WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

АНИСИМОВА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ

ПРИМЕНЕНИЯ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЙ ДЕТОКСИКАЦИИ

У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ С СЕПСИСОМ

14.01.12 онкология

14.03.09 клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва  2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Российской академии медицинских наук (директор – академик РАН и РАМН, профессор Давыдов Михаил Иванович)

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,  профессор

 

Михаил Валентинович Киселевский

доктор медицинских наук

Елена Георгиевна Громова

Официальные оппоненты:

Сельчук Владимир Юрьевич

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.Е. Евдокимова МЗ России, заведующий кафедрой онкологии

Хлгатян Светлана Вагинаковна

доктор биологических наук, ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, ведущий научный сотрудник лаборатории по разработке аллергенов

Байкова Валентина Николаевна

доктор биологических наук, профессор,  ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, заведующая  экспресс-лабораторией

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова МЗ России

Защита состоится «___» ______ 2013 г. в ___часов на заседании диссертационного совета Д001.017.02 ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (115478, г. Москва Каширское шоссе, 24).

Автореферат разослан «__»______2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор  Юрий Андреевич Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы

Несмотря на раннюю диагностику и адекватное применение антибиотиков, смертность от сепсиса остается чрезвычайно высокой и достигает по разным оценкам 50-80% от числа заболевших [Dellinger R.P., et al., 2008]. При этом вероятность неблагоприятного исхода при сепсисе у онкологических больных на 30% выше, чем у пациентов без онкологической патологии [Angus D.C., et al., 2001].

В настоящее время сепсис рассматривается не только как  результат прямого действия микроорганизмов на макроорганизм, но и как следствие существенных нарушений иммунной системы, проходящих в своем развитии путь от избыточной фазы гипервоспаления к состоянию иммунопаралича. Таким образом, организм является активным участником деструктивного, а точнее — аутодеструктивного процесса. Это обусловлено гиперпродукцией эндогенных факторов, которые инициируют и поддерживают системную воспалительную реакцию (СВР), развивающуюся в ответ на контакт с микроорганизмами или их компонентами, приводя к полиорганной недостаточности (ПОН). Опубликованные данные, характеризующие иммунологический статус онкологических больных,  свидетельствуют о повышении при сепсисе концентраций широкого спектра сывороточных цитокинов – IL-1, IL-6, IL-2, TNF, IL-8, IL-10 [Lin W., Karin M., et al., 2007, Barber M.D., et al., 1999]. Указанная гиперцитокинемия неизбежно приводит к нарушению функциональной активности клеток–эффекторов врожденного иммунитета (натуральные киллеры, нейтрофилы, макрофаги), в результате чего наблюдается либо ареактивность, либо неоправданная агрессивность эффекторов иммунитета [Mokart D.,et al., 2005]. В этой связи, есть основания полагать, что ранняя идентификация маркеров нарастания СВР может уменьшить риск развития послеоперационных осложнений и обусловленной ими смертности.

В последние годы накопились данные, свидетельствующие о целесообразности включения методов экстракорпоральной детоксикации (ЭКД) в комплексное лечение сепсиса. В частности, имеется  большое количество сообщений о благоприятном влиянии на состояние больных с сепсисом гемосорбции [Ala-Kokko T.,et al. 2010, Tetta C., et al. 2003, Mikhalovsky  S.V., 2003]. Эта процедура не только способствует улучшению реологических свойств крови, но и значительно снижает концентрацию факторов воспаления (эндотоксина, цитокинов) в системном кровотоке [Peng Z.Y.,et al., 2008, Ronco C., et al., 2000]. Кроме того, имеются отдельные данные о том, что некоторые сорбенты способны прочно иммобилизировать на своей поверхности бактериальные клетки [Choi J.-W.,et al., 2007]. Современные достижения в области разработки новых и модификации предложенных ранее сорбентов привели к тому, что гемосорбция (ГС) на сегодняшний день имеет ряд преимуществ перед другими неселективными методами ЭКД (плазмаферез, плазмофильтрация) при лечении сепсиса [Mikhalovsky S.V., 2003]. Выпускаемые в настоящее время колонки для ГС (Adsorba, Gambro;  Hemosorba, Asahi Medical) в основном содержат модифицированный гранулированный активированный уголь (ГАУ) – неселективный сорбент, характеризующийся большой сорбционной емкостью [Yusufu M.I., et al., 2012]. Однако, несмотря на доказанную способность элиминации угольными сорбентами широкого спектра токсинов, целесообразность их применения при сепсисе до настоящего времени  остается дискуссионной.

Все вышеизложенное указывает на необходимость поиска новых сорбентов, эффективных при лечении больных с сепсисом за счет удаления из системного кровотока пациента наряду с бактериальными экзо- и эндотоксинами избытка медиаторов воспаления. Представляется, что одним из перспективных направлений работ по данной проблематике является использование в качестве основы устройств для ЭКД сверхсшитых полистиролов ряда Стиросорб и ферримагнитных сорбентов, которые способны элиминировать из физиологических жидкостей различные биологически активные молекулы [Bhaumika M., et al., 2011, Saha B., et al., 2010, Kellum J.A., et al., 2004].

Цель исследования: экспериментально обосновать целесообразность применения методов экстракорпоральной детоксикации при лечении онкологических больных с сепсисом и провести сравнительную характеристику  перспективных гемосорбентов.

Задачи исследования.

  1. Исследовать гуморальный и клеточный иммунитет онкологических больных с синдромом системной воспалительной реакции (ССВР) для выявления диагностических и прогностических маркеров сепсиса.
  2. Оценить роль бактериального липополисахарида в инициации каскада системной воспалительной реакции и полиорганной недостаточности.
  3. Изучить влияние экстракорпоральной детоксикации на иммунологические параметры и сывороточный уровень бактериального эндотоксина у онкологических больных с сепсисом.
  4. Провести оценку физических свойств, гемосовместимости, сорбционных свойств образцов новых сорбентов на основе оксида железа и сверхсшитого полистирола ряда Стиросорб в сравнении с коммерческими сорбентами на основе активированного угля.
  5. Создать макет экспериментальной колонки для терапии больных с сепсисом на основе сорбента, признанного наиболее перспективным по результатам сравнительных исследований различных образцов.
  6. Оценить перспективность использования нового экспериментального сорбционного устройства для экстракорпоральной детоксикации онкологических больных с органной недостаточностью на фоне сепсиса.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование динамики уровня в крови бактериального липополисахарида (LPS), широкого спектра цитокинов и их рецепторов, функциональной активности лейкоцитов (NK-активности, фагоцитоза), а также основных клинических (температура тела, объем вазопрессорной поддержки, артериальное давление) и лабораторных (газовый состав, концентрация лактата, прокальцитонина, лейкоцитов в венозной крови) параметров на фоне селективной и неселективной гемосорбции онкологическим больным с сепсисом.

Впервые проведено изучение гемосовместимости различных образцов полистирольных (Стиросорб 414, Стиросорб 514, Стиросорб 516) и ферримагнитных (Fe2O3, магнетит немодифицированный и с модификацией поверхности углеродом или серебром) сорбентов.

Впервые оценена интенсивность элиминации бактериального LPS и широкого спектра рекомбинантных цитокинов человека сорбентами ряда Стиросорб (Стиросорб 414, Стиросорб 514, Стиросорб 516) из 0,9% раствора хлорида натрия.

Получены новые данные о торможении колониеобразования различных микроорганизмов после контакта с полистирольными и ферримагнитными сорбентами.

Впервые был проведен сравнительный анализ эффективности удаления из крови бактериального LPS, широкого спектра цитокинов, дрожжевых грибов, а также стимуляции гемолиза и  агрегации тромбоцитов в результате перфузии через макеты колонок с сорбентами Стиросорб 514, MMN200 и ГАУ.

Впервые проведены испытания, подтвердившие высокую эффективность применения устройства на основе Стиросорб 514 для экстракорпоральной детоксикации собак с онкологической патологией, осложненной органной недостаточностью на фоне сепсиса.

Научно-практическая значимость

Результаты исследования позволяют расширить представления об иммунопатогенезе сепсиса у онкологических больных.

Установлено, что в качестве диагностических маркеров тяжелого сепсиса и септического шока у онкологических больных могут использоваться IL-6, IL-10 и IL-18, а IL-8, IL-10 и sR IL-1 II для прогноза состояния больных по показателю 28-дневной летальности. Показано, что нарастание экспрессии CD11b на мембранах лейкоцитов наряду с понижением экспрессии CD95 на фоне лейкоцитоза и снижения значения соотношения CD4/CD8 являются прогностическими факторами развития сепсиса у онкологических больных.

Проведенное исследование позволило оптимизировать методы экстракорпоральной детоксикации онкологических больных с  послеоперационными осложнениями и обосновать рациональность применения гемосорбции в комплексной терапии сепсиса.

Разработан и апробирован на собаках с системной воспалительной реакцией и ПОН макет гемосорбционной колонки на основе сорбента Стиросорб.

Полученные результаты могут служить основанием для внедрения в практику здравоохранения применения новых эффективных сорбентов ряда Стиросорб и устройств для экстракорпоральной детоксикации на их основе.

Основные положения, выносимые на защиту:

  • для уточнения диагноза и прогноза развития септических осложнений у онкологических больных в послеоперационном периоде целесообразна оценка иммунологических параметров крови и сывороточного уровня бактериального липополисахарида;
  • применение экстракорпоральной детоксикации, направленной на удаление из циркулирующей крови бактериальных липополисахаридов, при эндотоксемии является патогенетически оправданной составляющей комплексной терапии онкологических больных с сепсисом для предупреждения развития полиорганной недостаточностью;
  • дополнение  комплексной терапии онкологических больных с сепсисом курсом процедур гемосорбции с использованием LPS-адсорбера (Alteco, Sweden) и углеродных картриджей (Adsorba, Sweden) способствует  нормализации иммунологических параметров крови, снижению уровня эндотоксемии, и тяжести состояния пациентов;
  • создан макет устройства для экстракорпоральной детоксикации на основе бипористого сорбента Стиросорб 514 из сверхсшитого стирола; 
  • устройство для гемосорбции на основе Стиросорб 514 в сравнении с углеродным картриджем обладает лучшей гемосовместимостью и способствует более эффективной элиминации из циркулирующей крови микроорганизмов и их токсинов, избытка цитокинов, билирубина, мочевины и креатинина.

Апробация работы

Положения диссертации были доложены на Международных конференциях Sepsis 2009 11-14 ноября 2009 года, Амстердам, Нидерланды; Sepsis 2010 1-3 сентября 2010 года, Париж, Франция; MASCC/ISOO 2010 International Symposium «Supportive Care in Cancer» 24-26 июня 2010 года,  Ванкувер, Канада; MASCC/ISOO 2011 International Symposium «Supportive Care in Cancer» 23-25 июня 2011 года, Афины, Греция; MASCC/ISOO 2012 International Symposium «Supportive Care in Cancer» 28-30 июня 2012 года, Нью-Йорк, США; VII Международной конференции «Актуальные аспекты экстракорпорального очищения крови в интенсивной терапии» 27-28 мая 2010 года, Москва, Россия; II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» 26-28 сентября 2010 года, Тюмень; III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» 6-7 октября 2011 года, Саратов; X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» 22-23 марта 2011 года, Москва; XI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты (экспериментальная онкология)» 31 мая - 1 июня 2012 года, Нижний Новгород.

Апробация работы состоялась 8 июня 2012 года на совместной конференции с участием лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории комбинированной терапии опухолей, лаборатории фармакологии и токсикологии НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, отделения реанимации и интенсивной терапии № 2, торакального отделения и отделения экспериментальной терапии НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ, в том числе 32 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ; 7 патентов, 5 глав в  монографиях и 12 тезисов докладов.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики больных, описания материалов и методов, 7 глав собственных результатов, обсуждения, выводов, списка сокращений, списка литературы, включающего 42 отечественных и 198 зарубежных источника. Материалы диссертации изложены на 322 страницах машинописного текста и иллюстрированы 30 таблицами и 63 рисунками.

