WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Новиков Дмитрий Георгиевич ОСОБЕННОСТИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ИНФИЛЬТРАТА, АТРОФИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА КИШЕЧНОГО ТИПА (14.03.02 – патологическая анатомия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Омск – 2012

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Кононов Алексей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Агеева Татьяна Августовна, Новосибирский государственный медицинский университет, профессор кафедры патологической анатомии с секционным курсом доктор медицинских наук, профессор Перельмутер Владимир Михайлович, Сибирский государственный медицинский университет, заведующий кафедрой патологической анатомии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Защита состоится “_08_”_____июня_______2012 г. в __12.00___часов на заседании диссертационного совета Д208.065.04 при Омской государственной медицинской академии (644043, Омск, ул. Ленина, д.12, тел.

8-381-2-23-32-89).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан “_03__” ______мая___________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Е.А. Потрохова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Международным агентством по изучению рака ВОЗ Helicobacter pylori (HP) был признан канцерогеном 1-й группы в 1994 году. HP не вызывает рак желудка, однако запускает воспалительную реакцию в слизистой оболочке желудка – хронический гастрит. Хроническое воспаление, в свою очередь, изменяет эпителиальный дифферон слизистой оболочки желудка, приводит к развитию в нем определенной последовательности молекулярно-биологических и морфологических изменений, отражением которых является атрофия слизистой оболочки желудка, развитие эпителиальной дисплазии/неоплазии, а затем и рака желудка кишечного типа (Correa P. et al., 1987-2012; Konturek P.C. et al., 2009).

Особенности течения воспалительной реакции при HP-инфекции у индивидуума могут быть обусловлены носительством полиморфных аллелей генов цитокинов, обеспечивающих повышенную продукцию белка и, следовательно, выраженный воспалительный ответ (El-Omar E.M. et al., 2000). Установлены полиморфные аллели генов цитокинов, ассоциированные с развитием рака желудка кишечного типа (Camargo M.C. et al., 2006, Shanks A.M. et al., 2009). Эти ассоциации значительно варьировали в различных популяциях (Gianfagna F. et al., 2008). Причем в большинстве исследований биологические эффекты носительства полиморфных аллелей генов цитокинов и их роль в регуляции воспаления при развитии рака желудка оценивались только на основании сведений об уровнях экспресии генов цитокинов и содержании цитокинов в сыворотке крови. При этом особенности проявлений воспаления в слизистой оболочке желудка, связанные с носительством полиморфных аллелей генов цитокинов, изучены только на уровне установления ассоциации двух феноменов: аллельный полиморфизм и язвенный дефект, аллельный полиморфизм и эксхеликобактерный гастрит, аллельный полиморфизм и рак желудка (Маев И.В. и соавт., 2008, Кононов А.В. и соавт., 2010, Агеева Е.С. и соавт., 2011, El-Omar E.M. et al., 2003, Achyut B.R. et al., 2008). Конкретные морфогенетические механизмы, в которых реализуется последовательность:

полиморфный ген – цитокин – молекулярная или клеточная мишень – структурные изменения в органе-мишени все еще мало понятны.

Цель исследования: определить особенности хронического воспаления и атрофии слизистой оболочки желудка у больных раком желудка кишечного типа, носителей полиморфных аллелей генов цитокинов, для оценки функциональной роли генетического полиморфизма.

Задачи исследования:

1. Установить ассоциацию иммунофенотипа клеток воспалительного инфильтрата слизистой оболочки желудка с носительством полиморфных аллелей генов цитокинов (интерлейкина-1, рецепторного антагониста интерлейкина-1, интерлейкина-10, фактора некроза опухолей-) у больных раком желудка кишечного типа.

2. Выявить особенности атрофических изменений в слизистой оболочке желудка, ассоциированные с носительством полиморфных аллелей перечисленных генов цитокинов у больных раком желудка кишечного типа.

3. Оценить состояние слизистой оболочки желудка (характеристику атрофии, состав воспалительного инфильтрата) в ее параканкрозной и дистантной зонах у больных раком желудка кишечного типа с учетом носительства комбинаций полиморфных аллелей генов цитокинов.

Научная новизна. При раке желудка кишечного типа, ассоциированного с носительством трех и более полиморфных аллелей C+3953T и C-511T гена IL-1, VNTR в интроне 2 гена IL-1RN, G-1082A гена IL-10, G-308A гена TNF- («провоспалительная» комбинация аллелей) установлены особенности развития хронического воспаления: среди мононуклеарных клеток, инфильтрирующих собственную пластинку слизистой оболочки, доминируют CD20+, CD138+ лимфоциты и IgG- плазматические клетки; атрофия слизистой оболочки желудка характеризуется стадией IV хронического гастрита и наличием распространенных очагов кишечной метаплазии III типа (неполная толстокишечная метаплазия с продукцией сульфомуцинов).

«Молчащая» комбинация полиморфизмов (носительство менее идентифицированных полиморфизмов) не ассоциирована с проявлением гуморального типа иммунного ответа в слизистой оболочке желудка (отсутствует пролиферация IgG-плазмоцитов) и, вероятно, каскад канцерогенеза у носителей данного генотипа поддерживается иными механизмами.

