WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

       

БУКАТИНА ТАТЬЯНА МИХАЙЛОВНА

ПОИСК АНТАГОНИСТОВ  ПУРИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ

СРЕДИ КОНДЕНСИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ   ИНДОЛА

И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

14.03.06 Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Волгоград 2012

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр»

Научный руководитель:

Академик РАМН,

заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук,

профессор Спасов Александр Алексеевич

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, Резников Константин Михайлович

доктор медицинских наук,

профессор

доктор биологических наук  Бугаёва Любовь Ивановна

Ведущая организация: ФГБУ НИИ Фармакологии им. В.В.Закусова РАМН

Защита диссертации состоится «7» ноября 2012 г. на заседании Диссертационного Совета Д 208.008.02 ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ (400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Автореферат разослан «….» …………………. 20.. г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, Бабаева А.Р.

доктор медицинских наук,

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы.

Нарушения регуляции функциональной активности тромбоцитов, ведущие к увеличению тромбогенного потенциала крови, могут быть причиной тромбоэмболии сосудов головного мозга, легких, почек [Суслина З.А., Танашян М.М., 2003; Deepak L., Topol B.E., 2003; Кубатиев А.А., 2009]. Показано участие тромбоцитов в патогенезе столь распространённых в настоящее время заболеваний, сопровождающиеся диссеминированным внутрисосудистым свёртыванием крови [Leon C., 2004], а также атеросклероза [Rauch U. et al., 2001; Панченко Е.П., 2005], ишемической болезни сердца [Levy J.H., Smith P.K., 2000; Steimle A.E., Lange R.A., Hillis L.D., 2004; Лупанов В.П., 2005], диабетической ангиопатии [Балаболкин М.И., 2000; Bae S.H. et al., 2003; Matsuno H. et al., 2004].                                

К настоящему времени в клинической практике среди антиагрегантных средств широкое применение нашли препараты блокаторы P2Y12 пуриновых рецепторов тромбоцитов – тиклопидин и клопидогрель [Грацианский Н.А., 2010]. Однако такие побочные явления как развитие гематологических осложнений, аллергические реакции, кровотечений различного генеза ограничивают их назначение [Pereillo J., Maftouh M., 2002].                        

В настоящее время накоплен обширный фактический материал, свидетельствующий о том, что P2Y1-тромбоцитарные рецепторы могут представлять собой перспективную мишень для создания группы антитромбоцитарных препаратов  с новым механизмом антиагрегантного действия [Зиганшин А.У., Зиганшина Л.Е., Бернсток Дж., 2002; Marcet B., Chappe V. Delmas et. el, 2004; Morales-Ramos A.I., Mecom J.S., Kiesow T.J. et. el., 2008]. Это объясняется тем, что активация данного подкласса P2Y-рецепторов на мембране тромбоцитов приводит к инициации стадии их контактной активации, при которой процесс агрегации обратим [Hechler B., Vigne P., Lon C., Breittmayer  J. P. et. el, 1998].                                

Химический класс индолов считается перспективным для разработки гемореологических препаратов – эффективных ингибиторов агрегации тромбоцитов [Черников М.В. и др., 2006; Abbracchio М.P., Burnstock G., Boeynaems J.-M. et. el., 2006; Baurand A., Gachet C., 2008]. Учитывая данный факт, представляется интересным поиск веществ, избирательно блокирующих пуриновые рецепторы тромбоцитов, в частности, Р2Y1-рецепторы, среди новых соединений ряда индола: N-[(1-R1 -амино) карбонил-2-(1-R2-1H-индол-3-ил) винил]-R3-амидов и 1-R1-амино-3-(3-R2-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолов. Настоящее исследование является составной частью научно-исследовательской работы «Изучение рецепторной активности синтетических гетероциклических азотсодержащих соединений» (№ государственной регистрации 01200809579) , входящей в план НИР ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр» на 2008-2010 гг., и работы «Поиск и изучение фармакологической активности новых производных конденсированных гетероциклических систем» (№ государственной регистрации 01200609440), входящей в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета на 2007-2012 гг. Тема утверждена на заседании Специализированного Совета университета (протокол № 10 от 25.11.2009 г.).        

Цель исследования. Поиск антагонистов P2Y1-рецепторов среди производных ряда индола – N-[(1-R1-амино) карбонил-2-(1-R2-1H-индол-3-ил) винил]-R3-амидов и 1-R1-амино-3-(3-R2-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолов – и изучение антиагрегантных и антитромботических свойств наиболее активных веществ.                                                        

Для достижения указанной цели представляется необходимым решение следующих задач:

  1. Изучить P2Y1-антагонистическую активность новых веществ производных индола и вещества сравнения in vitro;
  2. Провести анализ зависимости между химической структурой и функциональной активностью исследованных соединений по отношению к Р2Y1 - рецепторам тромбоцитов;
  3. Исследовать острую токсичность соединений, проявляющих наибольшую активность, рассчитать их терапевтический индекс и выбрать наиболее эффективные вещества для доклинического изучения специфической фармакологической активности;
  4. Изучить влияние наиболее эффективного вещества и препаратов сравнения на показатели сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза;
  5. Оценить влияние наиболее активного соединения на вязкостные параметры крови;
  1. Исследовать антитромботические свойства наиболее активного соединения и препаратов сравнения на моделях экспериментального тромбоза  сонной артерии крыс (индуцированного поверхностной аппликацией хлоридом железа (III), электрическим током), генерализованного АДФ-индуцированного тромбоза на мышах;
  2. Провести оценку общетоксикологических свойств наиболее активного соединения.

       Научная новизна.

