WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Михайлова Татьяна Витальевна

РАЗРАБОТКА ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ

ПРОТИВОМЕЛАНОМНОЙ ВАКЦИНЫ

Специальность: 14.04.01 – технология получения лекарств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата

фармацевтических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей

Федерального Государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН («РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН)

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, 

профессор Оборотова  Наталия Александровна

доктор медицинских наук, 

профессор Барышников  Анатолий Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

ведущий специалист отдела обеспече-

ния качества ЗАО «Ретиноиды»  Гузев Константин Сергеевич

кандидат фармацевтических наук,  доцент,

заведующая лабораторией биологически

активных соединений НИИ Молекулярной

медицины ГБОУ ВПО Первый МГМУ

им. И.М.Сеченова  Павлова Людмила Анатольевна

Ведущая организация:  ГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов.

Защита состоится «____» __________________2012 г.  в______ часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09  при Первом Московском государственном медицинском университете им. И.М. Сеченова (119991, г. Москва, Никитский б-р, д.13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (117997,  г. Москва, Нахимовский пр-т, 49).

Автореферат разослан «______» _____________2012 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.208.040.09,

доктор фармацевтических наук,

профессор

Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Меланома кожи еще 30–40 лет назад была сравнительно редким заболеванием в большинстве стран мира. Однако за истекшее время частота возникновения этого заболевания значительно увеличилась и продолжает неуклонно возрастать. Меланома считается «антигенной опухолью», экспрессирующей так называемые опухолеассоциированные антигены. Эти антигены используются при вакцинотерапии, которая является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний.

Основной задачей противоопухолевой вакцинации является индукция и поддержание иммунного ответа, направленного на распознавание и элиминацию иммунорезистентных опухолевых клеток. Современные исследования в области создания противоопухолевых вакцин включают два основных направления: совершенствование существующих технологических этапов и разработку нового поколения вакцин на основе достижений молекулярной биологии и иммунологии.

В процессе поиска опухолеспецифических антигенов было установлено, что белки теплового шока (hsp) обладают высокой иммуногенной активностью. Установлено, что Hsp70 играют важную роль в индуцировании клеточного иммунного ответа.

Липосомальная терапия – одно из наиболее активно развивающихся направлений в фармакологии и медицине. Липосомальная форма вакцины позволяет обеспечить сохранность антигенов, улучшает доставку антигенов к клеткам иммунной системы и способствует повышению иммуногенности.

Постановка проблемы в этих рамках позволит сконцентрировать экспериментальные данные для разработки НД, а, главное, сделать производство липосом и препаратов на их основе реальностью сегодняшнего и завтрашнего фармацевтического производства.

Цель и задачи исследования.

Получение и изучение биофармацевтических свойств липосомальной лекарственной формы вакцины, содержащeй  лизат клеточных линий меланомы человека.

  В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

  1.  На основе химико-фармацевтических исследований разработать состав  липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины;

  2. Разработать способ получения устойчивой при хранении липосомальной  лекарственной формы противомеланомной вакцины;

3.  Обосновать параметры и критерии качества готового препарата и разработать методики для установления стандартности липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины;

4.  Изучить стабильность липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины в процессе хранения;

5.  Оценить противоопухолевую активность липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины.

Научная новизна результатов исследования.

Впервые разработана липосомальная лекарственная форма противомеланомной вакцины, содержащая лизат клеточных линий меланомы человека  Mel Mtp, Mel Is,  Mel Z, Mel P, Mel Kor. Обоснованы требования к стандартизации липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Установлены критерии и параметры качества липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Отработаны методы очистки липосомальной лекарственной формы от невключившегося лизата и определена эффективность нагрузки лизата в липосомы. Определены режимы лиофильного высушивания и стерилизации липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Разработан проект ФСП «Липосомальная противомеланомная вакцина, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2,5 мг». Показана стабильность лекарственной формы в процессе хранения в течение одного года при температуре +4 0 С. Получены данные об интенсивности иммунного ответа на липосомальную лекарственную форму противомеланомной вакцины методом ELISpot.

Новизна полученных результатов подтверждается заявкой на патент РФ «Липосомальная форма лизата клеточных линий меланомы человека»

№ 2012115547 от 19.04.2012.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования.

Создана новая липосомальная лекарственная форма противомеланомной вакцины. Получена лиофилизированная форма липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины и установлен режим стерилизации, при котором сохраняются основные физико-химические показатели липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Разработанные методики качественного и количественного определения Hsp70 могут быть использованы при  проведении качественного и количественного анализа субстанции и лекарственных форм, полученных на ее основе. Разработан проект ФСП, в соответствии с которым проведена стандартизация препарта «Липосомальная противомеланомная вакцина, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2,5 мг».

Апробация работы

Апробация диссертационной работы состоялась 18 мая 2012 г. на совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории разработки лекарственных форм, лаборатории трансгенных препаратов, лаборатории лучевых методов лечения опухолей, лаборатории иммунофармакологии, лаборатории фармакоцитокинетики, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН.