Практическая значимость работы. Полученные данные о топографии и иммунофенотипе клеток воспалительного инфильтрата и особенностях клеточного обновления эпителия могут использоваться в практике научных исследований по расшифровке ассоциативной взаимосвязи полиморфизма генов цитокинов и канцерогенеза при HP-инфекции.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования были использованы при разработке новой медицинской технологии «Молекулярно-генетическая методика прогноза и патоморфологический мониторинг риска развития рака желудка кишечного типа при Helicobacter pylori-инфекции», утвержденной Росздравнадзором (ФС № 2010/220 от июня 2010 г., серия АА 0000001, авторы: Кононов А.В., Потрохова Е.А., Мозговой С.И., Поморгайло Е.Г., Новиков Д.Г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 – в изданиях, рекомендованных ВАК.

Апробация работы. Диссертация выполнена в соответствии с планом научных исследований ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Основные положения работы доложены на конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины – 2010» (Санкт-Петербург, 2010), Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов, молодых ученых с международным участием «Здоровье человека и среда обитания:

фундаментальные и прикладные аспекты» (Омск, 2010), Всероссийской научной школе «Превентивная медицина, вызовы XXI века» (Омск, 2011), заседании Омского отделения Российского общества патологоанатомов (Омской областной общественной организации «Ассоциация патологоанатомов») (Омск, 2011).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Носительство трех и более полиморфных аллелей генов цитокинов:

+3953T и -511T гена интерлейкина-1, IL-1RN*2 гена рецепторного антагониста интерлейкина-1, -1082A гена интерлейкина-10, -308A гена фактора некроза опухолей- («провоспалительная» комбинация аллелей) у больных раком желудка кишечного типа фенотипически проявляется высокой долей CD20+ лимфоцитов, CD138+ IgG-продуцирующих плазмоцитов в мононуклеарном воспалительном инфильтрате и доминированием стадии IV хронического гастрита, проявляющейся распространенными очагами кишечной метаплазии III типа (неполной толстокишечной метаплазии).

2. При раке желудка кишечного типа в дистантной зоне слизистой оболочки желудка доминируют (в сравнении с параканкрозной зоной) IgGпродуцирующие плазматические клетки, численность которых коррелирует с инфильтрацией CD20+ лимфоцитами. Параканкрозная зона характеризуется выраженной инфильтрацией CD8+ лимфоцитами и CD68+ макрофагами. В дистантной и параканкрозной зонах выявляются выраженные атрофические изменения слизистой оболочки желудка (стадии III и IV хронического гастрита). При раке желудка диффузного типа не наблюдается различий между параканкрозной и дистантной зонами слизистой оболочки желудка: слабо выражены CD20+, CD4+, CD8+, CD68+ клеточная инфильтрация, атрофические изменения слизистой оболочки желудка соответствуют I и II стадиям хронического гастрита.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 1страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц, 62 рисунка. Работа состоит из 7 глав. Список литературы включает 33 отечественных и 1зарубежных источников.

Личный вклад автора. Автором проведен анализ научных публикаций по теме диссертационного исследования, вырезка операционного материала, его гистопатологическая оценка, иммуногистохимическое и молекулярно-генетическое исследование, статистический анализ полученных результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Выполнено когортное одномоментное сравнительное контролируемое исследование. Объектами исследования были фрагменты слизистой оболочки желудков, резецированных по поводу наличия рака желудка кишечного и диффузного типа, и венозная кровь 116 лиц, находившихся на лечении в Бюджетном учреждении здравоохранения «Омский областной клинический онкологический диспансер». Критериями включения являлись: проживание на территории юга Западной Сибири, этническая принадлежность к русским.

Критерии исключения: наличие крупной опухоли, занимающей более 60% антрального отдела или тела желудка, наличие стадии опухолевого процесса IV (T1-4N0-1M1), которая характеризовалась наличием метастазов в другие органы брюшной полости, наличие в анамнезе аутоиммунных болезней, наличие родственных связей между лицами, включенными в исследование. В каждом случае имелось информированное согласие пациентов на проведение молекулярно-генетического исследования. Проведение молекулярногенетического исследования было одобрено локальным этическим комитетом ОмГМА.

В исследуемую группу – были включены 82 больных раком желудка кишечного типа, средний возраст которых составил 60,3 ± 8,6 лет. Частой локализацией опухоли был угол желудка (54,9%), реже встречалась локализация опухоли по малой кривизне антрального отдела (37,8%). Редкой локализацией опухоли были малая и большая кривизна тела желудка (2,4% и 4,9% соответственно). Статистически значимых различий при оценке степени и стадии хронического гастрита при различных локализациях опухоли обнаружено не было (p=0,32 и p=0,16 соответственно). В группе больных раком желудка кишечного типа наиболее частыми вариантами опухоли по классификации TNM были T3N0M0 и T4N0M0 (суммарная частота 45,1% и 39,0% соответственно), относящиеся к II стадии опухоли по классификации ВОЗ. III стадия (T1-4N1M0) встречалась в 12,2% случаев. В 3,7% случаев наблюдалась опухоль, характеризовавшаяся по данной классификации как T2 N0 M0 (стадия I).

С целью исключения влияния субъективных факторов на результат морфологической оценки применялся метод «ослепления» патолога:

материал, полученный от одного больного, был закодирован двумя различными номерами для морфологического и генетического исследования, которые сопоставлялись только на заключительном этапе исследования.