       Впервые было проведено исследование влияния новых веществ производных ряда индола – N-[(1-R1-амино) карбонил-2-(1-R2-1H-индол-3-ил) винил]-R3-амидов и 1-R1-амино-3-(3-R2-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолов – на первый подтип пуриновых рецепторов мембраны тромбоцитов. Впервые была установлена взаимосвязь между структурой новых соединений и их Р2Y1-антагонистической активностью. Установлено, что выраженность данного вида активности у замещённых амидов ряда индола определяется строением заместителей, а так же их сочетанием у атома углерода в положении 7, а у аминоспиртов ряда индола – радикалами в положении N9.

Впервые в ходе работы получены данные о влиянии соединения Sbt-119 на сосудисто-тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз (на вязкостные характеристики крови, агрегацию, время кровотечения, коагулографические параметры) in vitro и in vivo. Показано, что вещество Sbt-119 проявляет антитромботические свойства на моделях тромбоза сонной артерии крыс, индуцированного поверхностной аппликацией хлоридом железа (III),  и электрическим током, на модели генерализованного АДФ-индуцированного тромбоза на мышах.                

Научно-практическая значимость работы.

Результаты выявленных закономерностей между Р2Y1-антагонистической активностью производных индола и их химической структурой могут служить основой для направленного поиска веществ, обладающих данным видом активности. Получены данные о наличии у соединения Sbt-119 антиагрегантной активности, и способности снижать вязкость крови в условиях in vitro и in vivo. Вещество Sbt-119 обладает антитромбогенным действием  на моделях экспериментальных тромбозов сонной артерии крыс, индуцированного поверхностной аппликацией хлоридом железа (III) и электрическим током, а так же на модели генерализованного АДФ-индуцированного тромбоза на мышах.  Соединение Sbt-119 менее выражено влияет на время кровотечения по сравнению с клопидогрелем.                         

Реализация результатов исследования.

Выявленные закономерности между химической структурой и P2Y1-антагонистической активностью конденсированных производных индола учитываются при синтезе новых соединений в НИИ физической и органической химии Южного Федерального университета. Материалы работы применяются в ГБУ Волгоградском медицинском научном центре,  на кафедре фармакологии  и НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета при проведении научных экспериментов. Результаты работы включены в лекционный материал кафедры фармакологии, фармацевтической химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета, кафедрах фармакологии Саратовского и Кубанского государственных медицинских университетов.        

Основные положения, выносимые на защиту

  1. N-[(1-R1 -амино) карбонил-2-(1-R2-1H-индол-3-ил) винил]-R3 - амиды ряда индола перспективный класс соединений для поиска новых эффективных Р2Y1 – антагонистов.
  2. Соединение Sbt-119 проявляет выраженную P2Y1-антагонистическую активность.
  3. Соединение Sbt-119 оказывает антитромботическое действие в условиях целостного организма при моделировании тромбоцит-зависимых артериальных тромбозов на сонной артерии крыс (индуцированного поверхностной аппликацией хлоридом железа (III), электрическим током) и системного АДФ-индуцированного тромбоза на мышах.

       Апробация работы.

       Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на : II, III Всероссийских научно-практических семинарах для молодых учёных (Волгоград, 2010 г., 2011 г.); 68 – 70-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2010 – 2012 гг.); III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика – 2010» (Москва 2010г.); II международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011 г.); XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2011г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 работ (из них 4 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ).

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 27 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2 – 6), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 46 отечественных и 111 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объектами исследования на наличие P2Y1-антагонистической активности являлись вещества ряда индола – N-[(1-R1 -амино) карбонил-2-(1-R2-1H-индол-3-ил) винил]-R3-амиды (12 соединений) и 1-R1-амино-3-(3-R2-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолы (3 соединения), синтезированные в научно-исследовательском институте физической и органической химии (НИИФОХ) Южного Федерального университета1. При проведении экспериментов использовались вещество сравнения антагонист Р2Y1-рецепторов Basilen blue («Sigma», США), а также препараты сравнения, блокирующие тромбоцитарные P2Y12-рецепторы – тиклопидин (Тиклид, «Sanofi-syntelabo», Франция) и клопидогрель («Sanofi-syntelabo», Франция).                

В работе были использованы следующие реактивы и материалы: натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) («IСN», США), натрия хлорид (х.ч., «Мосреактив», Россия), изотонический раствор натрия хлорида (ЗАО «Рестерс», Россия), трис-(оксиметил)-аминометана гидрохлорид (х.ч., «Мосреактив», Россия) и кальция хлорид (ч.д.а, «Мосреактив», Россия), цитрат натрия (ч.д.а., Реахим, Россия), кислота соляная (х.ч., Россия), динатриевая соль аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) (Sigma, США и Reanal, Венгрия), адреналин гидрохлорид («Ренам», Россия), коллаген («Ренам», Россия), наборы для определения показателей коагулограммы «Тромбо-тест» («Технология–стандарт», Россия), «Техпластин-тест» («Технология–стандарт», Россия), «ТехФибриноген-тест» («Технология–стандарт», Россия), «АПТВ (АЧТВ)-тест» («Технология–стандарт», Россия), хлорид железа (ч., «Мореактив», Россия), хлоралгидрат (Россия), формалин (Acros organics, США), цитрат натрия (Реахим, Россия).