Характеристика больных

В проспективное исследование были включены 123 онкологических больных (73 женщины, 50 мужчин; средний возраст 54±16,4 г.), лечение которых было проведено в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Локализация новообразований: желудочно-кишечный тракт (n=67), дыхательная система (n=19), мочевыделительная система (n=14), репродуктивная система (n=10), система крови (n=8), иная локализация (n=5). Расширенные хирургические вмешательства с лимфодиссекцией были выполнены 101 пациенту. Течение основного заболевания было осложнено у 83% пациентов. В исследование было включено 78 онкологических больных с диагнозом сепсис (n=28) и септический шок (n=50), диагностированных согласно определению согласительной конференции Общества критической медицины США и Американской ассоциации торакальных хирургов (повышение температуры тела, лекоцитоз и кардиореспираторные расстройства, наличие очага инфекции (поддиафрагмальный абсцесс, перитонит, пневмония) и повышения уровня прокальцитонина [Bone R.C., et. al., 1992]); с изолированной острой почечной недостаточностью (n=13); изолированной острой печеночной недостаточностью (n=6), острой почечной недостаточностью на фоне хронической почечной недостаточности (n=5), а также 23 онкологических больных без признаков развития инфекционных осложнений или органной недостаточности. Контрольную группу составили 29 здоровых доноров (11 женщин, 8 мужчин; средний возраст 41±11,5г.). В настоящее исследование были включены 97 больных, при лечении которых были применены методы ЭКД на базе отделения реанимации и интенсивной терапии №2  ФГБУ «РОНЦ имени Н.Н. Блохина» РАМН. Каждому больному проводили от 1 до 4 процедур ЭКД. Всего в процессе настоящего исследования было исследовано изменение параметров 47 пациентов в течение 67 процедур гемосорбции (ГС), 11 пациентов –15 процедур гемодиализа (ГД), 25 пациентов –32 процедур гемодиафильтрации (ГДФ), 17 пациентов –17 процедур гемофильтрации (ГФ). Образцы крови больных с септическими осложнениями были собраны в ранний период манифестации клинических признаков развития осложнений (в течение 1-2 суток). Забор крови у пациентов без осложнений проводили на 7-10 сутки после операции.  От всех пациентов и доноров было получено информированное согласие на исследование.

Протестированные сорбенты

Экспериментальные образцы: ферримагнитные сорбенты Fe2О3, магнетит  немодифицированный и с модификацией поверхности углеродом или серебром, размер частиц 20-200 нм (ИПРИМ РАН); бипористые сорбенты на основе сверхсшитого стирола серии Стиросорб Стиросорб 516, Стиросорб 514, Стиросорб 414, MМN200 (ИНЭОС им. А.Н. Несмеянова РАН). Контрольные образцы: ГАУ, являющийся основой гемосорбционной колонки Adsorba 300C (Gambro Co., Sweden) и ВНИИТУ-1 – с содержанием углерода не менее 99,5% (ИППУ СО РАН, г. Омск, РФ).

Методы исследований

Концентрацию цитокинов, рецепторов к цитокинам, иммуноглобулинов определяли  с помощью коммерческих тест-систем (11-plex фирмы MedBenderSystem, USA; «Вектор Бест», РФ) на основе сэндвич-ИФА (ELISA) в соответствии с инструкциями производителей. Уровень спонтанной и стимулированной продукции цитокинов клетками крови оценивали с использованием наборов реагентов «Цитокин-Стимул-Бест» («Вектор Бест», РФ). Иммунофенотип лейкоцитов изучали  методом проточной цитометрии на цитофлюориметре BD Canto II (Becton Dickinson, USA) с использованием меченных флуорохромами  антител к CD19, CD45, CD3, СD16, CD4, CD8, CD11a, CD11b, CD11c, Foxp3, CD25 (Becton Dickinson, USA).В каждом образце анализировалось не менее 10000 клеток.

Активность натуральных киллеров (NK-активность) изучали в МТТ-колориметрическом тесте с последущим вычислением индекса цитотоксической активности (ИЦА). Соотношение клеток-мишеней (КМ) и клеток-эффекторов (КЭ) соответствовало 1/2; 1/5 и 1/10. Фагоцитарную активность нейтрофилов изучали, подсчитывая фагоцитарное число (ФЧ) и фагоцитарный индекс (ФИ) после стимуляции клеток гранулами латекса, суспензиями S.cerivisiae и L. acidophilus. Для изучения кислородзависимого метаболизма нейтрофилов in vitro использовали реакцию восстановления клетками нитросинего тетразолия (НСТ-тест), результат учитывали в условных единицах (у.е.). НСТ-тест проводили как при стимуляции нейтрофилов латексом (индуцированный НСТ-тест), так и без нее (спонтанный НСТ-тест). Уровень бактериального липополисахарида (LPS) определяли с использованием коммерческих наборов на основе LAL теста теста на основе лизата амебоцитов мечехвостов вида Limulus polyphemus (Hbt, The Netherlands; HyClon, USA). Концентрацию LPS-связывающего белка (LBP) и sCD14 определяли с использованием коммерческих наборов (Hbt, The Netherlands).Торможение колониеобразования (ТКО) микро-организмов определяли после подсчета количества колоний, выросших на плотной питательной среде после высева интактной пробы и перфузата суспензии K. pneum. pneumoniae, E.coli, S.epidermidis, С. famata, B. subtilus, S. aureus, L. acidophilus. Удельную площадь поверхности гранул сорбентов измеряли методом низкотемпературной адсорбции азота (BET) на установке Quantachrome NOVA 1200e. Исследование поверхности и сколов гранул сорбентов проводили с использованием световой микроскопии на приборе Zeiss AxioPlan 2 (Zeiss, Germany) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на устройстве Hitachi TM (Hitachi, Japan). Характеристика микропор сорбентов была рассчитана c использованием теории функционала плотности (DFT). Гемосовместимость образцов сорбентов исследовали, оценивая индуцированный ими уровень гемолиза, цитотоксичности и агрегации тромбоцитов. Изменение микроморфологии внутренних органов онкологических больных с сепсисом и мышей изучали гистологическими методами путем микроскопии срезов образцов сердца, легких, печени, почек, селезенки, толстого и тонкого кишечника, окрашенных гематоксилин-эозином. Эффективность применения устройства для ГС на основе Стиросорб 514 изучали на моделях эндотоксинового шока 6 кроликов, которым под наркозом (5% р-ра хлоралгидрата, 0,4 г/кг) парентерально вводили растворы LPS K. pneum. pneumoniae (5 мг/кг) и  рекомбинантного цитокина человека (hTNF, 1000 МЕ/кг), а также сепсиса, развившегося в послеоперационном периоде у 10 собак с онкологической патологией различной локализации. Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 6.0. Межгрупповое множественное сравнение показателей осуществляли, рассчитывая значение критерия Крускалла-Уоллиса, попарное сравнение между независимыми группами – при помощи U критерия Манна-Уитни, зависимых групп – критерия Вилкоксона, с интактным контролем критерия Данна. Различия между группами считались статистически значимыми при р<0,05. Корреляционный анализ проводили, рассчитывая величину критерия Спирмена. Считали корреляцию достоверной при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

КЛИНИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Мониторинг сывороточного уровня бактериального LPS и иммунологических параметров крови у онкологических больных с ССВР в послеоперационном периоде

Изучение цитокинового профиля

Изучение гуморального иммунитета онкологических больных, поступивших в отделение реанимации и интенсивной терапии с диагнозом сепсис (n=21) и септический шок (n=42), развившихся в раннем послеоперационном периоде, а также онкологических больных без инфекционных осложнений (n=32) и контрольной группы здоровых доноров (n=29), показало, что исследование с диагностическими целями цитокинового профиля сыворотки больных, в целом, малоэффективно поскольку наблюдается значительный разброс индивидуальных данных (табл.1).

Статистический анализ позволил констатировать, что из 13 исследованных цитокинов в сыворотке крови онкологических больных при септических осложнениях было достоверно установлено увеличение концентрации только IL-6, IL-18 и IL-10. Однако, следует отметить, что у отдельных больных концентрация IL-8, TNF и TNF достигала весьма высоких значений: 316 пг/мл, 548 пг/мл и 8900 пг/мл при сепсисе; 1243 пг/мл, 548 пг/мл и 1100 пг/мл при септическом шоке. При этом у здоровых доноров диапазон колебаний показателей этих провоспалительных цитокинов был незначительным.

Таблица 1. Сравнительный анализ концентрации цитокинов в сыворотке крови онкологических больных с тяжелым сепсисом и септическим шоком,  пациентов без инфекционных осложнений и здоровых доноров, Мед (25%-75%), пг/мл

Цитокины

Группы

р

Сепсис

Септический шок

Без осложнений

Здоровые доноры

IL-1

0

(0-1)

6

(0-42)

1

(0-5)

16

(0-35)

0. 116

IL-2

43

(37-55)

40

(34-45)

15

(7-42)

16

(5-88)

0,058

IL-4

7

(3-8)

5

(3-13)

17

(15-20)

18

(15-19)

0,11

IL-5

49

(18-88)

69

(22-83)

14

(10-17)

14

(12-19)

0,058





IL-6

399 1,2

(107-747)

149 1,2

(60-505)

20

(2-48)

12

(5-20)

0,0001

IL-8

14

(6-57)

22

(7-288)

13

(9-16)

48

(17-140)

0,289

IL-10

48 1,2

(34-128)

59 1,2

(37-235)

13

(2-40)

28

(12-33)

0,0001

IL-12

69

(67-95)

56

(46-59)

16

(7-25)

15

(4-28)

0,105

IL-17

65

(0-94)

31

(0-77)

4

(1-9)

30

(15-44)

0,329

IL-18

1296 1,2

(633-2067)

542 1,2

(351-1003)

191

(187-200)

163

(123-202)

0,0008

INF

0

(0-13)

0

(0-19)

5

(1-13)

5

(2-11)

0,665

TNF

5

(0-24)

2

(0-19)

0

(0-1)

14

(8-24)

0,057

TNF

0

(0-70)

40

(0-150)

11

(3-21)

17

(15-21)

0,643

1 р<0,05 при сравнении со здоровыми донорами

2 р<0,05 при сравнении с пациентами без осложнений

Для исследования взаимосвязи между сывороточной концентрацией цитокинов и летальностью при сепсисе мы проанализировали уровень этих медиаторов в крови выживших пациентов и больных, умерших в течение 28 суток после забора пробы крови для исследований. Проведенный анализ показал, что  концентрации IL-8, IL-10 в крови больных с неблагоприятным исходом были достоверно выше, чем у выживших пациентов. Содержание в крови  IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IL-17, IL-18, INF, TNF, TNF в группах пациентов с различным клиническим исходом значимо не отличалось (рис.1). Следует отметить, что хотя проведенный анализ не выявил достоверных изменений содержания TNF и TNF в сыворотке больных в зависимости от исхода заболевания, почти у 25% пациентов в предтерминальном периоде отмечалось высокое содержание этих медиаторов (более 500 пг/мл).

Рисунок 1. Сравнительный анализ уровня цитокинов по результатам 28-дневной выживаемости в группах онкологических больных с сепсисом и септическим шоком

Анализ концентраций растворимых рецепторов к цитокинам

Учитывая то, что уровень свободных форм цитокинов может являться следствием не только реактивности клеточных эффекторов иммунитета больных, но и результатом их специфического связывания, представлялось целесообразным изучение концентрации в сыворотке крови растворимых рецепторов к цитокинам. В крови онкологических больных при сепсисе отмечали достоверное  повышение (в 5-6 раз в сравнении со здоровыми донорами) сывороточного уровня только sR TNF I (р55), тогда как статистическую значимость sR IL-1 II и sR IL-6  как маркеров сепсиса подтвердить не удалось (табл.2). При этом значимого различия уровня рассматриваемых рецепторов в сыворотке крови у онкологических больных без признаков инфекционных осложнений и контрольной группы зафиксировано не было.