В группу сравнения были включены 34 больных раком желудка диффузного типа, средний возраст которых составил 53,8 ± 5,2 года.

Генетическое исследование у больных этой группы не проводилось, так как роль носительства полиморфных аллелей генов цитокинов, в патогенезе заболевания не доказана.

В контрольную группу были включены 104 здоровых донора средним возрастом 52,3±7,1 года, не имеющие онкологических заболеваний в анамнезе и не состоящие в родстве. Группа была сформирована для оценки частот полиморфных аллелей генов цитокинов в исследуемой популяции, что является необходимым требованием при проведении молекулярногенетических исследований. Морфологических исследований в ней не проводили.

Гистологические методы исследования. Объектом исследования был операционный материал резецированного по Бильрот-I и Бильрот-II желудка.

От резецированного желудка отделяли большой сальник, вскрывали желудок по большой кривизне, расправляли на листе фанеры и фиксировали в 10%-ном забуференном формалине 12-24 часа. Забор фрагментов слизистой оболочки желудка проводили из параканкрозной зоны (на расстоянии 5 мм от границы слизистой оболочки желудка с опухолью) и из дистантной зоны:

малая, большая кривизна, передняя, задняя стенки антрального отдела; угол желудка; малая, большая кривизна, передняя, задняя стенки тела желудка.

Дополнительно вырезали фрагмент опухоли.

Подразделение слизистой оболочки желудка на дистантную и параканкрозную зоны весьма условно и представляет методический прием, с помощью которого мы хотели по возможности отдельно рассмотреть иммунный ответ на опухоль (параканкрозная зона) и собственно интересующую нас дистантную зону, которую условно принимали как отражение каскада P.Correa до этапа неопластических изменений эпителия.

В дистантной зоне, мы полагаем, можно оценить особенности воспалительного ответа и изменений клеточного обновления у лиц с аллельным полиморфизмов генов цитокинов, ассоциированных с раком желудка кишечного типа.

Проводку биоптатов, заливку в парафин и приготовление парафиновых срезов проводили общепринятыми методами с помощью аппарата STP-120, заливочной станции EC-350 и ротационного микротома HM 340E (Microm, Германия).

Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином.

Для оценки атрофии и выраженности воспаления в слизистой оболочке желудка использовали визуально-аналоговую шкалу Российского пересмотра Международной классификации хронического гастрита OLGA, разработанного сотрудниками кафедры патологической анатомии Омской государственной медицинской академии и утвержденного III съездом Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009) (Аруин Л.И. и соавт., 2009).

Гистохимические методы исследования использованы для верификации типа кишечной метаплазии (Мозговой С.И., 2009).

Использовали сочетание красителей альцианового синего (при рН=2,5) и ШИК-реакции для верификации I и II типа кишечной метаплазии, сочетание диамина железа и альцианового синего (при рН=2,5) – III типа кишечной метаплазии. Соотношение типов кишечной метаплазии оценивалось в процентах при подсчете желез в каждом фрагменте в 10 полях зрения при 400-кратном увеличении микроскопа. Распространенность очагов кишечной метаплазии оценивалась полуколичественно, в соответствии с Модифицированной Сиднейской сиcтемой (Dixon M. et al., 1996).

Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах. Демаскировку антигенов осуществляли в цитратном буфере (pH=6,0) при кипячении на водяной бане на протяжении 1 часа. Использовали первичные ready to use (готовые к использованию, без разведения) мышиные моноклональные антитела к CD4 (клон - 1F6), CD8 (клон - 144B), CD1(клон - MI15) («DAKO», Дания), CD20 (клон - L26), CD68 (клон - KP1) («Diagnostic Biosystems», США) и кроличьи поликлональные антитела к IgA, IgG («DAKO», Дания). Ядра докрашивали гематоксилином Майера.

Биотинилированные антитела второго слоя и стрептавидин, меченный пероксидазой, входили в систему визуализации KP-500 («Diagnostic Biosystems», США). Определяли относительное количество позитивно окрашенных клеток, подсчитывая при 400-кратном увеличении долю (в %) положительно окрашенных клеток мононуклеарного воспалительного инфильтрата в собственной пластинке слизистой оболочки желудка в случайно выбранных полях зрения (не менее 1000 клеток). Подсчет CD138+, IgA+, IgG+ клеток проводился в 1 мм2 среза.

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе Axioskop 40 с цифровой фотокамерой Axiocam MRc5 («Carl Zeiss», Германия).

Генетический метод исследования (метод полимеразной цепной реакции) применяли для исследования полиморфизма следующих генов интерлейкина-1 (IL-1 C+3953T, C-511T), рецепторного антагониста интерлейкина-1 (IL-1RN VNTR во 2 интроне), фактора некроза опухолей- (TNF- G-308A), интерлейкина-10 (IL-10 G-1082A) в лейкоцитах периферической крови.

Для определения полиморфных локусов C+3953T, C-511T гена IL-1 и VNTR-полиморфизма во 2 интроне гена IL-1RN использовали коммерческие наборы, производимые Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Для определения полиморфных локусов G-308A гена TNF- и G-1082A гена IL-использовались наборы «SNP-экспресс» (НПФ «Литех», Москва). Этапы выделения, амплификации ДНК, рестрикции и детекции продуктов амплификации выполнялись в соответствии с требованиями, указываемыми производителем. Этап амплификации выполнялся на термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Москва). Исследование выполнено в лаборатории кафедры патологической анатомии Омской государственной медицинской академии.