Исследования были выполнены на 12 кроликах породы «Шиншилла» весом 3,5-4,0 кг,  236 белых неинбредных крысах обоего пола массой 250-300 г. и 248 белых неинбредных мышах обоего пола массой 20-32 г., содержащихся в условиях вивария (температура 22-24°С, относительная влажность воздуха 40-50%) с естественным световым режимом, на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92). Проведение экспериментов одобрено Региональным независимым этическим комитетом при Волгоградском научном центре РАМН и Администрации Волгоградской области (протокол заседания № 108-2009 от 26.12.09) и выполнено в соответствии с принципами биоэтики, правилами лабораторной практики (GLP); соответствует этическим нормам, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и в соответствии с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики» и МЗ СССР №755 от 12.08. 1977.

Исследования in vitro и in vivo. В экспериментах in vitro соединения изучались в концентрациях 0,1; 1,0 и 10 мкМ.  При выполнении исследований in vivo наиболее активное соединение Sbt-119 и препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель вводились животным перорально за два часа до эксперимента в эквимолярных дозах, соответствующих средней терапевтической дозе тиклопидина  – 6,0; 11,63 и 7,32 мг/кг соответственно. Контрольные животные получали эквивалентный объем 0,9% раствор натрия хлорид.

P2Y1-антагонистическую активность веществ изучали в экспериментах in vitro методом малоуглового светорассеяния [Сакаев М.Р. и соавт., 2000] на приборе «Ласка-1К» (С.-Петербург, Россия).

С целью ранжирования соединений по степени выраженности их P2Y1-антагонистической активности в концентрации 1 мкМ был выполнен кластерный анализ с использованием вероятностного метода гистограмм [Мандель И. Д., 1988].

Показателем эффективности веществ являлась концентрация, при которой происходило ингибирование активации тромбоцитов на 20% (ЕС20), рассчитанная методом регрессионного анализа.

Влияние вещества Sbt-119 и препаратов сравнения – тиклопидина и клопидогреля  – на агрегацию тромбоцитов in vitro и in vivo изучали по методу Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. и др. (1989) на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов НПФ «Биола» 220LA (Россия). В качестве индукторов агрегации использовали АДФ (Sigma, США) в конечной концентрации 5 мкМ, адреналин – 10 мкМ, коллаген – 50 мг/кг. Забор крови в исследованиях in vivo осуществляли из брюшной артерии крыс под хлоралгидратным (400 мг/кг) наркозом.

Оценку влияния соединения Sbt-119 и препаратов сравнения на вязкостные характеристики  крови проводили методом ротационной вискозиметрии со свободно плавающим цилиндром-ротором [Доброволь-ский Н.А., 1989] на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия). In vitro исследовали вязкость крови (гематокрит 45%) на модели «повышенной вязкости крови in vitro», вызванной прогреванием образцов в течении 1-го часа при 42,5 С [Плотников М.Б. и др., 1996] и взвеси стандартизированных отмытых эритроцитов, in vivo – кажущуюся вязкость цельной и вязкость стандартизированной крови крыс, взятой из брюшной артерии животных. По результатам динамики кажущейся вязкости цельной и стандартизированной крови, вязкости крови при моделировании синдрома гипертермии рассчитывали индекс агрегации (ИАЭ, у.е.) [Киричук В.Ф. и др., 2004].

Хронометрически, на гемокоагулометре «SOLAR» (Белоруссия) с использованием наборов реактивов производства («Технология–стандарт», Россия) были определены показатели коагулограммы: тромбиновое, протромбиновое, активированное парциальное тромбопластиновое время и содержание фибриногена [Баркаган З.С., Момот А.П., 1999].

Антитромботическая и тромболитическая активности веществ изучались  на образцах цельной крови крыс по методу D.A. Goroga (2009) на приборе «Global Thrombosis Test» (Montrose Diagnostics Ltd, Великобритания). Для усиления пуринового механизма активации тромбоцитов в пробирку предварительно вносили 0,5 мл раствор, содержащего 5 мкМ АДФ. Антитромботическую и тромболитическую активности веществ оценивали по времени наступления окклюзии (OT, сек.) и лизиса (LT,сек.).        

На моделях артериальных тромбозов, индуцированных аппликацией 50% раствора хлорида железа (III) [Kurz K.D., 1990] и воздействием анодного электрического тока [Guglielmi G., Vinuela F., Sepetka I., Macellari V., 1991] на сонную артерию крыс оценивалась динамика снижения линейной скорости кровотока в области повреждённого сосуда на 50; 90; 95 и 99,9 %. Для исследования влияния соединений на время образования тромба использовали ультразвуковой компьютеризированный аппарат «Минимакс-Доплер–К» (Санкт-Петербург).        

Модель генерализованного АДФ-индуцированного тромбоза на мышах была воспроизведена в соответствии с методикой Di Minno (1983). В качестве тромботического агента  использовали раствор АДФ в дозе 300 мг/кг.  При морфологическом исследовании легких мышей оценивали наличие  признаков тромбообразования в стенке артериальных сосудов мышечного типа.  Гистологические препараты документировали цифровой камерой Olympus (Japan, 4.0 мегапикселей) на базе микроскопа Micros (Austria) c использованием объектива х10, х40 и окуляра х10.2

Влияние соединения Sbt-119 и препаратов сравнения тиклопидина  и клопидогреля на время кровотечения изучалось на мышах [Liu Y., L Jennings N., M Dart A., Du X.-J., 2012]. Регистрировалось время остановки кровотечения из хвостовой вены животных.

Острую токсичность соединений изучали на мышах при внутрибрюшинном введении. Величину LD50 рассчитывали по методу Личфилда-Вилкоксона.

Изучение общетоксикологических свойств проводили с использованием схемы многотестового наблюдения по С. Ирвину [Irwin S., 1964]. Вещество Sbt-119 вводили однократно внутрибрюшинно лабораторным мышам в возрастающих дозах. Наблюдение проводили в течение трех часов после введения соответствующей дозы соединения.