Таблица 2. Сравнительный анализ сывороточного уровня рецепторов к цитокинам у онкологических больных с тяжелым сепсисом и септическим шоком,  пациентов без инфекционных осложнений и здоровых доноров, Мед (25%-75%), пг/мл

Аналиты

Группы

р

Сепсис

Септический шок

Без осложнений

Здоровые доноры

sR TNF I

78 1,2

(53-248)

60 1

(50-96)

15

(11-30)

12

(10-19)

0,0001

sR IL-1 II

3853

(2407-5505)

382

(267-3337)

2003

(354-2564)

2564

(2387-2789)

0,195

sR IL-6

52300

(4752-54100)

49900

(37320-53560)

10784

(2386-22415)

44322

(10897-46998)

0,074

1 р<0,05 при сравнении со здоровыми донорами

2 р<0,05 при сравнении с пациентами без осложнений

sR IL-1 II  Уровень  sR IL-1 II  был достоверно более высоким в крови больных с неблагоприятным исходом по сравнению с показателями выживших пациентов и здоровых доноров (рис.2).

Рисунок 2. Концентрация растворимых рецепторов к цитокинам в сыворотке крови онкологических больных с сепсисом в зависимости от 28-дневной выживаемости в сравнении со здоровыми донорами

Проведенный корреляционный анализ содержания цитокинов и их рецепторов в крови больных с сепсисом и септическим шоком выявил наличие тесной взаимосвязи (р<0,05) содержания в крови больных TNF и всех проанализированных рецепторов: значения коэффициента Спирмена  соответствовали 0,901 (sR IL-1 II), 0,745 (sR TNF I), 0,609 (sR IL-6). Кроме того, была обнаружена тесная корреляция показателей sR TNF I с TNF (0,541) и с IL-6 (0.591); sR IL-1 II с IL-4 (0.443); sR IL-6 с IL-4 (0.514). Это, вероятно, свидетельствует о наличии в кровотоке связанных лиганд-рецепторных форм цитокинов, что может рассматриваться  как проявление скрытой гиперцитокинемии у онкологических больных с сепсисом.

Таким образом, согласно результатам сравнительного изучения концентрации в сыворотке крови онкологических больных растворимых рецепторов к IL-1, IL-6 и TNFI, при сепсисе диагностическую ценность представляет увеличение концентрации sR TNF I, а прогностическую  sR IL-1 II.

Исследование уровня LPS, LBP и sCD14

Поскольку LPS играет важную роль в патогенезе сепсиса и инициации каскада иммунологических реакций, формирующих СВР, а LBP и sCD14, выполняют для LPS функции транспортной системы, это позволяло рассматривать эти молекулы как потенциальные маркеры развития септических осложнений.

Таблица 3. Сравнительный анализ сывороточного уровня LPS, LBP и sCD14 у онкологических больных с тяжелым сепсисом и септическим шоком,  пациентов без инфекционных осложнений и здоровых доноров, Мед (25%-75%)

Аналиты

Сепсис

Септический шок

Без осложнений

Здоровые доноры

р

LPS, МЕ/мл

1.5 1,2

(0,48-5,5)

1.95 1,2

(0,60-3,0)

0.005

(0-0,03)

0

(0-0,001)

0,0001

LBP,  мкг/мл

9

(6,1-11,9)

10.0

(6,8-12,0)

7.0

(5,0-9,0)

8,9

(7,3-10,5)

0,166

s CD14, мкг/мл

9,9 1,2

(8,4-11,8)

12,7 1,2

(7,1-13,0)

2,8

(2,1-4,6)

3,4

(1,7-3,7)

0,0004

1 р<0,05 при сравнении со здоровыми донорами

2 р<0,05 при сравнении с пациентами без осложнений

В ходе проведенного исследования было установлено, что у пациентов с сепсисом и септическим шоком уровень бактериального эндотоксина в сыворотке крови был значительно повышен: при сепсисе 1,5 (0,48-5,5)  МЕ/мл, септическом шоке 1,95 (0,6-3,0) МЕ/мл в сравнении с пациентами без послеоперационных осложнений – 0,005 (0-0,03) МЕ/мл и здоровыми донорами – 0 (0-0,001) МЕ/мл (табл. 3). Этот аналит детектировался в крови 73% пациентов с развившимися в послеоперационном периоде септическими осложнениями. Весьма вероятно, что его источником являлись не только патогенные микроорганизмы из первичного очага, но и микрофлора слизистых оболочек естественных биоценозов организма (в первую очередь кишечника), попавшая в кровь вследствие снижения барьерной функции, чему могли способствовать операционный стресс и антибиотикотерапия.

Анализ совокупности первичных данных не позволил выявить достоверных отличий между изучаемыми группами по содержанию в крови LBP (p=0.666). Однако необходимо отметить значительные индивидуальные колебания этого параметра при сепсисе и септическом шоке (1-19,7 мкг/мл и 0,7-21,8 мкг/мл, соответственно). При этом, более чем у 25% пациентов этих групп  LBP превышал максимальные значения, зафиксированные в группах здоровых доноров и пациентов без осложнений (12 мкг/мл). Сравнительный анализ сывороточной концентрации sCD14 выявил значительные различия по этому показателю между больными с септическими осложнениями и донорами: концентрация этого аналита при сепсисе была в 2,9 раз, а при септическом шоке – в 3,7 раза выше, чем у здоровых доноров.

Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что в крови пациентов с сепсисом и септическим шоком концентрация LPS и sCD14 значительно превышает соответствующие показатели здоровых доноров, тогда как достоверных различий по исследуемым параметрам между пациентами с сепсисом и септическим шоком, а также между пациентами без септических осложнений и здоровыми донорами выявлено не было.

При сравнительном анализе содержания сывороточных LPS и LBP в группах выживших и умерших в последствии больных с сепсисом установлено, что в крови пациентов с неблагоприятным прогнозом отмечались более высокие уровни LPS, свидетельствуя, очевидно, о нарастании дефектности барьерной функции слизистой и, соответственно, потенциальном усилении транслокации условно-патогенной микрофлоры во внутреннюю среду организма. На этом фоне у данной группы больных отмечали значительное  снижение сывороточной концентрации LBP. В результате была показана тесная взаимосвязь понижения в сыворотке крови уровня LBP с  неблагоприятным исходом у онкологических больных с сепсисом, что сопровождалось снижением соотношения LBP/LPS примерно в 10 раз по сравнению с выжившими пациентами.

Вышеизложенное позволяет заключить, что нарастание концентрации LPS и sCD14 в крови онкологических больных с сепсисом на фоне одновременного понижения уровня LBP, следует рассматривать как прогностически неблагоприятные признаки.

Исследование уровня иммуноглобулинов

Сравнительное изучение сывороточных концентраций иммуноглобулинов A, M, G было проведено у онкологических больных после радикальных операций. У 46 пациентов на фоне послеоперационных осложнений был диагностирован сепсис (n=28) и септический шок (n=18). У остальных пациентов не наблюдалось признаков развития инфекционных осложнений (n=23). В качестве контроля использовали кровь 16 здоровых доноров (табл.4).

Таблица 4. Сравнительный анализ сывороточного уровня иммуноглобулинов у онкологических больных с тяжелым сепсисом и септическим шоком,  пациентов без инфекционных осложнений и здоровых доноров,Мед (25%-75%)

Аналиты

Группы

р

Сепсис

Септический шок

Без осложнений

Здоровые доноры

Ig A, мкг/мл

1,74

(0,85-2,36)

1,78

(0,83-2,41)

1,65

(1,10-2,20)

2,30

(1,30-2,45)

0,638

Ig M, мкг/мл

0,75

(0,34-1,77)

0,75

(0,41-1,89)

1,55

(1,05-1,90)

2,22

(1,42-2,32)

0,05

Ig G, мкг/мл

10,05

(6,57-15,91)

13,20

(8,11-15,78)

10,00

(9,50-10,20)

11,37

(10,62-11,66)

0,465

1 р<0,05 при сравнении со здоровыми донорами

2 р<0,05 при сравнении с пациентами без осложнений

Проведенный статистический анализ не выявил однозначной ценности изучения IgА и IgG в качестве диагностических или прогностических маркеров развития септических осложнений у онкологических больных. Однако у пациентов с сепсисом наблюдали тенденцию снижения в сыворотке крови уровня Ig M, хотя статистическое подтверждение этого факта сомнительно (р=0,05). При этом следует отметить, что диапазон колебаний данного показателя в сыворотке крови пациентов с септическими осложнениями был весьма значительным (0-3,7 мг/мл) и перекрывал диапазон значений здоровых доноров (0,97-2,5 мг/мл). Более чем у 50% больных сепсисом и септическим шоком содержание в сыворотке крови IgM было ниже минимального значения контрольной группы (0,97 мг/мл).

Исследование функциональной активности лейкоцитов

Были исследованы образцы крови 26 больных раком желудка (n=20) и легкого (n=6) в II-III стадии, подвергнутых радикальному хирургическому вмешательству в объеме гастроэктомии или пневмонэктомии с лимфодиссекцией. У 16 пациентов на фоне послеоперационных осложнений был диагностирован сепсис. В качестве референтного контроля исследовали кровь 15 здоровых доноров.

Изучение цитокининдуцирующей активности лейкоцитов.

Полученные в ходе проведенных исследований данные показывают, что уровень спонтанной продукции клетками крови больных с сепсисом большинства проанализированных цитокинов (ИНФ, TNF, IL-6, IL-4, IL-1, IL-10, IL-17)  достоверно не отличался от значений контрольной группы, и только спонтанная  продукция IL-8 у больных с сепсисом была в 3,5 раза выше соответствующего показателя здоровых доноров (305 (243-1530) пг/мл и 88 (16-187) пг/мл, соответственно, р=0,044). В то же время индуцированная реактивность клеток крови больных с сепсисом была снижена в сравнении с контролем (IL-8 в 2,3 раза, р=0,047;  ИНФ в 60 раз, р=0,032; TNF в 4,6 раза, р=0,003), при этом уровень спонтанной и индуцированной продукции основных цитокинов достоверно не отличался, тогда как у здоровых доноров стимуляция клеток митогенами приводила к значимому росту их продукции.

Особенности фенотипа лейкоцитов при сепсисе

Исследование включало анализ концентрации, подсчет лейкоцитарной формулы, исследование фенотипа лейкоцитов крови онкологических больных с сепсисом (n=16), развившимся в ранний послеоперационный период, а также группы здоровых доноров (n=10). Представленные данные свидетельствуют, что у больных с септическими осложнениями наблюдали значительный лейкоцитоз на фоне увеличения концентрации нейтрофилов, сопровождаемый сдвигом лейкоцитарной формулы влево. Параллельно наблюдалось относительное снижение количества лимфоцитов в крови, однако абсолютное количество этих клеток оставалось в пределах физиологической нормы  1,5(1,3-3)109 кл/мл

Полученные в результате изучения фенотипа лейкоцитов крови онкологических больных данные подтверждают, что при сепсисе наблюдается достоверное увеличение в сравнении со здоровыми донорами относительного и абсолютного количества CD45+CD66b+клеток – 76 (69-89) % и 57 (51-64) %, 9,8-12109 кл/мл и 4,2-6,1109 кл/мл, соответственно, р<0.05.

А)

Б)

Рисунок  3. Экспрессия CD11b на лейкоцитах крови онкологических больных с сепсисом (А) в сравнении со здоровыми донорами (Б). Ось абсцисс – интенсивность флюоресценции. Ось ординат – количество событий.