Статистические методы исследования. Минимальный размер выборки определялся по формуле F. Lopez-Jimenez с соавт. (Lopez-Jimenez F. et. al., 1998) и составил 32 наблюдения. Для анализа достоверности различий использовались критерии: хи-квадрат (2), Манна – Уитни (U), Краскела-Уоллеса (H), точный критерий Фишера (Гланц С., 1998). Пороговая величина вероятности ошибки считалась на уровне 0,05. Значения показателя отношения шансов (OR), оценку соответствия частот аллелей и генотипов закону Харди-Вайнберга проводили на онлайн-калькуляторе:

http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl. Для остальных вычислений и построения диаграмм использовали Microsoft Office Excel 20и Statistica 7.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты оценки степени хронического гастрита (выраженность воспалительного инфильтрата слизистой оболочки желудка) показали, что у больных раком желудка кишечного типа наиболее распространенной была степень III хронического гастрита, соответствующая значительной мононуклеарной инфильтрации собственной пластинки слизистой оболочки, наблюдалась у 48,8% больных (рис 1).

Рис. 1. Частота выявления степени I-IV хронического гастрита (выраженность воспалительного инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки желудка) в группах больных раком желудка кишечного и диффузного типа.

Было установлено, что степень хронического гастрита у больных раком желудка кишечного типа коррелирует с количеством исследуемых полиморфных аллелей (rs=0,66; p=0,03). Обнаруженная корреляция, вероятно, обусловлена функциональной ролью исследуемых полиморфных аллелей в регуляции интенсивности воспалительного ответа в слизистой оболочке желудка. Ранее установлено, что носительство этих полиморфных аллелей приводит к повышенной продукции цитокинов (Persson C. et al., 2009, Murphy G., et al., 2009), как на начальных этапах хронического гастрита, так и при персистенции воспалительного инфильтрата в слизистой оболочке желудка (Кононов А.В. и соавт., 2010, Smith A.J. et al., 2009).

Таким образом, если у носителей полиморфных аллелей имеется предрасположенность к развитию выраженного провоспалительного ответа, это является важным фактором прогрессирования каскада P.Correa, который берет свое начало на этапе воспаления слизистой оболочки желудка, с дальнейшим развитием атрофических изменений, дисплазии/неоплазии эпителия и инвазивной карциномы кишечного типа (Correa P. et al., 2012).

В наших исследованиях высокий уровень мононуклеарной воспалительной инфильтрации слизистой оболочки желудка (степень хронического гастрита III-IV) у больных раком желудка кишечного типа ассоциирован с сочетанием полиморфных аллелей: +3953T и -511T гена IL1, -1082A гена IL-10, -308A гена TNF-, IL-1RN*2. В связи с изложенным, операционный материал больных раком желудка кишечного типа был разделен на две подгруппы, в зависимости от носительства комбинации полиморфных аллелей. Подгруппа носителей «провоспалительной» комбинации аллелей сформирована на основании преобладания в их генотипе исследуемых полиморфных аллелей генов цитокинов, то есть наличия 3 и более полиморфных аллелей. Правомерность такого подхода была показана E.M. El-Omar и соавторами (2003), обнаружившими повышенный риск развития рака желудка именно у носителей 3-полиморфных аллелей генов цитокинов и применивших к подобным комбинациям аллелей дефиницию «провоспалительный генотип».

Операционный материал больных раком желудка кишечного типа, у которых было обнаружено носительство менее трех исследуемых полиморфных аллелей, был включен в подгруппу «молчащей» комбинации аллелей. Применение такого несколько механистического подхода при оценке генотипа и сделало возможным сформировать две сопоставимые между собой подгруппы. Понятия «провоспалительной» и «молчащей» комбинации аллелей указывают на их функциональную роль применительно не к развитию опухоли, а к оценке функционального проявления генетического полиморфизма, реализующегося хронизацией воспаления, влекущей за собой выраженное нарушение клеточного обновления слизистой оболочки желудка.

При анализе состава воспалительного инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки желудка у больных раком желудка кишечного типа нами было обнаружено, что в подгруппе больных с «провоспалительной» комбинацией аллелей наблюдается достоверно более выраженная инфильтрация дистантной зоны слизистой оболочки желудка CD20+ клетками (табл.1). При этом доля CD20+ клеток в собственной пластинке слизистой оболочки желудка коррелирует с показателем степени хронического гастрита (rs=0, 83; p<0,001).

Таблица Количество (%) CD20+ лимфоцитов у носителей «провоспалительной» и «молчащей» комбинации аллелей Комбинация аллелей Топография слизистой оболочки желудка Дистантная зона Параканкрозная зона Me LQ-HQ Min- Me LQ-HQ MinMax Max «Провоспалительная» 9,2*^ 6,1-9,8 5,7- 3,8* 2,1-4,7 1,8-5,комбинация аллелей 11,«Молчащая» 5,2*^ 4,7-5,9 3,9-7,8 3,1* 2,5-3,9 2,0-4,комбинация аллелей Условные обозначения: Me – медиана, LQ-HQ – межквартильный интервал, Min-Max – минимальное-максимальное значения. * - p<0,05 между столбцами одной строки, ^ - p<0,05 между строками одного столбца.