Материалы приведенных в диссертационной работе исследований представлены на следующих научных сообществах:

  • Материалы заочной международной конференции «Приоритеты фармацевтической науки и практики» г. Москва, 2006 г.
  • Руснанотех 09 Нанотехнологии в медицине. Онкология и кардиология. г. Москва, 2009.
  • Сборник трудов V Всероссийской школы-семинара студентов, аспирантов и молодых ученых по тематическому направлению развития ННС «Нанобиотехнология» г. Белгород,  2011г.

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 – Технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств.

Связь задач исследования с проблемным планом

Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Федерального Государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН («РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН) «Создание противоопухолевых нановакцин нового поколения для профилактики и терапии злокачественных новообразований» (номер Государственной регистрации 01 20106 3844).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Положения, выносимые на защиту:

  • Состав и технология получения лиофилизированной лекарственной формы  противомеланомной вакцины;
  • Методы идентификации и количественного определения Hsp70 в субстанции и готовых лекарственных формах;
  • Результаты контроля качества наработанных серий препарата и изучения их стабильности в процессе хранения.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературы, 4 глав экспериментальной части, Общих выводов и Списка литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 15 таблиц. Библиография включает 187  наименований, в том числе 155 иностранных.

 

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

При проведении исследований по разработке состава и технологии получения липосомальной формы противомеланомной вакцины использовали лизат клеточных линий меланомы человека Mel Mtp, Mel Is,  Mel Z, Mel P, Mel Kor (действующее вещество) и вспомогательные вещества, которые соответствовали требованиям нормативной документации: ГФ XI издания, ГФ  XII издания, Фармакопеи США - USP-32, частных фармакопейных статей, ГОСТов. 

  1. Методы культивирования клеточных линий меланомы человека, приготовление клеточного лизата, количественные методы определения общего белка

1.1.Клеточные линии и их культивирование

Клетки меланомы человека были предоставлены лабораторией Экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина коллективом авторов (Михайлова И.Н., Морозова Л.Ф., Бурова О.С. и соавт.).

Полученные 19 стабильных клеточных линий охарактеризованы по морфологическим, кариологическим, иммунологическим и генетическим параметрам. Клеточные линии прошли более 30 пассажей, что характеризует клетки как обладающие неограниченным жизненным потенциалом.

Клетки культивировали в среде RPMI 1540, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2мМ L-глутамина, 1% HEPES,  пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab) в культуральных флаконах (Costar).

1.2.Получение опухолевого лизата

Для получения опухолевого лизата наращивали по 10 млн. клеток линий MelP, MelKor, MelMtp, MeIl, MelIs, MelSi, MelMe, MelGus, MelZ, MelGi, MelIbr, MelR, MelRac, MelCh, MelCher. Клетки ресуспендировали в среде и переносили в ампулы для криоконсервации. После этого клетки замораживали и размораживали, соответственно помещая ампулы вначале в жидкий азот, а потом в водяную баню (370С); процедуру повторяли пять-шесть раз. Затем поврежденные клетки осаждали центрифугированием при 3000g в течение 10 минут. Определяли концентрацию белка, разливали на аликвоты и хранили при –20oС.

1.3.Определение концентрации белка в опухолевом лизате

Определение концентрации белка проводили на спектрофотометре Beckman Coulter (США) при 260 нм  и 280 нм, а также модифицированным методом Лоури с бицинхониновой кислотой. Использовали набор BCA Protein Assay Reagent Kit 23227 фирмы Pierce. Для проведения анализа готовили необходимое количество рабочего раствора — смешением растворов А и В в объемном соотношении 50:1. Если измерения проводили в больших (4 мл) кюветах спектрофотометра, то следующие манипуляции проводили в подходящих пробирках: смешивали 0,1 мл анализируемой пробы с 2 мл рабочего раствора, смесь инкубировали 30 минут при температуре 37°С и фотометрировали при 562 нм.

2. Методы идентификации и количественного определения Hsp70

Определяли уровень Hsp70 на клетках линий меланомы человека MelP, MelKor, MelMtp, MeIl, MelIs, MelSi, MelMe, MelGus, MelZ, MelGi, MelIbr, MelR, MelRac, MelCh, MelCher. Первая опытная группа клеток – интактные клетки. Вторая опытная группа – клетки, прогретые при 42 С в течение 10 мин на водяной бане, после чего помещенные в СО2-инкубатор на 30 мин. Третья опытная группа – клетки, предварительно замороженные при -800 С.

2.1. ДСН электрофорез в полиакриламидном геле

Электрофорез лизата клеток меланомы проводили по методике, предложенной Лэммли в камере Mini-PROTEAN («Bio-Rad», США).