Статистическая обработка данных. Обработку экспериментальных данных проводили с помощью встроенных функций программы Excel из пакета Office XP (Microsoft, США) (среднее арифметическое значение, стандартная ошибка средней арифметической), программ «Statistica 6.0» (StatSoft, США) и «Graph.Pad.Prism.5.0» (США) с применением t-критерия Манна-Уитни, дисперсионного анализа по Краскеллу-Уолису с постестом Данна, точного метода Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе проведённого исследования было установлено, что среди ряда индола – N-[(1-R1-амино) карбонил-2-(1-R2-1H-индол-3-ил) винил]-R3-амидов 1 из 12 соединений по выраженности P2Y1-блокирующей активности превосходило  вещество сравнения P2Y1-блокатор Basilen blue на 15,5% (р0,05). Три вещества проявили умеренную активность (24,9%), уступая Basilen blue в 1,3 – 1,6 раза (р>0,05). У остальных соединений P2Y1-антагонистический свойства были или слабо выраженные или отсутствовали.

Таблица 1

Распределение исследуемых веществ по степени их P2Y1-антагонистической

активности in vitro

Группа

соединений

Количество соединений (%)

Высоко

активные

Умеренно

активные

Низко

активные

Неактивные

Производные N-[(1-R1 -амино) карбонил-2-(1-R2-1H-индол-3-ил) винил]-R3 –амидов

8,5

24,9

41,7

24,9

Производные 1-R1-амино-3-(3-R2-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолы

0

66,6

33,4

0

В группе веществ производных  1-R1-амино-3-(3-R2-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолов 2 из 3 веществ статистически недостоверно в 1,04 – 1,2 раза уступали Basilen blue, и одно соединение было низкоактивным (табл. 1).

При анализе зависимости  подавления Р2Y1-обусловленной активации тромбоцитов изучаемых соединений от их химической структуры было установлено, что для проявления данного вида биологической активности в ряду замещённых амидов производных индола имело значение строение заместителей, а так же их сочетание у атома углерода в положении 7. Так наиболее высокую активность демонстрировали вещества, имеющие в положении С7 морфолинопропиловый и 4-метифенильный заместители. В ряду аминоспиртов производных индола активность веществ определялась радикалами в положении N9. При этом, наличие метил-(n-бутил)-аминового заместителя или полная его замена на гетероциклический азотосодержащий заместитель (N-азепин) приводило к увеличению P2Y1-антагонистической активности веществ.                                                        

По результатам поиска среди производных индола были выявлены три наиболее перспективных для дальнейшего исследования соединения под лабораторными шифрами Sbt-119, Sbt-815 и Sbt-820.                

При изучении для данных веществ P2Y1-антагонистического эффекта от концентрации было выявлено наиболее активное соединение – Sbt-119.        

Таблица 2

Влияние соединений Sbt-119, Sbt-815, Sbt-820 и Basilen blue на P2Y1-опосредованную активацию тромбоцитов in vitro в диапазоне концентраций 10-0,1 мкМ (M±m)

Соединение

Подавление активации тромбоцитов,  %

IC20, М

Концентрация, мкМ

10

1

0,1

Sbt-119

-27,8±2,17*,

-24,5±0,24*,

-12,8±1,18

5,810-7

Sbt -815

-23,6±5,81*

-20,5±0,67*

-11,3±1,98

1,710-6

Sbt -820

-25,9±1,38*

-17,3±1,16*

-4,7±1,75

1,810-6

Basilen blue

-23,0±1,12*

-21,6±1,01*

-9,9±2,32

1,910-6

*Статистически значимые отличия относительно контрольного измерения (p0,05; критерий Манна-Уитни); Статистически значимые отличия относительно вещества сравнения Basilen blue (p0,05; критерий Краскелла-Уолиса с постестом Данна)

Так,  в концентрациях 10,0; 1,0 мкМ вещество Sbt-119 по степени ингибирования активации тромбоцитов достоверно на 20,8 и 13,4% превышало Basilen blue соответственно. В концентрации 0,1 мкМ Sbt-119 по силе проявления P2Y1-антагонистического эффекта статистически незначимо в 1,2 раза было активнее вещества сравнения. В диапазоне 0,1 – 10,0 мкМ соединение Sbt-119 в 1,13 – 1,17 и в 1,07 – 2,7 раза по уровню P2Y1-блокирующей активности превосходило соединения Sbt-815 и Sbt-820 соответственно (р>0,05).

По показателю IC20, рассчитанному на основании данных результатов, соединение Sbt-119 в 3,2 – 3,4 раза было активнее и вещества сравнения Basilen blue, и опытных соединений  Sbt-820, Sbt-815 (табл. 2).

Исходя из полученных значений LD50, соединение Sbt-119  в 1,5 и 1,3 раза было менее токсичным, чем Sbt-820 и Sbt-815 соответственно. По широте терапевтического действия вещество Sbt-119 в среднем в  1,4 раза превосходило эти соединения. Поэтому для дальнейшего изучения фармакологических эффектов среди соединений, проявивших  P2Y1-антагонистическую активность, было выбрано вещество Sbt-119:

       

При изучении влияния вещества Sbt-119 на агрегацию тромбоцитов в диапазоне концентраций 0,1–10,0 мкМ in vitro было установлено дозозависимое подавление процесса агрегации. С увеличением концентрации вещества его способность ингибировать агрегацию возрастала в среднем в 1,3 раза относительно контрольного измерения (р0,05). В концентрации 0,1 мкМ данное соединение по выраженности антиагрегантного эффекта недостоверно в 3,1% превосходило тиклопидин (табл. 3).