У носителей «молчащей» комбинации аллелей инфильтрация дистантной зоны слизистой оболочки желудка CD20+ лимфоцитами была достоверно ниже (p=0,02) по сравнению с инфильтрацией слизистой оболочки в подгруппе «провоспалительной» комбинации аллелей.

Различий CD20+ инфильтрации в параканкрозной зоне между подгруппами выявлено не было (p=0,09).

В исследуемой популяции была выявлена ассоциация с развитием опухоли только аллелей -511T гена IL-1 и -1082A гена IL-10. Вполне может оказаться, что в регуляции цитокиновой сети малозначимой является роль носительства отдельного полиморфного аллеля, тогда как комбинация нескольких провоспалительных аллелей, по-видимому, обеспечивает определенный профиль продукции цитокинов («провоспалительная» и «молчащая» комбинации аллелей), который формирует фенотип хронического воспаления в слизистой оболочке желудка. Воспалительный инфильтрат собственной пластинки слизистой оболочки желудка, в свою очередь, обусловливает нарушение клеточного обновления эпителия.

Как установлено, одной из характеристик иммунофенотипа клеток воспалительного инфильтрата является преобладание CD20+ лимфоцитов в подгруппе с «провоспалительной» комбинацией аллелей. При этом CD20+ лимфоциты являются эффекторными клетками только для IL-10, тогда как остальные цитокины, полиморфные аллели которых были включены нами в «провоспалительную» комбинацию аллелей, не оказывают непосредственного влияния на CD20+ клетки. Вероятно, у носителей «провоспалительной» комбинации аллелей выраженная инфильтрация CD20+ клетками, предшественниками плазматических клеток, может рассматриваться как маркер хронического воспаления в собственной пластинке слизистой оболочки желудка.

Инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки желудка CD20+ лимфоцитами была более выражена в ее дистантной зоне (табл.1).

Количество CD20+ лимфоцитов находилось в положительной корреляционной связи с количеством плазматических клеток (CD138+) в собственной пластинке слизистой оболочки желудка (rs=0,79; p=0,003).

Данная находка указывает на уже состоявшуюся реализацию хронического воспалительного ответа. При этом параканкрозная зона слизистой оболочки желудка, также как и в случае с CD20+ клетками, характеризовалась низкой плотностью плазмоцитарной инфильтрации. Эти результаты согласуются с данными, полученными И.А. Даниловой и Н.М.

Аничковым, указывающими на уменьшение плотности плазмоцитарной инфильтрации параканкрозной зоны слизистой оболочки желудка у больных раком желудка кишечного типа, происходящей параллельно с ростом опухоли и ее инвазией (Данилова И.А. и соавт., 2011).

Аналогичные закономерности различия дистантной и параканкрозной зон были получены и при оценке выраженности инфильтрации слизистой оболочки желудка IgA+ и IgG+плазмоцитами (табл. 2). Нами было обнаружено, что в дистантной зоне слизистой оболочки желудка наблюдалась выраженная инфильтрация IgA+, IgG+ плазмоцитами, в сравнении с параканкрозной зоной (табл. 2). Похожие результаты были получены M. Qiding-Jarbrink и соавторами с помощью метода проточной цитометрии (Qiding-Jarbrink M. et al., 2009).

Таблица Количественные показатели состава популяции плазмоцитов у носителей «провоспалительной» и «молчащей» комбинации аллелей Состав Топография слизистой оболочки желудка клеточного Дистантная зона Параканкрозная зона инфильтрата Me LQ-HQ Min- Me LQ-HQ Min(клеток/мм2) Max Max «провоспалительная» комбинация аллелей CD138+ 249*^ 219-270 204-277 138* 110-160 102-1IgA+ 226* 201-233 189-262 117* 98-132 73-1IgG+ 55*^ 48-63 28-72 21* 20-28 19-«молчащая» комбинация аллелей CD138+ 183*^ 178-195 166-201 145* 141-149 135-1IgA+ 214* 197-220 192-238 105* 97-131 79-1IgG+ 37*^ 35-40 29-45 18* 20-25 16-Условные обозначения: Me – медиана, LQ-HQ – межквартильный интервал, Min-Max – минимальное-максимальное значения. * - p<0,05 между столбцами одной строки, ^ - p<0,05 между одноименными строками одного столбца.

При сравнении подгрупп носителей «провоспалительной» и «молчащей» комбинации аллелей достоверных различий выраженности инфильтрации дистантной зоны собственной пластинки слизистой оболочки желудка IgA-плазмоцитами обнаружено не было (p=0,11). Однако подгруппа носителей «провоспалительной» комбинации аллелей характеризовалась достоверно более высокой IgG-плазмоцитарной инфильтрацией (p<0,001).

Достоверных различий инфильтрации параканкрозной зоны IgA- и IgG- плазмоцитами между носителями «провоспалительной» и «молчащей» комбинаций аллелей обнаружено не было.

Выраженная инфильтрация слизистой оболочки желудка CD20+ и CD138+ клетками может наблюдаться при поляризации иммунного ответа по Th2 типу (D’Elios M.M., 2005). Однако воспалительный ответ, протекающий по Th2 типу, традиционно рассматривается как ассоциированный с низким риском развития рака желудка кишечного типа (Konturek P.C. et al., 2009).