При этом, на поверхности мембран лейкоцитов наблюдали тенденцию нарастания экспрессии молекул адгезии (в 3,5-6,4 раз), в особенности, CD11b: содержание CD45+CD11b+ популяции лейкоцитов у больных с сепсисом соответствовало 89 (84-97)%, а у доноров 75 (69-79)% , p=0.034 (рис.3). Также у пациентов с сепсисом наблюдали снижение экспрессии на лейкоцитах  молекул СD95 (41(34-55)% у больных и 55(51-61)% у доноров, р=0,044) на фоне значительного повышения абсолютного количества CD45+CD95+ клеток (6,6-12,1109 кл/мл у больных и 2,5-4,2109 кл/мл у доноров, р=0,001), что, вероятно, отражает факт присутствия в кровотоке большого количества гиперактивированных клеток, способных за счет массового экзоцитоза целого спектра биологически активных веществ существенно повреждать клетки тканей и, в первую очередь, эндотелий сосудов, приводя к расстройству микроциркуляции крови. При этом указанная тенденция была выражена ярче всего при сравнении относительного количества в крови субпопуляции CD45+CD14+CD95+моноцитов: у больных с сепсисом 24 (19-23)%, у доноров 34 (5-75)%,  р=0,032 (рис.4).

А)

Б)

Рисунок 4. Экспрессия CD95 на лейкоцитах крови онкологических больных с сепсисом (А) в сравнении со здоровыми донорами (Б). Черной  линией показан изотипический контроль. Ось абсцисс – интенсивность флюоресценции. Ось ординат – количество событий.

Еще одним значимым диагностическим показателем развития сепсиса, как было установлено в результате проведенных исследований, является увеличение как относительного, так и абсолютного количества натуральных киллеров в популяции лейкоцитов: количество СD45+CD3-CD16+CD56+ клеток у больных соответствовало 28(16-33)% или 0,6-0,8109 кл/мл; у доноров – 10 (7-11)% или 0,21-0,33109 кл/мл, соответственно (р<0,05). Кроме того, при анализе субпопуляционного состава лимфоцитов было показано, что на фоне прослеживаемой тенденции к снижению их относительного количества (для Т-хелперов это было доказано статистически достоверно, р=0,027), абсолютное содержание этих клеток в кровотоке соответствовало или превышало таковое у здоровых доноров. При этом индекс CD4/CD8 при сепсисе был значительно ниже, чем у здоровых доноров: при сепсисе у онкологических больных его значения колебались  от 0,03 до 0,06, а у здоровых доноров от 1,1 до 2,2. 

Исследование NK активности МЛ крови

В результате проведенных исследований NК-активности лейкоцитов здоровых доноров и пациентов со злокачественными новообразованиями без осложнений статистически значимых различий выявить не удалось (р>0,05). Показатели ИЦА МЛ в обеих группах соответствовали 57 (41-77)% и 58 (38-59)%, р=0,902 (соотношение КМ/КЭ 1/10); 36 (27-44)% и 32 (18-43)%, р=0,862 (соотношение КМ/КЭ - 1/5); 17 (7-20)% и 20 (5-37)%, р=0,890 (соотношение КМ/КЭ - 1/2).

У больных с сепсисом было отмечено достоверное повышение NК- активности МЛ: на 20-30% в сравнении с контролем. Значения ИЦА в этой группе соответствовали 67 (48-82) % при соотношении КМ/КЭ 1/10, 53 (33-74)% при соотношении КМ/КЭ 1/5, 44 (23-70)% при соотношении КМ/КЭ 1/2. Показатель достоверности различий (р) параметров этой группы относительно здоровых доноров составлял 0,056; 0,048; 0,031; относительно пациентов без осложнений – 0,104, 0,012, 0,009 при соотношениях КМ/КЭ 1/10,  1/5 и  1/2, соответственно.

Фагоцитарная активность

Для всесторонней оценки фагоцитарной активности мы использовали стимуляторы различного происхождения: искусственного (гранулы латекса) и естественного (одноклеточные дрожжевые грибы S. cerevisiae и бактерии L. Acidophilus).  Как следует из полученных данных  (табл. 5), показатели  фагоцитарной активности нейтрофилов (ФИ, ФЧ) онкологических больных с сепсисом после стимуляции латексом были достоверно выше соответствующих показателей здоровых доноров (р=0,021; р=0,015, соответственно). Функциональная активность нейтрофилов онкологических больных без осложнений по этим показателям не отличались от таковой для  доноров (р=0,784 ФИ и р=0,621 ФЧ).

Таблица  5. Параметры фагоцитарной активности онкологических больных без инфекционных осложнений и на фоне сепсиса в сравнении со здоровыми донорами, Мед (25%-75%)

Параметры

Стимуляторы фагоцитоза

Здоровые доноры

(контроль)

Онкологические больные

без осложнений

с сепсисом

ФИ, %

латекс

28 (21-33)

30 (20-46)

76* (72-97)

дрожжи

15 (9-27)

-

52* (41-62)

бактерии

21 (12-25)

-

62* (31-57)

ФЧ

латекс

6 (3-7)

7 (5-15)

38* (29-52)

дрожжи

1 (1-2)

-

5* (4-8)

бактерии

1 (1-1)

-

4* (3-7)

НСТ-тест спонтанный, у.е.

0,15

(0,090,32)

0,52

(0,280,70)

2,35*

(1,902,50)

НСТ-тест индуцированный латексом, у.е.

1,20**

(1,101,31)

1,41**

(1,281,60)

2,50*

(2,202,81)

*  -  достоверное отличие от контрольной группы (p<0,05).

**  -  результаты индуцированного НСТ-теста  достоверно отличающиеся от результатов спонтанного  НСТ-теста  (p<0,05).

Аналогичные результаты были получены при проведении НСТ-теста, характеризующего метаболическую активность гранулоцитов. По данному показателю базальная активность нейтрофилов крови больных с сепсисом, исследованная в спонтанном НСТ-тесте, была значительно выше, чем у больных без осложнений (р=0,014) и здоровых доноров (р=0,001). Параметры индуцированного НСТ-теста у больных с осложнениями также повышены, но различия между группами не столь велики (р=0,040 в сравнении с показателями больных без осложнений, р=0,034 в сравнении с контролем). В то же время способность клеток к активации у больных с сепсисом снижена, о чем свидетельствует отсутствие достоверных различий (p=0,072) значений индуцированного и спонтанного теста в этой группе, тогда как у здоровых доноров и у больных без осложнений метаболическая активность после стимуляции достоверно возрастала (медиана увеличилась в 7,7 раз (р=0,039) и 2,8 раза (р=0,045) соответственно).

Приведенные результаты указывают на то, что при сепсисе значительно увеличивается активность фагоцитов крови относительно микроорганизмов, выраженная еще более интенсивно, чем при захвате частиц латекса: ФИ после стимуляции дрожжами увеличивался в 3,5 раз, бактериями – в 3 раза; а ФЧ – в 4-5 раз в сравнении со здоровыми донорами.

Таким образом, в результате проведенных исследований не было выявлено достоверных отличий между уровнем функциональной активности лейкоцитов здоровых доноров и больных со злокачественными новообразованиями без инфекционных осложнений. Однако было установлено, что при сепсисе у онкологических больных наблюдается гиперактивация клеток-эффекторов врожденного иммунитета, что можно рассматривать как важное звено патогенеза органной и полиорганной недостаточности.

Гистологическое исследование тканей внутренних органов онкологических больных с сепсисом

Образцы тканей внутренних органов (печени, почек, селезенки, сердца, легких, стенок толстого и тонкого кишечника) были изъяты после аутопсии 6 онкологических больных с сепсисом, подтвержденным по результатам патолого-анатомического исследования. У всех больных клиническая картина ССВР развивалась в течение первых 2-6 суток после оперативного вмешательства. В 2 случаях сепсис был диагностирован на фоне пневмонии, в 3 случаях отмечали несостоятельность анастомоза, в 1 случае первичный гнойный очаг прижизненно выявить не удалось. Были отмечены характерные для сепсиса, но, в целом, неспецифичные морфологические изменения почек (наблюдали набухание почечных клубочков, слущивание эпителия канальцев), печени (деструкция печеночных балок, кровоизлияния), а также атрофия и слущивание эпителия крипт и ворсин кишечника. Наиболее яркие изменения можно было наблюдать в легких. Отмечали уменьшение воздушности за счет отека и массированной лейкоцитарной инфильтрации, множественные кровоизлияния. Наблюдалась неравномерность кровенаполнения тканей различных органов с малокровием в одних участках и переполнением кровью сосудов в других. При исследовании часто выявляли признаки нарушения гемокоагуляции в виде ДВС синдрома. При этом, в кровеносных сосудах различных органов выявляли фибриновые, эритроцитарные и лейкоцитарные тромбы. Отмечали признаки внутрисосудистого свертывания крови, послужившего вероятной причиной появления множества мелких очагов некроза в тканях и органов вследствие тромбоза, а также различных по величине кровоизлияний.

Таким образом, проведенное обследование установило наличие признаков полиорганной недостаточности, обусловленной неспецифическими нарушениями микроструктуры внутренних органах, которая, очевидно, и являлась причиной смерти пациентов.

Изучение патогенетической роли бактериального липополисахарида  в развитии полиорганной недостаточности в опытах на лабораторных животных

Для оценки роли эндотоксемии в развитии ПОН нами был проведен эксперимент на 10 лабораторных мышах, которым вводили LPS с последующим анализом морфологических изменений внутренних органов. Было установлено, что через 48 часов после введения LPS E.coli наблюдалось  значительное повреждение микроструктуры всех исследованных внутренних органов. Наиболее ярко патологические изменения проявились при анализе легких, печени и почек. Все выявленные изменения имели неспецифический характер, обусловленный в основном нарушениями морфологии микрососудов, и, очевидно, создавали предпосылки для развития органной и полиорганной недостаточности у животных после введения им эндотоксина.

Наблюдаемые патологические изменения внутренних органов на фоне токсикоза, индуцированного LPS, были сходны с обнаруженными при исследовании патологического материала больных с сепсисом, у которых прижизненно отмечали выраженные явления ПОН вследствие развития ССВР. Это свидетельствует о том, что бактериальный токсин и в отсутствие живых микроорганизмов может инициировать такую же степень патологических нарушений внутренних органов, обусловленных в основном, нарушениями кровообращения, которую отмечали у септических больных. Полученные данные свидетельствуют о значительной, а, возможно, и ведущей роли бактериальных эндотоксинов в развитии ПОН и подтверждают теорию о возможности развития клинических признаков схожих с сепсисом (т.н. сепсисоподобное состояние [Adrie C., et al., 2002]) в отсутствии бактериальной инфекции при ослаблении барьерных функций слизистых и кожных покровов.

Учитывая патогенетическую значимость бактериального эндотоксина в инициации сепсиса и септического шока, представляется обоснованным рекомендовать дополнение стандартной лекарственной терапии пациентов с этой патологией экстракорпоральными методами детоксикации, обеспечивающими элиминацию из крови не только бактерий, но и их токсинов, а также уменьшение концентрации циркулирующих медиаторов каскада воспаления.

Изменение основных клинических и лабораторных параметров в результате применения различных подходов к ЭКД при лечении онкологических больных с сепсисом

В ходе описываемого проспективного исследования больным с сепсисом в составе реанимационных мероприятий специалистами ОРИТ проводили ГС (n=67), ГДФ (n=32) и ГФ (n=17). Клиническую эффективность методов ЭКД при терапии сепсиса у онкологических больных  оценивали по снижению дозы вазопрессоров, изменению температуры тела, концентрации лейкоцитов, уровней прокальцитонина и лактата в сыворотке крови.

Согласно результатам анализа данных, всестороннее улучшение клинического состояния пациентов с сепсисом наблюдалось только после ГС, что проявлялось в снижение дозы вазопрессорных препаратов, необходимой для поддержания артериального давления (допмина – с 6,0 (4,2-9,0) мкг/кг/мин до 4,0 (0,0-6,0) мкг/кг/мин, р=0,025; адреналина – с 7,0 (1,4-17,0) мкг/кг/мин до 0 (0,0-11,0) мкг/кг/мин, р=0,034), снижении гипертермии тела (с 37,6 (37,0- 38,1)°С до 36,9 (36,6-37,1)°С, р=0,033) и падении через 1 сутки после проведения процедуры уровня прокальцитонина (с 10,0 (5,8-19,3) нг/мл до 2,3 (1,5-24,5) нг/мл, р=0,0002). В результате курса ГДФ у пациентов с септическими осложнениями наблюдалось достоверное снижение гипертермии. Аналогичная тенденция, хотя и не подтвержденная статистически, наблюдалась после курса ГФ.

