии / Е.Ю. Тумилович, А.С. Богданова, И.П. Крохин, Ю.Н. Карпенко // Сборник материалов 74-ой итоговой студенческой научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения проф. А.М. Дыхно (20-23 апреля 2010 г). – Красноярск, 2010. – С. 882-885.
  9. Тумилович, Е.Ю. Использование газо-жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием в анализе дицикловерина и тропикамида / Е.Ю. Тумилович, А.С. Богданова, И.П. Крохин, Ю.Н. Карпенко // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2010. – №6. – С. 194-196.
  10. Тумилович, Е.Ю. Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе Тропикамида / Е.Ю. Тумилович, Ю.Н. Карпенко // Материалы межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию судебно-медицинской службы в Кировской обл. «Актуальные вопросы судебно-медицинской науки и практики». – Киров, 2010. – С. 436-438.
  11. Тумилович, Е.Ю. Метод тонкослойной хроматографии в анализе тропикамида / Е.Ю. Тумилович, Е.В. Крылова, Ю.Н. Карпенко // Сборник тезисов 85-ой Всероссийской студенческой научной конференции памяти академика АН РТ, проф. Д.М. Зубаирова (15-16 апреля 2011 г). – Казань, 2011. – С. 350.
  12. Тумилович, Е.Ю. Определение оптимальных условий обнаружения тропикамида в биологических жидкостях методом тонкослойной хроматографии / Е.Ю. Тумилович, Е.В. Крылова, Ю.Н. Карпенко, О.Н. Дворская // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2011. – №8. – С. 133-134.
  13. Тумилович, Е.Ю. Использование базы данных «БД-2003» в анализе тропикамида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Е.Ю. Тумилович, Ю.Н. Карпенко, О.Н. Дворская // Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию ПГФА «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских ВУЗов: от разработки до коммерциализации» (7-9 декабря 2011 г). – Пермь, 2011. – С. 162-164.

Тумилович Екатерина Юрьевна (Россия)

Разработка методик определения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в моче для целей химико-токсикологического анализа

Разработаны методики предварительного обнаружения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в экстрактах из мочи методом тонкослойной хроматографии для этапа скрининговых исследований. Предложены условия совместного определения тропикамида и опиатов в моче методом ТСХ в частной системе для опиатов. Для этапа подтверждающих исследований разработаны методики идентификации дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в извлечениях из биожидкости с использованием современных инструментальных методов (ГЖХ, ВЭЖХ, ГХ/МС). Для количественного определения дицикловерина гидрохлорида предложен метод газо-жидкостной хроматографии на приборе «Кристалл 2000М» с использованием внутреннего стандарта – дифениламина. Для количественного определения тропикамида предложен метод ВЭЖХ на приборе «Милихром А-02» со спектрофотометрическим детектированием. Разработаны методики извлечения исследуемых веществ из мочи на основе жидкость-жидкостной экстракции. Составлены схемы химико-токсикологического исследования мочи на наличие дицикловерина гидрохлорида и тропикамида.

Tumilovich Ekatherina (Russia)

Development of methods for determining dicycloverine hydrochloride and tropicamide in the urine for targets of chemical-toxicological analysis

The techniques of the prior detection of dicycloverine hydrochloride and tropicamide in extracts from the urine by thin layer chromatography for the screening stage were developed. The conditions for the simultaneous determination of tropicamide and opiates in urine by TLC in a private system for opiates were proposed. For the stage of confirmatory studies various techniques have been developed to identify dicycloverine hydrochloride and tropicamide in extracts from biological liquid using modern instrumental methods (GC, HPLC, GC/MS). For the quantitative determination of dicycloverine hydrochloride the gas-liquid chromatography using an internal standard – diphenylamine was suggested. For the quantitative determination of tropicamide HPLC method on the device "Milichrome A-02" with spectrophotometric detection was proposed. The techniques of extraction of the target substances from urine by liquid-liquid extraction were developed. Schemes of chemical-toxicological investigation of urine for the presence of dicycloverine hydrochloride and tropicamide were made.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.