Иммунным ответом по Th2 типу, развивающимся в ответ на паразитарные инвазии, объясняется «африканская загадка»: низкая заболеваемость раком желудка при высокой инфицированности HP населения экваториальной Африки (Whary M.T. et al., 2005).

Обнаруженный нами локальный гуморальный иммунный ответ, наоборот, ассоциирован с раком желудка кишечного типа. Полагаем, что объяснить этот факт можно следующим образом. Возможно, имеет место переключение синтеза IgA в плазмоцитах слизистой оболочки желудка на синтез IgG, о чем и свидетельствует доминирование именно IgGплазмоцитов в дистантной зоне слизистой оболочки желудка в сравнении с параканкрозной. Подобный процесс переключения синтеза IgAIgG плазматическими клетками как стереотипная реакция, развивающаяся при хроническом воспалении в слизистых оболочках, был описан А.В.

Кононовым, обнаружившим нарастание продукции IgG в слизистой оболочке желудка, происходящее параллельно с эволюцией хронического гастрита от поверхностного до атрофического (Кононов А.В., 1993). Появление синтеза IgG приводит к изменению воспалительной реакции в слизистой оболочке желудка. В отличие от IgA, связывание IgG с любым антигеном обусловливает активацию системы комплемента и аттракцию нейтрофильных лейкоцитов (Brandtzaeg P., 2010). Известен механизм канцерогенеза, связанный с повреждающим воздействием на ДНК эпителиоцитов генеративной зоны слизистой оболочки желудка активных форм кислорода и оксида азота, продуцируемых нейтрофильными лейкоцитами при «кислородном взрыве». Накопление мутаций в клеткахпредшественниках приводит к развитию дисплазии/неоплазии эпителия, клональной пролиферации неопластических клеток, инвазивной карциноме (Correa P. et al., 2012).

При оценке параканкрозной зоны была обнаружена выраженная инфильтрация CD8+ лимфоцитами и CD68+ макрофагами (табл. 3). Это вероятно является морфологическим проявлением иммунного ответа, возникающего в ответ на развитие опухоли (Бережная Н.М. и соавт., 2005).

Ряд авторов также указывают на увеличение плотности макрофагальной инфильтрации при раке желудка кишечного типа (Данилова И.А. и соавт., 2009, Wang B. et al., 2011), объясняя этот феномен не только реакцией на опухоль, но и необходимостью клеточной кооперации в опухоли (Caruso R.A.

et al., 1999).

Увеличение количества CD8+ лимфоцитов (цитотоксических) в зоне опухоли при раке желудка кишечного типа показано C. Ju-gao и соавторами (Ju-gao C. et al., 2011). При сравнении количества цитотоксических лимфоцитов и макрофагов в дистантной и параканкрозной зонах статистически значимых отличий между подгруппами носителей «провоспалительной» и «молчащей» комбинации аллелей не выявлено. Это обстоятельство убеждает нас в правильности выбранного подхода: по своему функциональному значению «провоспалительная» и «молчащая» комбинации аллелей применимы только к анализу дистантной по отношению к опухоли зоны, которая, как мы полагаем, является субстратом измененного клеточного обновления и прогрессирования воспаления, являющихся, в соответствии с каскадом P.Correa, этапами канцерогенеза.

Таблица Количество (%) CD8+ лимфоцитов и CD68+ макрофагов у носителей «провоспалительной» и «молчащей» комбинации аллелей Топография слизистой оболочки желудка Дистантная зона Параканкрозная зона Комбинация аллелей Me LQ-HQ Min- Me LQ-HQ MinMax Max CD8+ лимфоциты «Провоспалительная» 18,8* 17,6- 14,7- 27,3* 16,8- 18,2комбинация аллелей 25,8 30,3 35,9 38,«Молчащая» комбинация 18,2* 16,1- 14,3- 25,8* 17,9- 18,2аллелей 22,8 28,7 33,5 34,CD68+ макрофаги «Провоспалительная» 16,1* 14,8- 13,2- 26,2* 21,3- 19,6комбинация аллелей 17,9 18,1 28,9 29,«Молчащая» комбинация 16,9* 16,1- 12,0- 24,3* 19,8- 17,3аллелей 20,0 23,8 26,5 28,Условные обозначения: Me – медиана, LQ-HQ – межквартильный интервал, Min-Max – минимальное-максимальное значения. * - p<0,05 между столбцами одной строки, ^ - p<0,05 между строками одного столбца.

На основании полученных результатов оценки особенностей воспалительного инфильтрата в параканкрозной и дистантной зонах слизистой оболочки желудка с учетом носительства полиморфных аллелей генов цитокинов мы разработали модель регуляции воспаления при раке желудка кишечного типа у носителей «провоспалительной» комбинации аллелей (рис. 2).

Дистантная зона Параканкрозная зона CD68+ IgG/IgA АФК Опухоль Активация комплемента CD138+ CD8+ Миграция Миграция CD20+ CD20+ нейтрофилов IgA моноцитов IgG ThTh2 Th«Провоспалительная» комбинация аллелей генов цитокинов CD4+ Рис. 2. Регуляция воспаления в слизистой оболочке желудка у носителей «провоспалительной» комбинации аллелей при раке желудка кишечного типа (на основании собственных и литературных данных). Обозначения: / - усиление/ослабление продукции, - по литературным данным, АФК – активные формы кислорода.