Эффективность применения LPS-адсорбера для ЭКД онкологических больных с сепсисом

В настоящее исследование было включено 7 пациентов с тяжелым  сепсисом, обусловленным разившимся в послеоперационном периоде инфекционным процессом, инициированным грамотрицательными микроорганизмами. Терапевтические мероприятия включали применение при терапии процедуры ЭКД с использованием селективной гемосорбционной колонки LPS-адсорбер (Alteco, Sweden). Продолжительность процедуры – 2 ч. Показатель 28 суточной выживаемости составил 86%.

По окончании курса ГС наблюдалось достоверное (p=0,043) уменьшение  гипертермии и повышение среднего артериального давления с 51±4.2 мм рт. ст. до 62±5.7 мм рт. ст (p=0.024), в сочетании с тенденцией к нормализации центрального венозного давления. Наряду с отмеченными изменениями, было установлено снижение дозы вазопрессоров: норадреналина – с 38.0±3.4 мкг/кг/мин до 10.2±5.2 мкг/мин (p < 0.01) и допмина– с 16±3.3 мкг/кг/мин до 8±2.9 мкг/кг/мин (p=0.014), соответственно.

Указанная положительная динамика клинических параметров больных прямо коррелировала с изменением концентрации в крови триггерных и некоторых медиаторных факторов воспаления. В результате ГС отмечалось существенное снижение в сыворотки крови пациентов уровня LPS: с 1.07±0.41 до 0.37±0.37 МЕ/мл, p=0.001. Хотя, в результате проведенного исследования не удалось обнаружить статистически значимого изменения (p>0.05) сывороточного уровня протестированных цитокинов (IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17), полученные данные  демонстрируют тенденцию их снижения в сыворотке крови отдельных пациентов после указанной процедуры. Проведенный статистический анализ показал, что уровень концентрации сывороточного IL-6 взаимосвязан с изменением температуры тела (p=0,011); а содержание LPS и IL-6 тесно коррелирует с потребностью больных в допмине (p=0,042 и p=0,025, соответственно). Также обнаружена тесная взаимосвязь между концентрацией в крови LPS и TNF (p=0,050); LPS и IL-8 (p=0,050). После окончания процедуры ГС наблюдалась выраженная  положительная динамика сывороточной концентрации растворимых рецепторов к цитокинам: уровень  sIL-1 II R повышался с 3,0 (2,5-3,2) нг/мл до 3,7 (3,0-3,8) нг/мл, p=0.018, а sIL-6 R  – с 32,5 (29,7-37,8) нг/мл до 39,9 (28,7-42,4) нг/мл, p=0.237, соответственно, что могло являться следствием разрушения лиганд-рецепторных комплексов с последующей сорбцией цитокина при перфузии.

Полученные данные указывают на то, что эффективность применения данного устройства может быть обеспечена сочетанием селективной элиминации из крови LPS и низкоселективной фиксацией медиаторов воспаления (цитокинов) на сорбенте.

Эффективность применения для ЭКД больных с сепсисом колонки на основе углеродного сорбента

В настоящее исследование было включено 40 пациентов с сепсисом, развившимся в послеоперационном периоде. Терапевтические мероприятия включали применение при манифестации клинических признаков сепсиса и/или септического шока процедуры ГС с использованием колонок Adsorba, Sweden на ГАУ. Продолжительность процедуры – 2 ч. Показатель 28 суточной выживаемости составил 58%.

Было установлено, что по окончании этой процедуры наблюдалось снижение медианных значений, характеризующих уровень LPS в сыворотке крови c 0,2 МЕ/мл до 0,06 МЕ/мл. Статистический анализ не подтвердил достоверность отмеченных различий вероятно по причине того, что исходно более чем у четверти больных уровень LPS и большинства цитокинов в крови был недетектируемым. Однако в  группе больных со значимым исходным значением содержания бактериального эндотоксина в сыворотке крови было отмечено достоверное снижение его уровня после применения углеродной колонки (с 3,8 (0,61-6,2) МЕ/мл до 0,03 (0-0,9) МЕ/мл, р=0,009). Полученные данные показывают неоднозначный характер изменений в результате ГС уровня цитокинов: IL-6 – с 129(51-552) пг/мл до 110 (51-507) пг/мл, IL-10 47(38-138)пг/мл до 59 (41-157)пг/мл, IL-18 c 475 (385-564) пг/мл до 331 (287-347) пг/мл. В  целом наблюдается тенденция значительного снижения изначально сверхвысоких сывороточных концентраций этих цитокинов при отсутствии достоверно доказанной динамики. В смывах с сорбентов после ГС отмечались высокие концентрации IL-6 (55,(0-102) пг/мл), IL-18 (548 (402-879) пг/мл) и IL-8 (520 (348-592)пг/мл), даже в тех случаях, когда в крови пациентов эти медиаторы, практически, не детектировались. Было выявлено значительное повышение концентрации некоторых рецепторов к цитокинам: sR IL-1 II в 2,8 раз, sR TNF I  в 1,7 раз (p<0.05). Было также установлено, что применение ГС в виде курса способствует снижению содержания в циркулирующей крови триггерных и медиаторных факторов воспаления (LPS и цитокинов), а также нормализует активность эффекторов иммунной системы.

Таким образом, применение низкоселективных гемосорбентов для экстракорпоральной терапии у онкологических больных с сепсисом позволяет эффективно элиминировать из кровотока бактериальные эндотоксины и широкий спектр медиаторов воспаления. В результате происходит нормализация функциональной активности эффекторов иммунитета. Полученные данные свидетельствуют о перспективности применения ГС в комплексной  терапии сепсиса и септического шока, особенно в виде курса процедур.

Однако, несмотря на несомненную результативность использования в терапии больных с сепсисом  существующих коммерческих устройств они обладают рядом недостатков: из-за ограниченной доступности LPS-адсорберов, в ряде случаев,  невозможно их курсовое применение, а при использовании углеродного сорбента происходит потеря не только целевых молекул, но и некоторых необходимых организму белков (например альбумина), кроме того имеется опасность гемолиза и агрегации тромбоцитов крови ввиду неудовлетворительной биосовместимости этого сорбента. Это обосновывает необходимость поиска новых материалов, перспективных для использования в качестве гемосорбентов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследование свойств новых материалов, перспективных для применения в качестве гемосорбентов при септических осложнениях

Объектами исследования являлись образцы сорбентов на основе сверхсшитых полистиролов (Стиросорб 514, Стиросорб 516 и Стиросорб 414) и оксида железа (Fe2О3, Fe3O4+С, Fe3O4+Ag, Fe3O4). Проводили сравнительное изучение интенсивности элиминации из 0,9% раствора хлорида натрия этими сорбентами бактериального LPS, широкого спектра рекомбинантных цитокинов (TNF, TNF, IL-6, IL-1, IL-10, IL-4); влияния на ТКО различных микроорганизмов (S.aureus, E.coli, K.pneum.pneumoniae, С.famata, S.epidermidis). Также оценивали биосовместимость образцов, исследуя структурные и функциональные изменения клеток крови (гемолиз, гибель МЛ, агрегация тромбоцитов) после коинкубации с тестируемыми сорбентами in vitro.

Результаты исследований свойств ферримагнитных наночастиц свидетельствуют о том, что, несмотря на способность указанных частиц эффективно элиминировать широкий спектр биологически активных молекул (цитокины – от 36% до 100%, LPS на 70%), а также тормозить рост колоний различных видов микроорганизмов, эти образцы не могут быть использованы как самостоятельные гемосорбенты ввиду их значительной токсичности для клеток крови (гибель МЛ – до 84%). Однако магнетит представляется весьма перспективным материалом для создания композитных пористых сорбентов для улучшения сорбционной активности основы композиционного материала. Прямой контакт клеток крови с магнетитом может быть предотвращен при формировании биосовместимой основой пор с диаметром менее 1-2 микрон.

По результатам сравнительного исследования образцов сорбентов на основе сверхсшитого полистирола в ряду Стиросорб наиболее перспективным материалом для дальнейших исследований был признан Стиросорб 514. Этот сорбент, практически, нетоксичен для клеток крови (через 1 сутки коинкубации гибель МЛ не превышала 7%, а эритролиз 12%, р<0.05), способен элиминировать из физиологического раствора широкий спектр цитокинов MW 8-20,4  kDa (на 71-92%, р<0.05), а также бактериальный LPS (на 77%, р=0,004). При этом, в результате гемоперфузии через этот сорбент наблюдается угнетение колониеобразования микроорганизмов (ТКО S aureus – 51%, р=0,04), что может являться следствием как селективного цитопатогенного воздействия на бактерии, так и их иммобилизации на поверхности гранул.

Сравнительный анализ свойств сорбентов на основе Стиросорб и активированного угля

Оценку физических, сорбционных свойств и гемосовместимости Стиросорб 514 и композиционного материала на его основе с добавлением магнетита (MMN200) проводили в сравнении с коммерческим образцом гемосорбента на основе ГАУ.

Физические свойства. Как показали исследования, выполненные совместно с сотрудниками НИТУ МИСИС, полистирольные сорбенты Стиросорб 514 и MMN200, представляли собой сферические гранулы диаметром 0,3-1,0 мм с развитой внутренней структурой. Оптическая микроскопия выявила, что гранулы тестируемых полимерных сорбентов имеют гладкую поверхность, и материал не содержит пылевидных фракций, тогда как гранулы ГАУ (цилиндрической формы размером 2±0.8 мм) легко крошились. По данным СЭМ стенки и торцы гранул ГАУ покрыты оболочкой, что значительно уменьшает пористость поверхности, тогда как гранулы сорбента ряда Стиросорб имеют на поверхности открытые поры размером не более 100 нм.

Стиросорб 514

MMN200

ГАУ

Рисунок 5. Пористая структура скола сорбентов на основе сверхсшитого полистирола в сравнении с ГАУ. СЭМ поверхности скола гранул.

Согласно данным СЭМ, структура обоих сорбентов Стиросорб представлена большим количеством микропор диаметром 1,5-3 нм и макропорами вплоть до 100 нм (рис.5). Структура ГАУ представлена подавляющим объемом макропор, но имеется некоторое количество и микропор. Диаметр большинства макропор ГАУ много крупнее, чем у сверхсшитого полистирола: ~100 мкм и ~10 мкм, соответственно. Наличие большого числа открытых микро- и макропор во всех сорбентах ряда Стиросорб подтверждается измерениями внутренней удельной поверхности гранул методом низкотемпературной сорбции азота. Согласно результатам расчетов, выполненных по уравнению BEТ, удельная площадь поверхности гранул Стиросорб 514 и MMN200, подготовленных для гемосорбции, составляет 806-1200 м2/г и 580-1100 м2/г, соответственно. Тогда как соответствующий параметр ГАУ соответствовал 721-945 м2/г. C использованием теории функционала плотности были рассчитаны показатели моды полуширины микропор исследуемых образцов Стиросорб 514 – 8,440±0,139% , MMN200 8.068±0.151% , ГАУ – 8,068±0,076% , а объем микропор соответствовал 40,2 м2/г, 30,2 м2/г, 46,7 м2/г. Образцы сорбентов серии  Стиросорб имеют значительно большую долю микропор в сравнении с ГАУ, при этом микропоры MMN200 меньше, чем у Стиросорб 514. В среднем макропоры ГАУ крупнее, чем у сверхсшитых полистиролов в 10-1000 раз. В целом можно заключить, что сорбенты на основе сверхсшитого стирола характеризуются большим количеством микро- и мезопор, что позволяет отнести их к бипористым сорбентам и определяет их значительную сорбционную емкость, тогда как, ГАУ имеет, в основном, макропоры, сравнимые с линейными размерами клеток крови.