2.2. Определение уровня Hsp70 методом иммуноблот

Нитроцеллюлозную мембрану с перенесенными белками инкубировали при комнатной температуре в течение часа с 5% раствором сухого молока Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad) для блокирования неспецифического связывания в буфере А, состоящем из 2М трис, 0,5 М ЭДТА, 5М NaCl, 0,1 % реагент Tween 20 (Bio-Rad). Затем мембрану дважды отмывали в 20 мл буфера А по 10 мин. Далее проводили инкубацию с антителами Mouse anti-heat shock Protein 70 Monoclonal Ig G (Abfrontier), разведенными в соотношении 1: 2000 в буфере А в течение 90 мин. После этого мембрану отмывали дважды по 15 мин в буфере А.

Инкубацию с антителами Blotting Grade Affinity Purified Goat Anti Mouse Ig G Alkaline Phosphatase conjugate (Bio-Rad), разведенными в соотношении 1:3000 в буфере А, проводили в течение 90 мин. Затем мембрану отмывали дважды по 15 мин в буфере А.

Мембрану детектировали с помощью красителя 1 Step NBT/BCIP (Thermo scientific). Результат и степень интенсивности окраски полос фиксировали на анализаторе Syngene с помощью программы Gene tools.

3. Методы получения и изучения физико-химических свойств липосом с

лизатом клеточных линий меланомы

3.1. Получение многослойных липосом

Многослойные липосомы готовили следующим образом: навески лецитина и холестерина (мольное соотношение компонентов 3:1) растворяли в небольшом объеме хлороформа. Для предотвращения окисления липидов добавляли антиоксидант – а-токоферола ацетат в количестве 0,01% от общего количества липидов. Полученную смесь липидов выдерживали, периодически помешивая, до полного растворения липидов. Растворитель отгоняли в вакууме водоструйного насоса (4±2 мм рт.ст.) на роторном испарителе, при температуре бани + 40°С. После полного удаления органического растворителя на стенках колбы образовывалась тонкая пленка фосфолипидов.

В качестве криопротектора использовали сахарозу в концентрации 10% от общего количества липидов. Для этого сахарозу растворяли в изотоническом растворе. Затем к раствору сахарозы прибавляли клеточный лизат в различных соотношениях лизат : липиды (1 : 108, 1 : 217 по весу). После чего липидную пленку смывали этим раствором при температуре 38°С до образования белой эмульсии (дисперсия многослойных липосом). Включение лизата проходило по принципу пассивной загрузки.

3.2. Определение размера липосом  методом оптической микроскопии

Размеры липосом определяли методом оптической микроскопии с помощью интерференционно – поляризационного микроскопа иммерсионным методом. Использовали оптический микроскоп МРI-3, увеличение х20.

Пробу для микроскопирования готовили путем тщательного диспергирования 5 мг препарата в 5 мг инертной дисперсионной среды. В качестве дисперсионной среды использовали вазелиновое масло.

Каплю полученной суспензии наносили на предметное стекло пипеткой. Измеряли и изучали не менее 200 частиц, если частицы различались по размерам в несколько десятков раз, и 1000 частиц при большей полидисперсности образца. Размер частиц не превышал 100 мкм.

3.3.Определение структуры липосом методом электронной микроскопии

Регидратированные в дистиллированной воде образцы липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины (ЛЛФПВ) смешивали 1:1 с 1,5% раствором глютарового альдегида в фосфатном буфере. После 30 мин фиксации при 40С препараты в количестве 5 мл центрифугировали 1 час при 30 000 об/мин на ультрацентрифуге L-8 Beckman. Осадок дважды отмывали от фиксатора дистиллированной водой и проводили постфиксацию 2,5% раствором тетраоксида осмия в фосфатном буфере. Препараты обезвоживали окисью пропилена и этанолом в возрастающих концентрациях и заливали в эпоскидную смолу (смесь эпон/аралдит). Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut (Reichert, Austria), окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца.

Препараты просматривали на просвечивающем электронном микроскопе JEM-IOOS фирмы JEOL (Япония) при инструментальном увеличении 10 000 – 50 000.

3.4. Определение эффективности включения лизата в липосомы

Определение процента включения белка в липосомы проводили методом спектрофотометрии при длине волны 260 нм и 280 нм. Разделение липосом с лизатом от не включившихся белков проводили ультрацентрифугированием при 50 тыс. об/мин в течение 15 мин. Супернатант, содержащий не включившийся антиген, декантировали, а осадок липосом ресуспендировали в физиологическом растворе NaCl 0,9% и снова центрифугировали. Процесс промывания липосом повторяли до удаления остаточного количества белка в супернатанте, содержание которого контролировали на спектрофотометре. После последнего центрифугирования осадок липосом суспендировали в требуемом объеме физиологического раствора NaCl 0,9%, после чего разрушали 5% раствором Тритона Х-100.

Эффективность включения белка (В, %) рассчитывали по формуле:

B=(С × 100%)/Сисх,

где С – концентрация белка, определенная после разрушения липосом;

Сисх – концентрация белка при включении в липосомы.

3.5. Определение степени окисления липидных компонентов.