Таблица 3

Влияние соединений Sbt-119 и препарата сравнения тиклопидина на степень подавления агрегации тромбоцитов плазмы интактных кроликов, индуцированной АДФ (5 мкМ) in vitro (M±m)

Соединение

Антиагрегантная активность, %

концентрация, мкМ

10

1

0,1

Sbt-119

-64,2±2,86*

-52,0±6,30*

-39,1±4,59*

тиклопидин

-70,7±8,53*

-60,9±6,32*

-37,9±11,09*

*Статистически значимые отличия относительно контрольного измерения (p0,05; критерий Краскелла-Уолиса с постестом Данна)

В условиях in vivo вещество Sbt-119 на 50,1% эффективнее тиклопидина  ингибировало АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (р0,05). При воздействии индуктора коллагена соединение Sbt-119 статистически незначимо (на 0,6% и 2,0%) превосходило по степени антиагрегантной активности препараты сравнения тиклопидин  и клопидогрель соответственно. Вещество Sbt-119 на 3,2% сильнее тиклопидина подавляло адреналин-индуцированную агрегацию, уступая при этом на 14,5%  клопидогрелю (р>0,05) (табл. 4).

Таблица 4

Влияние соединения Sbt-119, тиклопидина и клопидогреля (в эквимоляльных дозах) при пероральном введении на АДФ-, коллаген- и адреналин - индуцированноую агрегацию тромбоцитов интактных крыс (M±m)

Изучаемое вещество

Антиагрегантная активность, %

индукторы агрегации

АДФ (5мкM)

коллаген (50мкг/мл)

адреналин (10мкМ)

Sbt-119

-72,8±8,27* 

-99,7±0,16*

-84,6±8,75*

тиклопидин

-36,0±6,86

-99,1±1,05*

-81,9±11,45*

клопидогрель

-84,1±7,06*

-97,1±2,92*

-99,0±1,07*

*Статистически значимые отличия относительно контроля; Статистически значимые отличия относительно клопидогреля; Статистически значимые отличия относительно тиклопидин (p<0,05; критерий Краскелла – Уолиса с постестом Данна)

Примечание: дозы соединений эквимоляльны дозе тиклопидина 6 мг/кг

При исследовании веществ, оказывающих антитромботические свойства, рекомендуются тесты, дающие интегральное представление о возможных изменениях коагулогического потенциала крови, как зависящих, так и не зависящих от влияния на функциональную активность тромбоцитов, а именно: тромбиновое время, протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время, уровень фибриногена [Баркаган З.С.,Момот А.П., 1999]. При однократном введении соединения Sbt-119 и препаратов сравнения не было получено статистически значимых изменений показателей тромбинового и протромбинового времени. Наблюдаемое изменение АПТВ в группах животных, получавших как Sbt-119, тиклопидин и клопидогрель не превышали норму – 25 – 38с. Содержание фибриногена уменьшалось по сравнению с контролем в среднем на 12,0% для Sbt-119 и клопидогреля, а в пробах, содержащие тиклопидин – на 6,4% (данные статистически недостоверны).                                

Одним из серьёзных побочных эффектов, существующих на данный момент для антиагрегантных средств, является их способность увеличивать риск развития кровотечений [Gao Z.-G., Hechler B., Besada P. et el., 2008]. При исследовании влияния вещества Sbt-119 на длительность кровотечения было установлено, что данное вещество, так же как и препараты сравнения клопидогрель и ацетилсалициловая кислота в 3,6; 5,8 и 5,0 раз достоверно относительно контроля увеличивали время кровотечения у мышей соответственно.

Тиклопидин так же превосходил контрольные значения, но достоверных отличий у данной группы животных не наблюдалось. Sbt-119 по отношению к клопидогрелю и ацетилсалициловой кислоты сокращал время кровотечения в среднем в 1,3 – 1,8 раза. Однако полученные данные были статистически недостоверны (рис. 1).         

Одним из необходимых этапов исследования веществ, влияющих на систему гемостаза в целом, в том числе и на его сосудисто-тромбоцитарный и коагуляционный его компоненты, является оценка вязкостных свойств крови [Добровольский Н.А. и др., 1998]. Соединение Sbt-119 оказывало стабилизирующее действие на вязкость образцов  цельной и стандартизированной (гематокрит 45%) крови  в условиях in vitro и in vivo, превосходя препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель при средних и низких скоростях сдвига. Так, in vitro вещество Sbt-119 по способности снижать вязкость при скорости сдвига 50с-1 в 1,4 и 1,5 раза превосходило тиклопидин и клопидогрель соответственно, при 30 с-1, 10 с-1 Sbt-119 – только клопидогреля в 1,7; 1,6 раза (р0,05).  В условиях in vivo вещество Sbt-119 достоверно было активнее тиклопидина и клопидогреля на скорости сдвига 30 с-1 на 3,0 и 11,0% соответственно. Sbt-119 и препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель на вязкость взвеси отмытых эритроцитов in vitro не влияли. Поэтому можно предположить, что вещество Sbt-119, так же как тиклопидин и  клопидогрель, оказывают действие на плазменный компонент вязкости крови. 

Опираясь на полученные результаты, в дальнейшем было проведено исследование антитромботических и тромболитических свойств соединения Sbt-119 и препаратов сравнения тиклопидина и клопидогреля в условиях целостного организма.                

На модели артериального тромбоза, индуцированного электрическим током, соединения Sbt-119 и препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель увеличивали время до полной окклюзии сонной артерии.        