Сорбционная активность. Физиологический раствор и кровь (V=15мл), содержащие рекомбинантные цитокины человека (IL-1, IL-4, IL-10, TNF, TNF, IL-8, IL-6) и экзогенный бактериальный LPS, перфузировали со скоростью порядка 1,3 мл/мин через миниатюрные модели колонок, заполненных исследуемыми сорбентами (m=0,88±0,134 г). Анализ состава перфузата указывал, в целом, на эффективное связывание исследуемыми сорбентами LPS и всех анализируемых цитокинов в обоих средах. Сравнительный анализ активности образцов продемонстрировал, что в физиологическом растворе MMN200 связывает более узкий спектр молекул чем остальные образцы с максимумом в области средних молекул MW 15-17 kDa.  В сыворотке крови оба образца ряда Стиросорб связывали более «легкие» молекулы IL-8 (8 kDa) и IL-4 (15 kDa) с умеренной интенсивностью (менее 40 % от исходного уровня), смещая макcимум своей активности (76-100%) в область более «тяжелых» молекул IL-18, IL-1, TNF, TNF, IL-6, IL-10 (MW 17-18.6 kDa). Напротив спектр активности ГАУ  значительно сузился с максимумом (68-100%) в области средних молекул IL-4, IL-1, TNF (MW 15-18 kDa). Также было установлено, что Стиросорб 514 и MMN200 более эффективно в сравнении с ГАУ элиминировали из сыворотки крови LPS (97%, 100% и 68%, соответственно).

Исследование гемосовместимости. Кровь здоровых доноров, стабилизированную цитратом, в объеме 10 мл перфузировали через миниатюрные модели колонок, заполненных исследуемыми сорбентами (m=0,88±0,134 г). Всего было сделано 20 циклов рециркуляции, со скоростью порядка 1,3 мл/мин. После завершения процесса перфузии в триплетах были оценены показатели уровня гемолиза и агрегации тромбоцитов в каждой пробе. Полученные данные продемонстрировали отсутствие значительного (менее 10%) гемолиза после перфузии через колонки, набитые сорбентами на основе сверхсшитого полистирола. Напротив, многократный контакт крови с ГАУ приводил к значительному лизису эритроцитов (на 33±5,8% относительно интактной пробы, р=0,014). Интенсивность гемолиза при использовании в качестве сорбента Стиросорб 514 (5±2,4%) и MMN200 (11±9,5%) была ниже на 28% (р=0,001) и 22% (р=0,013), соответственно, в сравнении с воздействием ГАУ. Агрегация тромбоцитов также увеличивалась после перфузии через колонку с ГАУ (на 30±11.3% относительно интактного контроля, р=0,008). Изменения функциональной активности тромбоцитов после контакта с MMN200 были менее значительными: агрегация увеличивалась на 16±7.4% относительно базового уровня (р=0,041). После перфузии через Стиросорб 514 не было обнаружено достоверных изменений агрегатообразования (6±8.9%, р=0,152).

Угнетение высеваемости микроорганизмов из перфузата. Подготовленными сорбентами (m=0,88±0,134 г) набивали миниатюрные макеты колонок для перфузии, через которые фильтровали суспензию микроорганизмов объемом 9 мл (S. cerevisiae) или 15 мл (B. subtilis, L. acidophilus) со скоростью порядка 1,3 мл/мин. Всего – 9 циклов фильтрации. Измерение всех параметров проводили в трех параллельных пробах.

Таблица 6. Снижение колониеобразования бактерий и количества дрожжей в результате перфузии через макеты колонок с Стиросорб 514, MMN200 и ГАУ, Мед (25%-75%)

Тип сорбента

B. subtilus

L.acidophilus

S. cerevisiae

Кол-во колоний

ТКО, %

Кол-во колоний

ТКО, %

Общ. кол-во кл. в 1 мл, 108

% от контр.

Отн.кол-во живых клеток, %

% от контр.

MМN200

31*

(28-34)

21

150*

(141-163)

25

2,15*

(2,01-2,15)

24

72*

(68-74)

88

Стиросорб 514

2 *

(0-2)

95

33*

(28-39)

84

1,65*

(1,34-1,7)

18

60*

(57-68)

73

ГАУ

4*

(2-5)

90

18*

(18-21)

91

2,35*

(2,042-2,39)

26

61*

(60-66)

74

Интакт. контроль

40

(39-50)

-

201

(195-220)

-

9,1

(8,97-9,31)

-

82

(79-85)

-

р

0,0176

-

0,015

-

0,021

-

0,028

-

* достоверное (p<0,05) отличие от интактного контроля

Согласно полученным нами данным, в сравнении с интактным контролем в результате многоэтапной перфузии  через макеты колонок со всеми исследуемыми сорбентами значительно снижалось высевание бактериальных культур из перфузата. Однако наиболее эффективным образом угнетала рост колоний микроорганизмов перфузия суспензии через Стиросорб 514 и ГАУ (табл. 6). Кроме того, Стиросорб 514 оказался способным наиболее эффективно из протестированных сорбентов иммобилизировать на своей поверхности клетки дрожжевых грибов S. cerevisiae, что проявилось в достоверном снижении их числа и относительного количества живых клеток в перфузате.

Проведенные in vitro исследования дали основания предполагать, что сорбенты на основе Стиросорб 514 имеют ряд серьезных преимуществ перед сорбентами на основе активированного угля и могут быть эффективно использованы как основа устройств для ЭКД в комплексной терапии септических осложнений.

Испытания макета колонки для ЭКД на основе Стиросорб 514

На основе Стиросорб 514 для проведения испытаний были созданы макеты колонки для ГС различного объема (10 мл, 80 мл и 100 мл).

Эффективность удаления экзогенного TNF и LPS из системного кровотока животных

Эндотоксиновый шок воспроизводили, вводя кроликам внутривенно раствор LPS и рекомбинантного TNF человека. Через 3 мин после этого  кроликам опытной группы начинали процедуру гемоперфузии через макет гемосорбционных колонок (V=10 мл). Скорость перфузии составляла 4 мл/мин при длительности процедуры 1 ч. Животным контрольной группы терапевтических мероприятий не проводили.

Рисунок 5. Сравнительная динамика уровня hTNF (а) и LPS (б) в сыворотке крови кроликов опытной (после ГС) и контрольной групп.

По окончании процедуры ГС у животных наблюдали значительное снижение в крови введенного цитокина (на 61%) на фоне, практически, полной элиминации LPS из системной циркуляции (рис.5).

Исследование эффективности применения устройства на основе Стиросорб 514 для лимфоперфузии

Больному раком верхнеампульного отдела прямой кишки с тяжелым сепсисом с терапевтическими целями было выполнено отведение лимфы из грудного протока. 700 мл лимфы перфузировали через колонку с Стиросорб 514 (80-100 капель/мин) в условиях in vitro. Исследования проводили на базе ФГУ «3 Центральный военный клинический госпиталь им. А.А. Вишневского» МО РФ.

В перфузате  отмечали снижение уровня LPS –на 86%, IL-6 – на 36%, IL-8 – на 57%, IL-18 – на 38%, мочевины – на 20%, креатинина – на 40%, тогда как уровень альбумина снизился менее чем на 2%.

Сравнительная оценка клинической эффективности применения колонок на основе углеродного сорбента и Стиросорб 514 при лечении собак с симптомами органной недостаточности на фоне ССВР

Для участия в исследовании были отобраны собаки со злокачественными новообразованиями различной локализации с симптомами развития изолированной органной (почечная и печеночная недостаточность, панкреатит) и полиорганной недостаточности на фоне сепсиса. Животные были разделены на 2 группы по 5 собак. ГС осуществляли на аппарате «Гемос-ГС» (Биотех-М, РФ) с использованием 2 типов колонок объемом 100 мл: в контрольной группе «Гемос-КС» (Биотех-М, РФ) на основе углеродного сорбента, а в экспериментальной – стеклянной колонки, содержащей Стиросорб 514. Нагрузка гепарином – 100-200 ЕД/кг. Продолжительность процедуры – 2 ч. Осуществляли оценку биохимических, гематологических, иммунологических параметров крови, исследование ее газового состава и уровня электролитов, а также критериев физиологического состояния животных. Исследования проводили совместно с сотрудниками отделения экспериментальной онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН.

После гемоперфузии через полистирольную колонку у животных наблюдали  выраженное улучшение общего клинического состояния, нормализацию сердечно-сосудистой деятельности (повышение исходно сниженного систолического АД на 21%, среднего АД на 24%, р<0.05 ) и когнитивных функций. У собак экспериментальной группы, в отличие от контрольной, гемоперфузия через полистирольный сорбент не приводила к изменению pH и ионного состава сыворотки, не вызывала снижения концентрации эритроцитов и тромбоцитов в системном кровотоке. Последнее, очевидно, свидетельствует об отсутствии признаков агрегатообразования, т.е относительной толерантности клеточных факторов свертывающей системы крови к контакту с полистирольным сорбентом.

Таблица 7. Изменение в результате ГС уровня метаболитов, альбумина и LPS в сыворотке крови собак с ПОН на фоне сепсиса, Мед (25%-75%)

Аналит

Сорбент

До ГС

После ГС

Динамика, %

Норма

Мочевина, ммоль/л

Стиросорб 514

19

(11-22)

7,8

(7-16)

-59

3,5-10,0

ГАУ

15

(8-38)

10

(6-34)

-33

Креатинин, мкмоль/л

Стиросорб 514

148

(92-203)

104

(102-224)

-30

45-140

ГАУ

152

(89-363)

132

(101-303)

-13

Билирубин общий, мкмоль/л

Стиросорб 514

53

(30-76)

12*

(9-15)

-77%

0-12

ГАУ

23

(6-66)

29

(8-71)

+26

LPS, МЕ/л

Стиросорб 514

0,114

(0,097-0,241)

0*

(0-0,003)

-100

0-0,0001**

ГАУ

0,100

(0,054-0,394)

0,005

(0-0,084)

-81

Альбумин, г/л

Стиросорб 514

28

(27-29)

30

(24-36)

+7

25-391

ГАУ

31

(19-43)

22*

(20-24)

-30

*  р<0.05

** – данные получены по результатам собственных исследований клинически здоровых собак

Было установлено, что Стиросорб 514 в сравнении с углеродным сорбентом обеспечивает более эффективную элиминацию из крови животных различных метаболитов: мочевины – на 59%, креатинина – на 30%, билирубина – на 77% (р=0,007) и LPS – на 100% (р=0,031), тогда как изменения концентрации альбумина не наблюдалось (табл.7). Следовательно, можно сделать вывод  о том, что детоксицирующий эффект устройства на основе полистирольного сорбента ряда Стиросорб был выражен более интенсивно в сравнении с контролем.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о патогенетической значимости для развития сепсиса и ПОН бактериального LPS наряду с цитокинами в качестве триггеров и медиаторов воспаления, и о целесообразности их удаления из системного кровотока путем ГС. Данная процедура оказывает детоксицирующее и иммунокоррегирующее воздействие на организм больного, нормализует белковый и метаболический состав крови. ГС эффективна в составе комплексной терапии онкологических больных при применении на ранних стадиях инициации ССВР (эндотоксимия, гиперцитокинемия) до проявления клинических признаков полиорганной недостаточности. Полученные в ходе проведенной работы результаты могут явиться основанием для внедрения в практику здравоохранения и, в частности, онкологии, применения новых эффективных сорбентов ряда Стиросорб и устройств для экстракорпоральной детоксикации на их основе.