Степень окисления липидных компонентов определяли по количеству продуктов деградации лецитина с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Для определения ТБК-активных продуктов в образцах 1 мл дисперсии липосом переносили в пробирку с притертой пробкой, добавляли 1 мл буферного раствора (0,15М КСl и 10мМ Трис-HCl) 0,5 мл 30% трихлоруксусной кислоты и 1 мл 0,67%-ного водного раствора ТБК. Полученную смесь интенсивно встряхивали и нагревали на водяной бане в течение 30 минут при температуре 80°С, затем охлаждали в токе холодной воды до комнатной температуры и центрифугировали 10 мин при ω = 3000 об/мин (225g). Полученный раствор переливали из пробирки в кварцевую кювету и измеряли оптическую плотность на длине волны 532 нм и 550 нм относительно контрольного опыта (дистиллированной воды). Концентрацию ТБК-активных продуктов определяли по формуле:

С = (ΔOD VΣ) / ε l Vпр,

где ΔOD – разность оптических плотностей раствора на длинах волн 532 и 550 нм; VΣ, Vпр – суммарный объем и объем пробы соответственно;

ε –коэффициент экстинции 1,56105 л/(моль см); l – оптический путь, мм.

4. Оценка изменений числа ифн- - продуцирующих лимфоцитов в ответ на

стимуляцию ЛЛФПВ in vitro

Незрелые ДК получали путем культивации адгезивных моноцитов периферической крови здоровых доноров. Неадгезивные лейкоциты (обогащенную лимфоцитарную фракцию) замораживали для последующих экспериментов. Индукцию терминальной дифференцировки части ДК вызывали с помощью инкубации в присутствии цитокинового коктейля. Часть зрелых ДК нагружали опухолевым лизатом линий Mel Si, Mel Mtp, Mel Z, Mel Is, Mel Kor. Другую часть зрелых ДК сливали с липосомальным лизатом.

После получения зрелых и нагруженных ДК их использовали для активации лимфоцитов. Для этого лимфоциты, полученные от того же донора (аутологичные лимфоциты), размораживали и помещали в лунки 6-луночного планшета и смешивали со стимуляторами (незрелыми, зрелыми и нагруженными ДК) в нужном соотношении, подобранном в ходе предварительных опытов. В качестве положительного контроля использовали лимфоциты, стимулированные неспецифическим активатором — фитогемагглютинином (ФГА) 10 мкг/мл. Негативным контролем служили аутологичные лимфоциты без добавления стимуляторов. После смешивания со стимуляторами планшеты с лимфоцитами инкубировали в течение 18 часов при 370С в атмосфере 5% СО­2. Через 18 часов лимфоциты снимали с планшета и подсчитывали. Необходимое количество клеток отбирали и использовали для постановки реакции ELISpot.

Всего эксперимент был повторен на материалах от 3 доноров. Сравнивалось количество лимфоцитов, активирующихся в ответ на стимуляцию зрелыми ДК, дендритными клетками, нагруженными лизатом и дендритными клетками, нагруженными липосомальным лизатом. Для внутреннего контроля использовали пустые липосомы. Активация лимфоцитов оценивалась по продукции ими IFN и выявлялась с помощью реакции ELISpot .

Статистическая обработка результатов. Относительную погрешность среднего результата измерения оценивали, используя критерий распределения Стьюдента (t(P,f)).

Результаты исследований

1. Определение уровня Hsp70 на клеточных линиях меланомы.

Во всех 15 анализируемых клеточных линиях меланомы был обнаружен белок с молекулярной массой 70 кДа, соответствующий полноразмерному белку Hsp70. Количество Hsp70 варьировало как в различных клеточных линиях, так и в зависимости от предварительной обработки клеток.

Так, самое низкое содержание Hsp70 в интактных клетках обнаружено на линиях Mel Si, Mel Kor, Mel Ibr, Mel Ch. Высокое содержание Hsp70 в интактных клетках зафиксировано в линиях Mel Me, Mel Is, Mel Z.

Высокий уровень экспрессии Hsp70 в клетках после прогревания при 420С в течение 10 мин наблюдали на клеточных линиях Mel Me, Mel Si.

Наибольшее количество Hsp70 в клетках, подвергнутых предварительной заморозке, обнаружили на клеточных линиях  Mel Mtp, Mel Is, Mel P, Mel Kor, Mel Z (Рис 1).

Полученные данные указывают на то, что наиболее высокий уровень Hsp70 имеют клетки после предварительной заморозки.

Анализ уровня Hsp70 использовали в процессе создания, хранения и контроле качества липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины.

Рис.1. Уровень Hsp70 на клеточных линиях меланомы человека

инт.- интактные клетки; t - клетки, прогретые при 420С в течение 10 мин на водяной бане; fr –клетки, замороженные при t=-800С.

  1. . Выбор оптимального соотношения липидов для создания

липосомальной вакцины.

При изыскании оптимального соотношения ЯФХ:ХОЛ использовали соотношения 5:1, 3:1 и 2:1.  Размер частиц и эффективность включения лизата в липосомы при различных соотношениях ЯФХ:ХОЛ представлены в табл.1.