Вопреки ожиданию, нам не удалось показать роль «молчащей» комбинации полиморфных аллелей в регуляции воспаления в дистантной зоне слизистой оболочки желудка. Однако была показана роль «провоспалительной» комбинации аллелей, определявшей не только выраженность воспалительного инфильтрата, но и выраженную инфильтрацию слизистой оболочки желудка CD20+ клетками. Мы полагаем, что у носителей «провоспалительной» комбинации аллелей выраженная инфильтрация CD20+ клетками может рассматриваться как косвенный маркер, отражающий их роль в развитии хронического воспаления в собственной пластинке слизистой оболочки желудка.

«Молчащая» комбинация аллелей, обнаруженная почти в половине наблюдений (42 случаях из 82), не противоречит концепции этапного канцерогенеза P. Correa. «Молчащей» она является только для избранных нами клеток-мишеней (эффекторов гуморального иммунитета, цитотоксических лимфоцитов и макрофагов). Возможный вариант объяснения прогрессирования воспаления и наличия мутаций, приводящих к канцерогенезу у носителей «молчащей» комбинации аллелей связан с тем, что прогрессирование воспаления могут вызывать иные полиморфные аллели генов цитокинов, имеющие молекулярные мишени, не исследованные в нашей работе.

При раке желудка диффузного типа различия в составе воспалительного инфильтрата между параканкрозной и дистантной зонами слизистой оболочки желудка отсутствовали. Это связано с принципиально иным механизмом канцерогенеза, не носящим стадийного характера и не обусловленным развитием хронического воспаления в слизистой оболочке желудка (Vauhkonen M. et al., 2006).

Оценка атрофических изменений слизистой оболочки желудка у больных раком желудка кишечного типа показала преобладание атрофического пангастрита, соответствующего стадиям III и IV. Подобные изменения в слизистой оболочке желудка обнаруживались у 76,8% больных (рис.3).

Рис. 3. Распространенность атрофических изменений слизистой оболочки желудка, соответствующих стадиям 0-IV хронического гастрита в группах больных раком желудка кишечного и диффузного типа.

Аналогичную распространенность стадий III и IV хронического гастрита показали K. Satoh и соавт. на японской популяции (Satoh K. et al., 2008). Эти результаты согласуются с концепцией, применявшейся при создании Международной классификации хронического гастрита OLGA, указывающей на высокий риск развития рака желудка кишечного типа у больных хроническим гастритом, атрофические изменения в слизистой оболочке желудка у которых соответствуют стадиям III и IV (Rugge M. et al., 2008).

У больных раком желудка диффузного типа атрофические изменения слизистой оболочки желудка либо отсутствовали, либо преобладали слабо выраженные атрофические изменения, соответствующие стадиям I-II хронического гастрита (рис.3).

При оценке стадии хронического гастрита у носителей «провоспалительной» и «молчащей» комбинации аллелей было выявлено преобладание стадии IV у носителей «провоспалительной» комбинации аллелей, которая наблюдалась у 19 из 40 больных, тогда как у носителей «молчащей» комбинации аллелей стадия IV наблюдалась у 4 из 42 больных (2=12.8; p=0,006). Основной вклад в развитие атрофии у больных раком желудка кишечного типа принадлежал кишечной метаплазии (метапластическая атрофия), которая обнаруживалась у 93% больных.

Наиболее распространенным типом метаплазии у носителей «провоспалительной» комбинации был тип III: медиана показателя ее доли по отношению к другим типам кишечной метаплазии составила 76,2%. У носителей «молчащей» комбинации аллелей обнаружены преимущественно I и II типы кишечной метаплазии.

Наличие ассоциации атрофических изменений слизистой оболочки желудка, соответствующих стадии IV хронического гастрита, с носительством «провоспалительной» комбинации аллелей может быть объяснено следующим образом. Наличие стадии IV хронического гастрита соответствует максимально выраженным атрофическим изменениям и фактически является этапом каскада P.Correa, предшествующим развитию эпителиальной неоплазии или продолжающимся параллельно с ее развитием.

Однако наличие рака желудка кишечного типа возможно уже на стадии III и редко на II стадии хронического гастрита (Satoh K. et al., 2008). Носительство «провоспалительной» комбинации аллелей, ассоциированное с повышенной продукцией соответствующих цитокинов (Smith A.J. et al., 2009), обусловливает развитие выраженного воспалительного ответа (El-Omar E.M.

et al., 2000), приводящего к повреждению слизистой оболочки желудка активными формами кислорода и цитокинами, выделяемыми мононуклеарными клетками воспалительного инфильтрата слизистой оболочки желудка – TNF-, IFN-, IL-1, что может способствовать прогрессии каскада P.Correa. В результате у носителей «провоспалительной» комбинации аллелей чаще обнаруживается стадия IV хронического гастрита.

Наряду с этим, у носителей «провоспалительной» комбинации аллелей наблюдается большая распространенность очагов кишечной метаплазии III типа.

Механизм формирования популяции клеток с фенотипом неполной кишечной метаплазии (III типа), возможно, обусловлен повышенной продукцией IgG у носителей «провоспалительной» комбинации аллелей.