ВЫВОДЫ

  1. Повышение экспрессии молекул адгезии (CD11b) на фоне снижения маркера апоптоза CD95 на мембране лейкоцитов, наряду с увеличением концентрации сывороточных факторов (IL-6, IL-10, IL-18, LPS, sR TNF I, sCD14) и усилением функциональной активности лейкоцитов (NK-активности, фагоцитоза) можно рассматривать в качестве диагностических маркеров развития сепсиса у онкологических больных в послеоперационном периоде.
  2. Повышение концентраций IL-8, IL-10 и sR IL-1 II в крови пациентов с сепсисом и септическим шоком являются прогностически неблагоприятными признаками по показателю 28-дневной летальности онкологических больных.
  3. Бактериальный липополисахарид инициирует каскад медиаторов воспаления и приводит к формированию патоморфологических изменений, свидетельствующих о развитии полиорганной недостаточности у экспериментальных животных.
  4. Применение для экстракорпоральной детоксикации онкологических больных с сепсисом неспецифических углеродных гемосорбентов и селективных LPS-адсорберов в сравнении с фильтрационными методами сопровождается более выраженной элиминацией из кровотока бактериального эндотоксина и медиаторов воспаления, а также нормализацией функциональной активности эффекторов врожденного иммунитета, что ведет к снижению тяжести состояния пациентов и повышению показателя их 28-дневной выживаемости.
  5. Сравнительный анализ свойств образцов ферримагнитных сорбентов (Fe2O3, магнетит немодифицированный и с модификацией поверхности углеродом или серебром) и сорбентов на основе сверхсшитого полистирола (Стиросорб 514, Стиросорб 516 и Стиросорб 414) позволяет установить, что по гемосовместимости, интенсивности элиминации бактериального липополисахарида, широкого спектра цитокинов и микроорганизмов наилучшими характеристиками обладает  Стиросорб 514.
  6. Бипористые сорбенты Стиросорб 514 и MMN200 обладают лучшей гемосовместимостью и более эффективно элиминируют из крови человека и животных экзогенные триггерные факторы воспаления (микроорганизмы и их токсины), а также избыточные количества цитокинов в сравнении с используемыми в клинической практике гемосорбентами на основе активированного угля.
  7. В отличие от коммерческих углеродных картриджей, применение для ГС устройства на основе Стиросорб 514 в комплексном лечении собак со злокачественными новообразованиями с органной недостаточностью на фоне сепсиса способствовало более интенсивному удалению из системного кровотока бактериального липополисахарида, азотсодержащих соединений (мочевины, креатинина) и общего билирубина, без признаков усиления свертываемости крови и гемолиза.
  8. Испытания экспериментального устройства на основе Стиросорб 514, проведенные на собаках со злокачественными образованиями с органной недостаточностью на фоне сепсиса, показали, что применение в составе комплексной терапии ГС способствовало нормализации водно-электролитного и белкового состава крови, снижению потребности в вазопрессорной поддержке, нормализации показателей сердечно-сосудистой и иммунной систем, а также когнитивных функций животных.

Список работ, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

  1. Тугуз А.Р. Выявление возможных механизмов повышения содержания растворимых рецепторов цитокинов sIL-4R, sIL-6R, sTNF-RI, sTNF-RII в крови здоровых доноров и онкологических больных/ Тугуз А.Р, Анисимова Н.Ю., Чикилева И.В., Киселевский М.В., Голубев И.Н., Вершинина М. Ю., Воробьев А. А.// Иммунология – 2003. Т.2. №2. С. 113-116.
  2. Анисимова Н.Ю. Особенности цитокининдуцирующей активности и цитокинового профиля крови онкологических больных с сепсисом/ Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Киселевский М.В. //  Российский иммунологический журнал 2010. Т. 4(13). № 3. С. 276–281.
  3. Чикилева И. О. Двойственная роль толлподобных рецепторов в регуляции противоопухолевого иммунитета / Чикилева И.О., Анисимова Н.Ю., Караулов А. В., Киселевский М.В.// Иммунология – 2010. № 1. С.52-55.
  4. Анисимова Н.Ю. Особенности цитокининдуцирующей активности и цитокинового профиля крови онкологических больных с сепсисом / Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Киселевский М.В.// Российский иммунологический журнал – 2010. Т.4(13). № 3. С. 276–281.
  5. Анисимова Н.Ю. Новые перспективные сорбенты на основе полистирола, способные элиминировать микроорганизмы из крови/ Анисимова Н.Ю., Даванков В.А., Будник М.И., Спирина Т.С., Киселевский М.В.// Российский биотерапевтический журнал – 2010. Т.9. №.4. с.113-114, IV.
  6. Анисимова Н.Ю. Содержание бактериального эндотоксина и цитокинов в крови онкологических больных с послеоперационными осложнениями/ Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Киселевский М.В.// Аллергология и иммунология – 2010. Т.11. №4. С.310-313.
  7. Анисимова Н.Ю. Возможность элиминации микроорганизмов из крови модифицированными угольными гемосорбентами/ Анисимова Н.Ю., Спирина Т.С., Титов К.С., Малахова Н.В., Ситдикова С.М., Киселевский М.В.// Бюллетень  экспериментальной медицины и биологии    2011. №2. С. 239-240.
  8. Анисимова Н.Ю. Прогностическое значение  сывороточных уровней липополисахарида и липополисахарид-связывающего белка  у  больных с сепсисом/ Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Киселевский М.В.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии – 2011. №2.   С.82-85.
  9. Анисимова Н.Ю. Фагоцитарная активность нейтрофилов крови онкологических больных с сепсисом/  Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Титов К.С., Антонов А.К., Киселевский М.В.// Вестник службы крови России – 2011. №1. С. 31-33
  10. Анисимова Н.Ю. Влияние экстракорпоральной детоксикации  на содержание цитокинов и липополисахарида в крови онкологических больных с почечной недостаточностью/ Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Титов К.С., Киселевский  М.В.// Вестник службы крови России –2011. №1.   С. 28-33.
  11. Грицай А.Н. Характер лейкоцитарной инфильтрации опухолей больных раком яичников/ Грицай А.Н., Лебединская О.В., Анисимова Н.Ю., Киселевский М.В., Кабановская И.Н., Титов К.С., Рябчиков Д.А., Кашурников А.Ю.// Справочник акушера-гинеколога 2011. №1-2. С.23-27.
  12. Анисимова Н.Ю. Применение гемосорбции у больных раком яичников при сепсисе / Анисимова Н.Ю., Громова Е. Г., Кузнецова Л. С., Плужникова Н. А., Должикова Ю. И., Бойко Н. И., Киселевский М. В.//  Справочник акушера-гинеколога – 2011. №3-4. С.42-45.
  13. Anisimova N.Yu. Possibility of microorganism elimination from the blood using modified coal hemosorbents / Anisimova N.Yu., Spirina T.S., Titov K.S.,  Malakhova N.V.,  Sitdikova S.M.,  Kiselevsky M.V.// Bulletin of experimental biology and medicine 2011. V. 151 (Issue 2). P. 273-274.
  14. Анисимова Н.Ю. Эффективность применения сверхсшитых полистиролов для экстракорпоральной детоксикации при сепсисе/ Анисимова Н.Ю., Даванков В.А., Корнюшенков Е.А., Митин В.В., Соловьева О.В., Будник М.И., Доненко Ф.В., Киселевский М.В.// Российский  ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные – 2011. №2. С.23-25.
  15. Анисимова Н.Ю. Содержание бактериального эндотоксина и цитокинов в крови онкологических больных с почечной недостаточностью/  Анисимова Н.Ю., Громова Е. Г., Кузнецова Л.С., Андрейчиков А.А., Андрейчиков А.В., Киселевский М.В.// Сибирский медицинский журнал 2011. № 5. С. 22-24.
  16. Анисимова Н.Ю. Особенности функциональной активности эффекторов врожденного иммунитета онкологических больных на фоне сепсиса/ Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Плужникова Н.А., Киселевский М.В.// Сибирский онкологический журнал 2011. №3 (45). С. 51-55.
  17. Anisimova N.Yu. Dynamics of elimination of bacterial endotoxins and cytokines from the blood of tumor patients with sepsis in hemoperfusion using carbon adsorbents /  Anisimova N.Yu., Gromova E.G.,  Kuznetsova L.S.,  Sitdikova S. M.,  Kiselevskii M.V.// Bulletin of Experimental Biology and Medicine – 2011. V. 151 (Issue 5). P. 622-624
  18. Анисимова Н.Ю. Перспективность использования нанопористого сорбента  Стиросорб 514 для экстракорпоральной детоксикации при системной воспалительной реакции и сепсисе/ Анисимова Н.Ю., Даванков В.А., Будник М.И., Доненко Ф.В., Тугуз А.Р., Киселевский М.В.//  Вестник АГУ. Eстественно-математические и технические науки 2011. Вып. 1(76). С. 93-100.
  19. Анисимова Н.Ю.  Содержание цитокинов и растворимых рецепторов к цитокинам в крови онкологических больных с сепсисом/ Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Киселевский М.В.// Молекулярная  медицина – 2011. №5. С.39-41.
  20. Анисимова Н.Ю. Рецептор апоптоза и молекул адгезии лейкоцитов – перспективные  маркеры сепсиса у онкологических больных/ Анисимова Н.Ю., Плужникова Н.А., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Цветков Д.С., Киселевский М.В// Российский иммунологический журнал – 2011. Т. 5 (14). №3-4. С. 262-265.
  21. Анисимова Н.Ю. Исследование сорбционных свойств ферримагнитных наночастиц/ Анисимова Н.Ю.,Сенатов Ф.C., Миляева С.И., Киселевский М.В.//  Фундаментальные исследования   2011. №11. С.263-265.
  22. Анисимова Н.Ю. Динамика функциональной активности эффекторов врожденного иммунитета у онкологических больных с сепсисом при проведении экстракорпоральной детоксикации/ Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Плужникова Н.А., Андрейчиков А.А., Андрейчиков А.В., Киселевский М.В.// Сибирский медицинский  журнал 2011. №7. С.26-29
  23. Анисимова Н.Ю. Содержание иммуноглобулинов A, G, М классов и В-лимфоцитов в крови онкологических больных с сепсисом/ Анисимова Н.Ю., Громова Е. Г., Кузнецова Л. С., Должикова Ю. И. ,Плужникова Н. А., Титов К. С., Антонов А. К., Киселевский М. В.// Вестник службы крови России 2011. №4. С.27-30
  24. Анисимова Н.Ю. Интерлейкин-17 и интерлейкин-18, как биомаркеры сепсиса у онкологических больных/ Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Должикова Ю.И., Бойко Н. И., Титов К. С., Антонов А. К., Киселевский М. В.// Вестник службы крови России 2011. №4. С.30-33.
  25. Anisimova N.Yu. Cytotoxic activity of peripheral blood mononuclear leukocytes, activated by interleukin-2/-cyclodextrin nanocomposition against androgen receptor-negative prostate cancers/ Anisimova N.Yu., Sosnov A.V.,  Ustyuzhanina N.E., Baronzio G., Kiselevsky M.V.// ISRN Oncology 2011; 2011: 405656. doi:10.5402/2011/405656.
  26. Анисимова Н.Ю. Динамика функциональной активности эффекторов врожденного иммунитета у онкологических больных с сепсисом при проведении экстракорпоральной детоксикации / Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Киселевский М.В.//Медицина критических состояний 2011. №5-6. С.58-62.
  27. Anisimova N.Yu. Prospects for the application of biporous sorbents based on hypercrosslinked styrene polymers for the prevention and treatment of systemic purulent_septic complications/ Anisimova N.Yu., Dolzhikova Yu.I., Davankov V.A., Pastukhov A.V., Miljaeva S.I., Senatov F.S., Kiselevsky M.V.// Nanotechnologies in Russia – 2012. V. 7. P. 318–326.
  28. Анисимова Н.Ю. Концентрация сывороточных цитокинов и их рецепторов у онкологических больных с тяжелым сепсисом и септическим шоком/ Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Титов К.С., Антонов А.К., Киселевский М.В.// Технологии живых систем 2012. № 3. Т.7. С.18-23
  29. Анисимова Н.Ю. Перспективы применения бипористых сорбентов на основе сверхсшитых полимеров стирола в профилактике и терапии системных гнойно-септических осложнений/ Анисимова Н.Ю., Должикова Ю.И., Даванков В.А., Пастухов А.В., Миляева С.И., Сенатов  Ф.С.,  Киселевский М.В. // Российские нанотехнологии 2012. №5-6. С. 119-125.
  30. Анисимова Н.Ю. Оценка активности нейтрофилов крови при использовании бактерий и одноклеточных дрожжей в качестве объектов фагоцитоза/ Анисимова Н.Ю., Лебединская О.В., Карпенко А.Ю., Копылов  А.Н., Киселевский М.В.// Вестник Уральской медицинской академической науки 2012. №4. – т. 41. – С. 12-13.
  31. Киселевский М.В. Применение Омега-3 жирных кислот у хирургических больных с высоким риском осложнений в раннем послеоперационном периоде/ Киселевский М.В., Анисимова Н.Ю., Плужникова Н.А., Цветков Д.С.// Вестник анестезиологии и реаниматологии 2012. № 3. С.17-24.
  1. Плужникова Н.А. Динамика сывороточных иммуноглобулинов он больных в периоперационном периоде/  Плужникова Н.А., Анисимова Н.Ю., Лебединская О.В., Цветков Д.С.. Годовалов А.П., Киселевский М.В.// Бюллетень ВСНЦ СО РАМН 2012. №3. – Т. 85. – Часть 2. – С.148-150