Средний диаметр липосом и эффективность нагрузки лизата в везикулы с липидным соотношением (5:1) составляли 8 мкм и 42,10% , с липидным соотношением (3:1) составили 6 мкм и 64,7%, а с (2:1) - 5 мкм и 51,5%.

 

Таблица 1

Эффективность включения лизата в липосомы и средний диаметр везикул с разными липидными соотношениями (n=5)

Молярное соотношение ЯФХ:ХОЛ

5:1

3:1

2:1

Эффективность включения лизата в липосомы (%)

42,10 ± 2,2

64,70*, # ± 1,3

51,50*±1,2

Средний диаметр липосом (мкм)

8

6

5

* - р< 0,05 (достоверность различий по отношению к составу 2:1)

# - p < 0,05 (достоверность различий по отношению к составу 3:1)

Липосомы состава №2 (3:1) оказались более однородными по размеру и имели большую эффективность включения. Таким образом, в результате технологических исследований подобрано оптимальное молярное соотношение липидов ЯФХ:ХОЛ - 3:1 для создания ЛЛФПВ.

3. Выбор оптимального соотношения суммарные липиды : лизат для

создания липосомальной формы вакцины

При использовании раствора лизата с концентрацией 2,5 мг/мл соотношение суммы липидов: лизат составляло 108:1 (по весу); а при 1,25 мг/мл -  217:1 (по весу). Полученные результаты представлены в табл.2.

Таблица 2

Выбор соотношения сумма липидов: лизат для приготовления липосомальной формы вакцины

Соотношения сумма липидов:лизат

Компоненты липосом 

Молярное соотношение

Молярная масса

Масса (г)

108:1

яичный фосфатидилхолин

300 мкмоль

760

0,2280

Холестерин

100 мкмоль

386,66

0,0390

-токоферола ацетат

10 мкмоль

472,74

0,0047

Лизат

0,0025

217:1

яичный фосфатидилхолин

300 мкмоль

760

0,2280

Холестерин

100 мкмоль

386,66

0,0390

-токоферола ацетат

10 мкмоль

472,74

0,0047

Лизат

0,00125

Получали 2 липосомальных дисперсии, которые не расслаивались до 30 дней при температуре 100С. Средний размер липосом состава 108:1 и состава 217:1, определенный методом оптической микроскопии, составлял 6 мкм.

В результате проведенных технологических исследований установлено, что устойчивость липосом и средний размер везикул липосомальной дисперсии двух составов не отличаются друг от друга. 

Результаты эффективности включения лизата в липосомы приведены в таблице 3.

Таблица 3

Оценка влияния соотношения суммы липидов: лизат на эффективность включения лизата в липосомы.

108:1

217 : 1

эффективность включения (%)

метрологические характеристики

эффективность включения (%)

метрологические характеристики

64,3

63,7

62,0

64,1

  = 63,5*

S = 1,05

x  = 1,67

  = 1,65 %

54,2

58,7

53,5

57,5

  = 55,9

S = 2,52

x  = 4,01

  = 4,51 %

Ошибка! Закладка не определена.

* - р<0,01 (достоверность различий по отношению к составу 108:1)

При соотношении 108:1 эффективность включения лизата в липосомы составила 63,5 %, что в 1,13 раза больше чем при соотношении 217:1. Таким образом, оптимальное суммарное соотношение (по весу) сумма липидов : лизат для создания липосом с лизатом оказалось 108:1.

4. Выбор криопротектора  и разработка режима лиофилизации ЛФПВ

Для стабилизации липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины в процессе хранения разрабатывали методику лиофилизации. Исследовали разные режимы замораживания и сублимационной сушки препарата. Оценку влияния способа замораживания и сублимационной сушки липосомальной дисперсии на качество готового продукта проводили по таким критериям, как внешний вид лекарственной формы, остаточная влажность, размеры везикул и включение лизата в липосомы.

Лиофильное высушивание липосомальной дисперсии проводили в трех различных режимах. Графики сублимационной сушки представлены на рис. 2.

Рис. 2. Графики сублимационной сушки липосомальной дисперсии.

На основании проведенных исследований выбрали постепенное замораживание полок сублимационной камеры от + 200С до – 700С и постепенное замораживание препарата до – 40 … – 45 0С с выдержкой при данной температуре в течение 3 ч. Продолжительность замораживания составляла 6 - 8ч. Общее время лиофильного высушивания составило 27 часов.

Использование в качестве криопротекторов лактозы и сахарозы в водной фазе липосомальной дисперсии (внутри и снаружи) с последующим замораживанием и сублимацией, позволило предупредить фазовое разделение липидной композиции, предохранить лизат от вытекания и сохранить способность липосом к регидратации. Проведенный эксперимент показал, что по внешнему виду дисперсии липосом с разными криопротекторами не различались друг от друга. После лиофильной сушки липосомальных дисперсий с лактозой и сахарозой структуры и средний размер липосом с лизатом практически не отличались от параметров определенных до лиофилизации.