                                       

Соединение Sbt-119 относительно контроля статистически значимо в 1,6 раза превосходило значения времени наступления окклюзии. Сравнивания полученные данные об антитромботической активности соединения Sbt-119 с тиклопидином и клопидогрелем было выявлено, что опытное соединение по эффективности достоверно превосходило тиклопидин в среднем в 1,6 раза и уступало клопидогрелю в 1,7 раза.  При этом, среди препаратов сравнения только клопидогрель приводил к увеличению времени снижения скорости течения крови в повреждённой области сосуда в 3,4 – 3,8 раза (р0,05).        Показатели влияния тиклопидина на изменение скорости кровотока не значительно в 1,2 – 1,5 раза превосходили показатель контроля (Рис. 2).

Таким образом, согласно результатам действия вещества Sbt-119 и препаратов сравнения тиклопидина, клопидогреля на динамику скорости кровотока и влияния на время развития тромбоза в области повреждённого сосуда при моделировании тромбозов, индуцированных электрическим током соединения можно расположить следующим образом: клопидогрель > Sbt-119 > тиклопидин.

На модели артериального тромбоза, индуцированного хлоридом железа, вещество Sbt-119 достоверно увеличивало время развития окклюзии в повреждённой области сосуда в 1,8 – 2,6 раза относительно контроля. Сравнительный анализ результатов динамики изменения скорости кровотока между группами животных, получавших опытное соединение и тиклопидин, было установлено, что Sbt-119 по степени выраженности антитромботического эффекта статистически значимо превосходило препарат сравнения тиклопидин в среднем на 18,4% .

Так же вещество Sbt-119 на данной модели артериального тромбоза по степени выраженности антитромботической активности статистически незначимо на 5,8 – 6,7% увеличивало время тромбообразования  относительно препарата сравнения клопидогреля (рис. 3).        

Таким образом, исследованные соединения по степени выраженности антитромботического эффекта на данной модели артериального тромбоза можно расположить следующим образом: клопидогрель = Sbt-119 > тиклопидин.        

Модель генерализованного АДФ-индуцированного тромбоза позволяет оценить влияние соединений на процесс глобальной внутрисосудистой агрегации тромбоцитов, приводящей к множественному тромбозу паренхиматозных органов и сопровождающуюся нарушениями дыхательной функции легких и выраженными двигательными нарушениями вплоть до паралича задних конечностей и гибели животного [Ulrich J.H., 2012].        Соединение Sbt-119 и препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель повышали выживаемость животных, при этом вещество Sbt-119 было эффективнее в 1,2-1,3 клопидогреля и тиклопидина соответственно, что свидетельствовало о наличии выраженных антитромботических свойств у данного соединения.        То есть, согласно результатам выживаемости животных по эффективности подавления процесса системного тромбообразования на данной экспериментальной модели исследованные соединения можно расположить следующим образом: Sbt-119 > клопидогрель > тиклопидин. Результаты гистологического исследования показали, что в лёгких контрольной группы животных отмечалось выраженное полнокровие и сладжирование эритроцитов в просветах артериол межальвеолярных перегородок. В просвете альвеол диапедезные кровоизлияния.        

 

 

В кровеносных сосудах среднего калибра определялись пристеночные смешанные тромбы. В более мелких кровеносных сосудах – облитурирующие эритроцитарные тромбы (рис. 4А). При гистологическом исследования микропрепаратов легочной ткани опытного вещества и клопидогреля  были обнаружены единичные пристеночные тромбы (рис. 4В, 4Г) признаки  нарушения внутриорганной гемодинамики,  а в микропрепаратах тиклопидина – множественные пристеночные и обтурирующие тромбы (эритроцитарные и смешанные), массивные кровоизлияния и деструктивные изменения стенки альвеол с микроинфарктами (рис. 4 Б).

При исследовании антитромботической и тромболитической активности вещества Sbt-119 и препаратов сравнения методом D.A. Goroga было установлено, что соединение Sbt-119 по антитромботическому эффекту превосходило препарат сравнения тиклопидин на 48,0% (р0,05) и  клопидогрель на 12,4% (р>0,05). По времени лизиса тромбинового сгустка достоверных отличий между группами, получавшими соединение Sbt-119, тиклопидин и клопидогрель не наблюдалось.                        

При изучении нейротоксических свойств соединения Sbt-119 после его однократного внутрибрюшинного введения было установлено что, опытное вещество во всех исследуемых дозах практически не влияло на эмоциональное поведение животных, нервно-мышечную возбудимость, не вызывало развитие таких побочных вегетативных эффектов таких как птоз и экзофтальм. Начиная с дозы 150 мг/кг, наблюдались обратимые единичные признаки нарушения двигательной координации  и поведенческих реакций. В максимально вводимых дозах соединения Sbt-119 (200 и 220 мг/кг) у животных регистрировались симптомы нейротоксического эффекта опытного вещества на дыхательный, терморегуляторный, болевой центры, а так же на нейродвигительную проводимость, что подтверждалось урежением дыхания, снижением ректальной температуры и болевой чувствительности, признаками угнетения мышечной координации и реактивности, а так же снижением рефлексов.                                

Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что изученные вещества, относящиеся к классу производных индола, а именно к N-[(1-R1-амино) карбонил-2-(1-R2-1H-индол-3-ил) винил]-R3-амидам и 1-R1-амино-3-(3-R2-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолам, проявляют P2Y1-антагонистическую активность различной степени выраженности. При этом, было установлено, что выраженность данного вида активности в ряду замещённых амидов производных индола определяется строением заместителей, а так же их сочетанием у атома углерода в положении 7, а у аминоспиртов ряда индола – радикалами в положении N9. Так наиболее высокую активность демонстрируют вещества, имеющие в положении С7 морфолинопропиловый и 4-метифенильный заместители. Наличие метил-(n-бутил)-аминового заместителя или полная его замена на гетероциклический азотосодержащий заместитель в положении приводит к увеличению P2Y1-антагонистической активности.                                        

На основании вышеизложенного выявлены три наиболее активных соединений Sbt-119, Sbt-815 и Sbt-820. Однако только вещество Sbt-119, обладающее более высоким P2Y1-антагонистическим эффектом, низкой токсичностью и по широте терапевтического действия превосходящее Sbt-815 и Sbt-820, отобрано для дальнейшего углубленного фармакологического исследования.                                                

При изучении влияния соединения Sbt-119 на сосудисто-тромбоцитарный и коагуляционный звеньев гемостаза установлено, что данное вещество проявляет антиагрегантную активность как in vitro, так и in vivo. При этом по ингибированию агрегации тромбоцитов in vitro соединение Sbt-119 активнее препарата сравнения тиклопидин в концентрации 0,1 мкМ в 1,03 раза. В условиях in vivo вещество Sbt-119 значимо превосходит только тиклопидин  (на 50,1%) по подавлению АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.

Вещество Sbt-119  по сравнению с препаратами сравнения (клопидогрелем и ацетилсалициловой кислотой) менее выраженно увеличивает время кровотечения в исследования влияния данных веществ на показатель длительности кровотечения из хвостовой вены мышей. Это позволяет предполагать о способности опытного вещества снижать риск кровотечений.

Соединение Sbt-119 снижает вязкость образцов  цельной и стандартизированной (гематокрит 45%) крови  в условиях in vitro и in vivo, превосходя препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель при средних и низких скоростях сдвига. При этом, на вязкость взвеси эритроцитов вещество Sbt-119 не влияет, что указывает о действии на плазменный компонент вязкости крови.

При исследованиях антитромботической активности в условиях целостного организма соединение Sbt-119 достоверно превосходит тиклопидин на моделях артериальных тромбозов, индуцированного хлоридом железа (в среднем на 16,7%) и электрическим током (1,5 – 2,5 раза), а так же и при моделировании тромбоза механическим методом («Global Thrombosis Test») (на 48,0%). Кроме того, соединение Sbt-119 в 1,2; 1,3 раза клопидогреля и тиклопидина соответственно уменьшает смертность мышей при системном АДФ-индуцированном тромбозе.                

Учитывая выраженную антиагрегантную и антитромботическую эффективность вещества Sbt-119 как в условиях in vitro, так и in vivo, можно считать перспективным дальнейшее изучение у данного соединения фармакологических и токсикологических свойств.