Патенты:

  1. Патент на изобретение № 2334234, РФ. «Способ диагностики и мониторинга онкологических заболеваний»/ Беликов В.А., Анисимова Н.Ю., Кшняйкина А.В., Новожилова Т.И, Лазаренко М.И.; опубл. 20.09.2008. Бюл. № 26.
  2. Патент на изобретение № 2296761, РФ. Бромид 1-гексадецил-R-(-) -3-окси-1-азониабицикло[2.2.2] октана иммуномодулятор с противоопухолевыми, бактериостатическими и антиагрегантными свойствами и способ его получения / Аникиенко К.А,  Панков Д.И., Полезина А.С, Михалева И.Л, Анисимова Н.Ю., Киселевский М.В, Доненко Ф.В, Добрянский В.С, Поляков В.С, Мельников В.А, Петрунин В.А., Барышников А.Ю.; опубл. 10.04. 2006. Бюл. № 10. 
  3. Патент на изобретение № 2321589, РФ. +in&Collection=dips&SearchUrl=http://ru.espacenet.com/search97cgi/s97_cgi.exe?action=FilterSearch&QueryZip=%28%C0%ED%E8%F1%E8%EC%EE%E2%E0%29+%3CIN%3E+in&Filter=ru%2Fru%2Fespacefilt%2Ehts&ResultTemplate=ru%2Fru%2Fresults%2Ehts&Collection=dips&ResultStart=1&ResultCount=10&ViewTemplate=ru/ru/textdoc.hts&ViewErrorTemplate=ru/ru/incerror.hts&DocsFound1=119&BeginHighlight=&EndHighlight=&HLNavigate=">Способ получения бромида 1-гексадецил-+in&Collection=dips&SearchUrl=http://ru.espacenet.com/search97cgi/s97_cgi.exe?action=FilterSearch&QueryZip=%28%C0%ED%E8%F1%E8%EC%EE%E2%E0%29+%3CIN%3E+in&Filter=ru%2Fru%2Fespacefilt%2Ehts&ResultTemplate=ru%2Fru%2Fresults%2Ehts&Collection=dips&ResultStart=1&ResultCount=10&ViewTemplate=ru/ru/textdoc.hts&ViewErrorTemplate=ru/ru/incerror.hts&DocsFound1=119&BeginHighlight=&EndHighlight=&HLNavigate=">R+in&Collection=dips&SearchUrl=http://ru.espacenet.com/search97cgi/s97_cgi.exe?action=FilterSearch&QueryZip=%28%C0%ED%E8%F1%E8%EC%EE%E2%E0%29+%3CIN%3E+in&Filter=ru%2Fru%2Fespacefilt%2Ehts&ResultTemplate=ru%2Fru%2Fresults%2Ehts&Collection=dips&ResultStart=1&ResultCount=10&ViewTemplate=ru/ru/textdoc.hts&ViewErrorTemplate=ru/ru/incerror.hts&DocsFound1=119&BeginHighlight=&EndHighlight=&HLNavigate=">(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана+in&Collection=dips&SearchUrl=http://ru.espacenet.com/search97cgi/s97_cgi.exe?action=FilterSearch&QueryZip=%28%C0%ED%E8%F1%E8%EC%EE%E2%E0%29+%3CIN%3E+in&Filter=ru%2Fru%2Fespacefilt%2Ehts&ResultTemplate=ru%2Fru%2Fresults%2Ehts&Collection=dips&ResultStart=1&ResultCount=10&ViewTemplate=ru/ru/textdoc.hts&ViewErrorTemplate=ru/ru/incerror.hts&DocsFound1=119&BeginHighlight=&EndHighlight=&HLNavigate=">+in&Collection=dips&SearchUrl=http://ru.espacenet.com/search97cgi/s97_cgi.exe?action=FilterSearch&QueryZip=%28%C0%ED%E8%F1%E8%EC%EE%E2%E0%29+%3CIN%3E+in&Filter=ru%2Fru%2Fespacefilt%2Ehts&ResultTemplate=ru%2Fru%2Fresults%2Ehts&Collection=dips&ResultStart=1&ResultCount=10&ViewTemplate=ru/ru/textdoc.hts&ViewErrorTemplate=ru/ru/incerror.hts&DocsFound1=119&BeginHighlight=&EndHighlight=&HLNavigate="> иммуномодулятора с противоопухолевыми, бактериостатическими и антиагрегантными свойствами/ Аникиенко К.А,  Панков Д.И., Полезина А.С, Михалева И.Л, Анисимова Н.Ю., Киселевский М.В, Доненко Ф.В, Добрянский В.С, Поляков В.С, Мельников В.А, Петрунин В.А., Барышников А.Ю.; опубл. 10.04. 2008. Бюл. № 10. 
  4. Патент на изобретение № 2402338, РФ. Способ получения активированных мононуклеарных лейкоцитов/ Киселевский М.В., Анисимова Н.Ю., Соснов А.В.; опубл. 27.10. 2010. Бюл. № 30. 
  5. Патент на изобретение № 2400238, РФ. Способ получения депонированных лимфокин-активированных киллеров/ Загребин Л.В., Шестов С.С., Анисимова Н.Ю., Верескунова Н.В., Киселевский М.В.; опубл. 27.09.2010. Бюл. № 27. 
  6. Патент на изобретение № 2414915, РФ. Способ получения активированных лейкоцитов для адъювантной адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований/ Чикилева И.О., Анисимова Н.Ю., Киселевский М.В.; опубл. 27.03. 2011. Бюл. № 9.
  7. Патент на изобретение № 2448897, РФ. Способ комплексной очистки физиологических жидкостей/ Даванков В.А., Анисимова Н.Ю., Киселевский М.В., Будник М.И.; опубл. 27.04. 2012. Бюл. № 12. 

Главы в монографиях:

  1. Major properties of dendritic cells and their actual and potential applications in cancer therapy and infectious disease prophylaxis/  Anisimova N.Yu., Lebedinskaya O.V., Kiselevsky M.V.,  Abramov V.M.,  Chikileva I.O/ In  Atlas Effectors of Anti-Tumor Immunity/ Ed. by Kiselevsky M.V., Springer2008,  P.  111-159.
  2. Механизм действия интерлейкина-2 и лимфокин-активированных киллеров/ Чикилева И.О., Родионова Л.М., Лебединская О.В., Анисимова Н.Ю. / Опухолевые серозиты: плевриты, асциты, перикардиты – М.: Практическая медицина, 2011, с. 238-240.
  3. Immunological Pathogenesis of Septic Reactions and Elimination of Triggers  and Mediators of Inflammation/ Shubina I., Anisimova N. Yu., Gromova E.,Chikileva I., Kiselevsky M./ In Insight and Control of Infectious Disease in Global Scenario/ Ed. by R. Priti. Intech. 2012, р. 157-178.
  4. Morphological and Functional Characteristics of Serous Cavities/ Lebedinskaya O.V., Shubina I. Zh., Anisimova N. Yu., Kopylov A. N., Kiselevsky, M. V./ In Malignant Effusions/ Ed. by Kiselevsky M.V., Springer2012. P. 1-10.
  5. Pathogenesis of Malignant Effusions/ Chikileva I.O., Anisimova N.Yu., Shubina I.Zh., Kiselevsky M.V. / In Malignant Effusions/ Ed. by Kiselevsky M.V., Springer2012.   P. 11-22.

Тезисы конференций, конгрессов и симпозиумов:

  1. Anisimova N.Yu. Sorption properties of the magnetite nanoparticles/ Anisimova N. Yu., Kiselevsky M.V., Zagrebin L.V., Shestov  S.S./ Sepsis 2009. Abstract book. – 11th-14th November 2009, Amsterdam, The Netherlands.   P. 31.
  2. Anisimova N.Yu. Cytokines and lipopolysaccharide elimination in cancer patients with sepsis/ Anisimova N. Yu., Kuznetzova L.S., Kiselevsky M.V., Gromova E.G./ Sepsis 2009. Abstract book. – 11th-14th November 2009, Amsterdam, The Netherlands.   P. 30-31.
  3. Анисимова Н.Ю. Нанопористые сорбенты, эффективные для использования при экстракорпоральной детоксикации онкологических больных с сепсисом и септическим шоком/ Анисимова Н.Ю., Даванков В.А., Киселевский М.В., Будник М.И./ Тезисы докл. II Всероссийской научной конференции с межд. участием «Наноонкология», Тюмень, 26-28 сентября 2010. – Российский биотерапевтический журнал – 2010. № 3. Т. 9. С. 3.
  4. Anisimova N.Yu. Perspectives on hemosorbtion application for treatment of cancer patients with sepsis/ Anisimova N. Yu., Kiselevsky M. V., Gromova E., Kuznetsova L./ 3rd World Cancer Congress abstract book. Singapore. 2010. P.618.
  5. Gromova E. Clinical experience with lipopolysaccharide adsorber in cancer patients with severe sepsis and septic shock/ Gromova E., Kisselevskiy M., Anissimova N., Kuznetsova L./ Сritical Care – 2010. V.14 (Suppl 1). S 137-138.
  6. Anisimova N. Hemoadsorbtion by Adsorba 300 and Adsorba 150 Gambro/Sweden in cancer patients with sepsis/ Anisimova N., Kiselevskiy M., Gromova E., Kuznetsova L./ Book of Abstracts– 8th World Congress on Trauma, Shock, Inflammation and Sepsis, March 9th-13th, 2010. Munich, Germany. P. 626.
  7. Anisimova N. Elimination of cytokine and soluble cytokine receptors by carbon sorbents from blood/ Anisimova N., Kiselevsky M., Gromova E., Kuznetzova L./ Abstracts of  Sepsis 2009. – Critical Care – 2010. № 14 (Suppl 2). P. 52.
  8. Громова Е.Г. Первый опыт применения селективной ЛПС-адсорбции у онкологических больных с тяжёлым сепсисом/ Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Киселевский М.В., Анисимова Н.Ю./  Тезисы докл. «Актуальные аспекты экстракорпорального очищения крови в интенсивной терапии» М.,  27-28 мая 2010 г. С.13.
  9. Anisimova N. Perspectives on hemosorbtion application for treatment of cancer patients with sepsis / Anisimova N., Kiselevsky M., Gromova E., Kuznetzova L./ Supportive Care in Cancer – 2011. V. 19 (Suppl. 2). P. 95.
  10. Анисимова Н.Ю. Оценка гемосовместимости сверхсшитых полистиролов серии Стиросорб/ Анисимова Н.Ю., Должикова Ю.И., Даванков В.А., Будник М.И., Киселевский М.В./ Мат. III Всерос. науч. конф. с межд. уч. «Наноонкология», Саратов, 6-7 октября, 2011. – Российский биотерпевтический журнал –2011. №4. С.90.
  11. Анисимова Н.Ю. Перспективы применения сорбентов серии Стиросорб в терапии грибкового сепсиса/ Анисимова Н.Ю., Должикова Ю.И., Даванков В.А., Будник М.И., Киселевский М.В./ Мат. III Всерос. науч. конф. с межд. уч. «Наноонкология», Саратов, 6-7 октября, 2011. – Российский биотерпевтический журнал – 2011. №4. С.90-91.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.