Как видно из представленных в таблице 4 данных, после лиофилизации эффективность включения лизата в липосомы изменилась: с 55,8 % уменьшилась до 54,5 % в случае сахарозы, и с 55,2 % до 54,3 % в случае лактозы.

Таблица 4

Эффективность включения лизата в лиофильно-высушенные липосомы до и после лиофилизации

№ образца

До лиофилизации

После лиофилизации

Эффективность включения, %

Метрологические характеристки

Эффективность включения, %

Метрологические характеристки

Липосомы с сахарозой

52,1

59,5

58,4

53,1

= 55,8 %

S= 2,35

x = 3,74

  = 4,21 %

55,5

54,6

54,6

53,1

=  54,5 %

S=  0,99

x = 1,58

  = 1,81 %

Липосомы с лактозой

54,0

57,5

52,5

56,8

  = 55,2 %

S= 2,35

x = 3,74

  = 4,25 %

54,0

55,6

53,5

54,1

  =  54,3 %

S=  0,91

x = 1,44

  = 1,68 %

5. Использование гамма-облучения для стерилизации ЛЛФПВ-лио

Запаянные флаконы с образцами лиофильно-высушенных липосом как нагруженных клеточным лизатом, так и пустых, облучали на гамма-установке  К-200000 с источником Со 60  в дозах 5, 12 , 17  и 25 кГр/мин.

Флаконы с лиофилизированным препаратом в завальцованном виде доставлялись в лабораторию микробиологической диагностики и лечения инфекций в онкологии НИИ КО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. В лаборатории был сделан посев разведенного физиологическим раствором препарата, затем, сразу после посева, во флаконы были внесены тест-культуры S.aureus, E.coli, C.albicans. После облучения проводился посев обработанного препарата.

Результаты посева препарата после внесения тест-культур и последующей стерилизации представлены в табл. 5.

При облучении флаконов без препарата, содержащих только питательную среду и контрольные тест-культуры микроорганизмов, при 5 кГр также был зафиксирован рост C. albicans. При посеве препарата с тест-культурами микроорганизмов без облучения выявлен рост контрольных микроорганизмов и Bacillus spp.

Таблица 5.

Результаты посева протеолипосом после внесения тест-культур и последующей гамма-стерилизации

До стерилизации

Режим стерилизации

Результат посева после стерилизации

5 кГр

12 кГр

17 кГр

25кГр

Инокуляция S. aureus

Роста нет

Инокуляция E. coli

Роста нет

Инокуляция C. albicans

Рост C. albicans и Bacillus spp

Инокуляция S. aureus

Роста нет

Инокуляция E. coli

Роста нет

Инокуляция C. albicans

Роста нет

Инокуляция S. aureus

Роста нет

Инокуляция E. coli

Роста нет

Инокуляция C. albicans

Роста нет

Инокуляция S. aureus

Роста нет

Инокуляция E. coli

Роста нет

Инокуляция C. albicans

Роста нет

Гамма-облучение лиофильно-высушенного липосомального препарата, содержащего лизат клеточных линий Mel P, Mel Mtp, Mel Is, Mel Z, Mel Kor, в дозах 5, 12, 17 и 25 кГр показало стерилизующее действие в дозе от 12 до 25 кГр с сохранением стабильности Hsp70 (Рис.3).

Рис. 3. Уровень Hsp70 в протеолипосомах после гамма-облучения (Со60):

1-контроль (образец ЛЛФПВ без облучения);  2- ЛЛФПВ, облученные при 5 кГр; 3- ЛЛФПВ, облученные при 12 кГр; 4- ЛЛФПВ, облученные при 17 кГр; 5- ЛЛФПВ, облученные при 25 кГр.

Оптимальная доза гамма-облучения протеолипосом составила 12 кГр, т.к. при этом обеспечивается стерильность и сохраняются основные физико-химические показатели липосомального препарата.

6. Исследование биофармацевтических показателей ЛЛФПВ-лио после гамма-

стерилизации.

До и после гамма-облучения ЛЛФПВ-лио определяли размер, форму, структуру, степень нагрузки лизата в липосомы, pH, остаточную влажность, продукты деградации лецитина с 2-ТБК, уровень Hsp70, а также оценивали степень биологической активности.

Форму и стуктуру липосом до и после гамма-облучения оценивали с помощью просвечивающемго электронного микроскопа JEM-IOOS фирмы JEOL (Япония) при инструментальном увеличении 10 000 – 50 000.

 

Рис. 4. Электронная микрофотография протеолипосом до (А) и после(Б) гамма-облучения в дозе 12 кГр (x 50000).  Размер частиц 6000 мкм.

Рис. 5. Размеры и форма протеолипосом до (А) и после (Б) лиофильного высушивания и гамма-облучения в дозе 12 кГр (x20).

При сравнении формы и структуры липосом до и после облучения методами оптической и электронной микроскопии не было выявлено значительных изменений. Средний размер протеолипосом, определенный с помощью оптической микроскопии (интерференционно-поляризационный микроскоп MPI -3), до и после облучения в дозах 5 кГр, 12 кГр, 17 кГр и 25 кГр составил 6 мкм (Рис.5).