Выводы

  1. В результате проведенного скрининга 15 соединений  среди замещённых амидов и аминоспиртов ряда индола: N-[(1-R1 -амино) карбонил-2-(1-R2-1H-индол-3-ил) винил]-R3-амидов и 1-R1-амино-3-(3-R2-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолов было обнаружено 6 (40,0 %) веществ антагонистов P2Y1 рецепторов, из которых 1 соединение превосходило вещество сравнения, P2Y1-антагонист, Basilen blue  по степени выраженности  данного вида активности.
  2. P2Y1-блокирующая активность у замещённых амидов ряда индола определяется строением заместителей, а так же их сочетанием у атома углерода в положении 7. Наиболее высокую активность демонстрируют вещества, имеющие в положении С7 морфолинопропиловый с 4-метифенильным заместителем. У аминоспиртов ряда индола активность веществ определяется радикалами в положении N9. Наличие метил-(n-бутил)-аминового заместителя или полная его замена на гетероциклический азотосодержащий заместитель (N-азепин) приводит к увеличению данного вида биологического действия.
  3. Соединение Sbt-119 по влиянию на P2Y1-рецепторы тромбоцитов, превосходит в 3,0 раза по показателю IC20  вещество сравнения Basilen blue. Соединение Sbt-119 проявляет выраженную антиагрегантную активность. По ингибированию АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов соединение Sbt-119 превосходит препарат сравнения тиклопидин в 2,0 раза. Вещество Sbt-119 и препараты сравнения тиклопидин, клопидогрель в одинаковой степени подавляют адреналин- и коллаген-индуцированной  агрегацию тромбоцитов.
  4. Вещество Sbt-119 снижает вязкость крови в условиях in vivo, а так же при моделировании экспериментальной патологии in vitro, сопровождающейся развитием синдрома «повышенной вязкости крови и не влияет на показатели вязкости эритроцитов.
  5. На модели артериального тромбоза, индуцированного аппликацией хлоридом железа (III) сонной артерии крыс, активность соединения Sbt-119 превосходит препарат сравнения тиклопидин в 1,3 раза. На модели артериального тромбоза сонной артерии крыс, индуцированного электрическим током, соединение Sbt-119 по выраженности антитромботических свойств  в 2,5 раза эффективнее тиклопидина.
  6. Вещество Sbt-119 увеличивают выживаемость животных на модели генерализованного АДФ-индуцированного тромбоза, при этом его антитромботическая активность превышает таковую у тиклопидина и клопидогреля  1,3 и 1,2 раза  соответственно. При этом, результаты гистологического исследования микропрепаратов срезов легочной ткани показали, что соединение Sbt-119  резко снижает количество пристеночных тромбов с сохранением следовых признаков нарушения внутриорганной гемодинамики по сравнению с тиклопидином.
  7. Исследование общетоксикологических свойств соединения Sbt-119 показало, что, начиная с восемнадцатикратного увеличения терапевтической дозы, угнетаются мышечная координация и реактивность, снижаются рефлексы, ректальная температура и болевая чувствительность, урежается частота дыхания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Митина Т.М., Яковлев Д.С., Спасов. А.А., Суздалев. К.Ф. Антитромботическая и антиагрегантная активности нового P2Y1-антагониста соединения Sbt-119 ex и in vivo / Т.М. Митина, Д.С. Яковлев, А.А. Спасов, К.Ф. Суздалев. //  Вестник ВолгГМУ. 2011. № 4. С. 19 21.
  2. Анисимова В.А., Толпыгин И.Е., Спасов А.А., Яковлев Д.С., Митина Т.М. и др. Синтез и фармакологическая активность 10-алкиламиноэтил-2,3,4,10-тетрагидропиримидино[1,2,- a]бензоимидазолов / В.А. Анисимова, И.Е. Толпыгин, А.А. Спасов, Д.С. Яковлев, Т.М. Митина и др. // Химико-фармацевтический журнал. 2012. Т. 46. № 6.  С. 54 - 59.
  3. Анисимова В.А., Спасов А.А., Косолапов В.А., Толпыгин И.Е., Яковлев Д.С., Митина Т.М. и др. Синтез и фармакологи активность хлоридов 3 (N,N дизамещённых) ацетамидов 1 N 2 аминобензимидазолия  / В.А. Анисимова, И.Е. Толпыгин, А.А. Спасов, В.А. Косолапов, Д.С. Яковлев, Т.М. Митина и др. // Химико-фармацевтический журнал. 2012. Т. 46. № 8.  С. 52 - 58.
  4. Спасов А.А., Яковлев Д.С., Букатина Т.М. P2Y1-рецепторы и их влияние на процессы агрегации тромбоцитов / Спасов А.А., Яковлев Д.С., Букатина Т.М. //Регионарное кровообращение и микроцеркуляция. 2012. Т. 43. № 3.
  5. Митина Т.М., Стуковина А.Ю. Антиагрегантная  активность соединения 119  на модели артериального тромбоза, индуцированного хлоридом железа (III) / Т.М. Митина, А.Ю. Стуковина //  Материалы II Всероссийского научно-практического семинара для молодых учёных « Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии». Приложение Вестник ВолГМУ. Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова. – Волгоград: Изд-во ВолГМУ. 2010. С. 102-103.
  6. Митина Т.М., Стуковина А.Ю. Влияние новых  антиагрегантных соединений производных индола на длительность кровотечения / Т.М. Митина, А.Ю. Стуковина // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: Материалы 68-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием посвященной 75-летию ВолГМУ. Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова. – Волгоград: Изд-во ВолГМУ. – 2010. – С. 182 - 183.
  7. Митина Т.М., Стуковина А.Ю., Кучерявенко А.Ф., Суздалев К.Ф. Изучение влияния нового производного  индола на функциональную активность тромбоцитов / Т.М. Митина, А.Ю. Стуковина, Кучерявенко А.Ф., К.Ф. Суздалев // III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010»: Сборник материалов конгресса. – М. 2010. – Т. № 3. – С. 379 - 381.
  8. Митина Т.М., Яковлев Д.С. Изучение  P2Y1- антагонистических свойств новых производных индола / Т.М. Митина, Д.С. Яковлев // II международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». Сборник статей под редакцией Кудинова А.П., Крылова Б.В. – Санкт-Петербург: Из-во Политехнического университета. – 2011. – Т. 3. – С. 26 - 30.
  9. Митина Т.М., Яковлев Д.С. Влияние соединения 119 на агрегационную активность тромбоцитов ex vivo / Т.М. Митина, Д.С. Яковлев // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: Материалы 69-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова. – Волгоград: Изд-во ВолГМУ. –  2011.
  10. Митина Т.М., Яковлев Д.С., Суздалев К.Ф. Антитромботическая активность соединения 119 – антагониста P2Y1 рецепторов / Т.М. Митина, Д.С. Яковлев, К.Ф. Суздалев // XVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Сборник материалов конгресса. – М. – 2011. – С. 461 - 462.
  11. Митина Т.М., Яковлев Д.С., Анисимова В.А., Толпыгин В.А. Изучение P2Y1 – антагонистической активности новых хлорид-3-(N,N-дизамещённых) ацетамидов -1-R-2- аминобензимидазолия / Т.М. Митина, Д.С. Яковлев, В.А. Анисимова, В.А.  Толпыгин // Материалы II Всероссийского научно-практического семинара для молодых учёных « Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии». Приложение Вестник ВолГМУ. Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова. – Волгоград: Изд-во ВолГМУ. – 2011. – С. 14 - 15.
  12. Букатина Т. М., Яковлев Д. С., Спасов. А. А., Суздалев. К. Ф. Антитромботическая и тромболитическая активность соединения Sbt-119 на  модели in vitro (Gorog Trombosis Test) / Т. М. Букатина, Д. С. Яковлев, А. А. Спасов, К. Ф. Суздалев. // Волгоградский научно-медицинский журнал.  –2012.  – № 2. – С 12 -14.
  13. Митина Т.М., Яковлев Д.С., Суздалев. К.Ф. Антитромботическая активность соединения Sbt -119 на модели артериального тромбоза / Т.М.  Митина, Д.С. Яковлев, К.Ф. Суздалев. // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: Материалы 70-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова. – Волгоград: Изд-во ВолГМУ. – 2012. – С. 325- 326.

1Выражаем благодарность к.х.н., научному сотруднику К.Ф. Суздалеву за любезно предоставленные субстанции веществ.

2 Выражаем благодарность заведующему кафедрой патологической анатомии ВолгГМУ д.м.н., доценту А.В. Смирнову за содействие в проведении исследования.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.