При определении продуктов, дающих характерную реакцию с ТБК, было установлено, что после облучения протеолипосом в дозе 12 кГр концентрация малонового диальдегида (МДА) не изменилась и составила 3,5 нмоль/мл. После облучения протеолипосом в дозах 5 кГр концентрация МДА составила 3,5 нмоль/мл, 17 кГр - 4,1 нмоль/мл, 25кГр - 4,8 нмоль/мл (Рис. 6).

Рис 6. Определение продуктов деградации лецитина с

2-тиобарбитуровой кислотой

Проект Фармакопейной статьи предприятия на «Липосомальная противомеланомная вакцина, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2,5 мг» разработан в соответствии с требованиями ОСТа 91400.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения", ОСТа 42-2-72 “Лекарственные средства. Порядок установления сроков годности” и Государственной фармакопеи ХI иХII издания.

Приведенные ниже критерии и параметры качества, а также методы исследования приняты на основании действующих нормативных документов и результатов экспериментального изучения образцов лекарственной формы «Липосомальная противомеланомная вакцина, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2,5 мг». ФСП предусматривает определение в препарате следующих показателей:

Все испытанные серии препарата представляли собой лиофилизированную сухую пористую массу белого цвета. При растворении содержимого флакона в воде получали дисперсию белого цвета.

Анализ уровня Hsp70 в образцах ЛЛФПВ – лио показал, что образцы вакцины стабильны по содержанию Hsp70. Уровень Hsp70 находился в пределах 14 - 16% от уровня - актина (Рис.7).

Рис.7. Уровень Hsp70 в образцах ЛЛФПВ-лио:

  1. маркеры молекулярных весов, 42кДа - - актин, 70кДа - Hsp70;
  2. электрофореграмма лизата клеточных линий меланомы человека  Mel Is, Mel Mtp, Mel P, Mel Z, Mel Kor;
  3. лизат клеточных линий меланомы человека  Mel Is, Mel Mtp, Mel P, Mel Z, Mel Kor (иммуноблот);
  4. образцы ЛЛФПВ-лио.

Определение рН проводили потенциометрически согласно требованиям ГФ ХI, вып.1, с.113. Для всех испытанных серий препарата значение рН неразбавленных растворов препарата находилось в пределах 5,7 – 6,7.

По фактическим данным в каждом флаконе содержалось количество препарата, соответствующее требованиям ГФ ХI, вып.2, с.140. Средняя масса содержимого флакона находилась в пределах 90 – 100мг. Отклонение от средней массы не превышало ±10 %.

Средний размер везикул находился в пределах 6 мкм. Размер частиц не изменился при хранении ЛЛФПВ-лио в течение 12 месяцев.

Во всех исследованных образцах лекарственной формы эффективность включения активного вещества в липосомы не менее 53% (Табл. 6).

Таблица 6

Эффективность включения лизата в лиофильно-высушенные липосомы после гамма-облучения

образца

Криопротектор – сахароза

Криопротектор - лактоза

Эффективность включения, %

Метрологические характеристики

Эффективность включения, %

Метрологические характеристики

1

55,3

= 55,1 %

t (p, f) = 2,57

S= 1,09

x = 1,14

= 1,97 %

52,0

= 53,7 %

t (p, f) = 2,57

S= 1,85

x = 1,95

= 3,4 %

2

54,5

55,6

3

55,0

53,2

4

53,6

51,5

5

55,7

54,3

6

56,8

56,0

Проведенные исследования показали, что количество малонового диальдегида в лиофильно-высушенных липосомах противомеланомной вакцины с антиоксидантом составляло – 3,54 ± 0,025 нмоль/мл в случае использования криопротектора сахарозы и 3,62 ± 0,06 нмоль/мл с криопротектором лактозой (табл.7).

Таблица 7

Количество МДА в лиофильно-высушенных липосомах противомеланомной вакцины с -токоферола ацетатом.

№  образца

Криопротектор-сахароза

Криопротектор-лактоза

Содержание  МДА

Метрологические характеристики

Содержание  МДА  в образцах, нмоль/мл

Метрологические характеристики

  в образцах, нмоль/мл

1

3,51

  = 3,54

S= 0,023

x = 0,025

= 0,65 %

3,57

  = 3,62

S= 0,059

x = 0,061

= 1,63%

2

3,55

3,64

3

3,52

3,68

4

3,57

3,65

5

3,53

3,53

6

3,56

3,66

Маркировка и транспортирование полученного лекарственного средства предусмотрена в соответствии с действующими в настоящее время ОСТами и Инструкциями.

Выбор условий хранения осуществлен на основе изучения свойств «Липосомальной противомеланомной вакцины, лиофилизата для приготовления раствора для инъекций 2,5 мг», а именно: при температуре не выше +40С.

Определение качества препарата при хранении проводили через каждые три месяца хранения по методикам, разработанным для стандартизации препарата. В течение 12 месяцев хранения все серии данной лекарственной формы сохраняли химико-фармацевтические характеристики.

7. Результаты изменений числа ифн- - продуцирующих лимфоцитов в

ответ на стимуляцию ЛЛФПВ.

Среднее число (±SD) IFN-продуцирующих нестимулированных лимфоцитов на 100 000 после исключения крайних значений составило 3,415 (±2,043); при добавлении стимуляторов (цитокин-активированные ДК, нагруженные ДК лизатом и нагруженные ДК липосомальным лизатом) среднее число (±SD) IFN-продуцирующих лимфоцитов на 100 000 клеток после исключения крайних значений составило 7 (±2,541), 9.7 (±3,764), 10,21 (±2,54) соответственно (Табл. 8).

Таблица 8

Активация донорских лимфоцитов при стимуляции дендритными клетками, стимулированными различными методами.

Активатор

Число IFN-продуцирующих лимфоцитов на 100 000 клеток

Среднее (±SD)

Медиана (диапазон)

Нестимулированные лимфоциты

3,415 (±2,043)

3,6 ( 0 – 6);

Лимфоциты + цитокин-активированные ДК

7 (±2,541)

7,4 (2–13);

Лимфоциты + ДК, нагруженные лизатом

9,7 (±3,764)

9,8 (4–15)

Лимфоциты + ДК, нагруженные липосомальным лизатом

10,21 (±2,54)

10,3 (7–16)

Медиана числа IFN-продуцирующих нестимулированных лимфоцитов на 100 000 после исключения крайних значений (выпадающих за пределы ±2) составила 3,6 (диапазон от 0 до 6); при добавлении стимуляторов (цитокин-активированные ДК, нагруженные ДК лизатом и нагруженные ДК липосомальным лизатом) медиана числа IFN-продуцирующих лимфоцитов на 100 000 клеток после исключения крайних значений составила 7,4 (диапазон от 2 до 13), 9,8 (4–15) и 10,3 (7–16), соответственно.

Общие выводы

  1. Разработаны стандартные липосомальные лекарственные формы противомеланомной вакцины, содержащей лизат клеточных линий меланомы человека Mel P, Mel Mtp, Mel Is, Mel Z, Mel Kor.
  2. Определены параметры и критерии стандартности липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Разработаны хроматографические методики для качественного и спектрофотометрические для количественного определения препаратов в новой липосомальной лекарственной форме.
  3. На основании разработанного режима сублимационной сушки липосомальной формы противомеланомной вакцины выбран состав липосом с криопротектором сахарозой. Установлен режим гамма-облучения липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины для обеспечения стерильности, при которой сохраняются основные физико-химические показатели липосомального препарата. Методом иммуноблот показано, что стабильность Hsp70 в липосомальной лекарственной форме противомеланомной вакцины сохраняется.
  4. Разработан проект ФСП на «Липосомальная противомеланомная вакцина, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2,5 мг и проведен контроль качества шести наработанных серий препарата при хранении при температуре +40 С в течение одного года.
  5. Показано, что число IFN-продуцирующих лимфоцитов статистически значимо увеличивается в ответ на стимуляцию ДК, нагруженными лизатом (по сравнению с негативным контролем). Отмечена тенденция к увеличению количества IFN-продуцирующих лимфоцитов при стимуляции ДК липосомальным лизатом по сравнению с ДК, нагруженными лизатом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

  1. Baryshnikov A.Y., Kosorukov V.S., Sokolova D.V., Mikhailova T.V., Sokolova Z.A., Kosobokova E.N., Skrypnik E.A., Dorokhov Y.L. Monoclonal antibodies as a tool for drug delivery system // Abstracts of the Second Nanotechnology international Forum participants. – Moscow, 2009. – P.524-525.
  2. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Бурова О.С., Морозова Л.Ф, Михайлова И.Н., Барышников А.Ю. Сравнение уровня экспрессии Hsp70 на клеточных линиях меланомы // Российский Биотерапевтический Журнал. –2010. –№1. –С.43-47.
  3. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Михайлова И.Н., Барышников А.Ю. Экспрессия Hsp70 на клеточных линиях меланомы человека // Российский Биотерапевтический Журнал. –2010. –№2. –С.54.
  4. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Клименко О.В., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Разработка липосомальной формы антимеланомной вакцины // Сборник трудов V Всероссийской школы-семинара студентов, аспирантов и молодых ученых по тематическому направлению развития ННС «Нанобиотехнология». – Белгород, 2011. – С. 55-57.
  5. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Багирова Н.С., Дуфлот В.Р., Барышников А.Ю. Разработка липосомальной формы противоопухолевой вакцины // Российский Биотерапевтический Журнал. –2011. –№4. –С. 61-65.
  6. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Багирова Н.С., Дуфлот В.Р., Барышников А.Ю. Использование гамма-облучения для стерилизации многослойных протеолипосом  // Российский Биотерапевтический Журнал. –2012. –№1. –С – 64-66.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.