Предполагается, что IgG, фиксируясь Fc-фрагментом на прогениторной клетке эпителиального дифферона слизистой оболочки желудка, обеспечивает ее «ускользание» от иммунного ответа (Бережная Н.М. и соавт., 2005). Это приводит к сохранению популяции прогениторных клеток зоны перешейка желез, накапливающих генетические нарушения, которые могут завершиться запуском клональной пролиферации опухолевых клеток (McDonald S.A. et al., 2008).

Таким образом, носительство «провоспалительной» комбинации аллелей, ассоциированной с раком желудка кишечного типа, в отличие от «молчащей» комбинации аллелей имеет фенотипическим проявлением становление локального иммунного ответа с высоким количеством СD20+, CD138+ клеток и IgG-плазмоцитов, что является признаком персистенции воспаления, которое приводит к развитию атрофических изменений слизистой оболочки желудка (стадии IV хронического гастрита) с преобладанием очагов распространенной кишечной метаплазии III типа.

ВЫВОДЫ 1. Выраженный мононуклеарный инфильтрат собственной пластинки слизистой оболочки желудка с высокой долей CD20+ лимфоцитов (степень III и IV хронического гастрита) ассоциирован с носительством трех и более полиморфных аллелей генов: +3953T и -511T гена интерлейкина-1, IL1RN*2 рецепторного антагониста интерлейкина-1, -1082A гена интерлейкина-10, -308A гена фактора некроза опухолей- («провоспалительная» комбинация аллелей) у больных раком желудка кишечного типа.

2. При раке желудка кишечного типа имеются различия между параканкрозной и дистантной зонами слизистой оболочки, характеризующиеся инфильтрацией CD8+ лимфоцитами и CD68+ макрофагами параканкрозной зоны и инфильтрацией дистантной зоны собственной пластинки слизистой оболочки желудка CD20+ лимфоцитами и IgG-продуцирующими плазматическими клетками. При раке желудка диффузного типа различия состава воспалительного инфильтрата между параканкрозной и дистантной зонами слизистой оболочки отсутствуют.

3. Рак желудка кишечного типа при наличии стадии IV хронического гастрита с распространенной кишечной метаплазией III типа ассоциирован с носительством трех и более полиморфных аллелей генов: +3953T и -511T гена интерлейкина-1, IL-1RN*2 гена рецепторного антагониста интерлейкина-1, -1082A гена интерлейкина-10, -308A гена фактора некроза опухолей- («провоспалительная» комбинация аллелей).

4. «Провоспалительная» комбинация аллелей функционально проявляется формированием в слизистой оболочке желудка доминирующего гуморального типа иммунного ответа с наличием признаков хронического воспаления – высоким уровнем IgG-плазматических клеток и формированием атрофии с кишечной метаплазией моноклонового фенотипа (III тип кишечной метаплазии).

5. При «молчащей» комбинации аллелей не реализуются механизмы хронизации за счет формирования пула IgG-плазмоцитов. Клеточное обновление характеризуется доминированием II и III стадии хронического гастрита с кишечной метаплазией I и II типа. Реализация каскада канцерогенеза обеспечивается влиянием иных аллельных полиморфизмов, не изученных в данном исследовании.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Новиков Д.Г. Морфологические особенности хронического хеликобактер–ассоциированного гастрита, обусловленные генотипом бактерии и хозяина / Д.Г. Новиков // Бюллетень Северного государственного медицинского университета. – 2007. – №1. – С.112.

2. Мозговой С.И. Оценка интегрального показателя атрофии слизистой оболочки при хроническом гастрите в прогнозе риска развития рака желудка/ С.И. Мозговой, Д.Г. Новиков, А.В. Кононов // Омский научный вестник. – 2010. – № 1(94). – С. 21-24.

3. Новиков Д.Г. Оценка риска развития рака желудка кишечного типа у носителей полиморфных аллелей генов цитокинов / Д.Г.

Новиков, А.В. Кононов, Е.Г. Поморгайло, С.И. Мозговой // Медицина в Кузбассе. – 2010. – № 4. – С. 21-24.

4. Новиков Д.Г. Роль ядерного фактора B в развитии хронического гастрита и рака желудка кишечного типа / Д.Г. Новиков, А.В. Кононов // Вестник Новосибирского государственного университета. – 2010. – вып.

2, Т. 8. – С.149-159.

5. Новиков Д.Г. Использование оценки стадии хронического гастрита для прогноза риска рака желудка кишечного типа / Д.Г. Новиков, С.И. Мозговой, А.Г. Шиманская // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сборник тезисов юбилейной научно-практической конференции молодых ученых. – СПб, 2010. – С.126-127.

6. Новиков Д.Г. Полиморфизм генов цитокинов, ассоциированный с риском развития рака желудка кишечного типа / Д.Г. Новиков // Клиниколабораторный консилиум. – 2010. – № 2-3 (33-34). – С.164.

7. Новиков Д.Г. Состав воспалительного инфильтрата в слизистой оболочке желудка и генетический полиморфизм цитокинов при раке желудка кишечного типа / Д.Г. Новиков // Молодой ученый. – 2011. – №5, Т. 2. - С.

212-215.

8. Новиков Д.Г. Особенности воспалительного инфильтрата и атрофии в параканкрозной и дистантной зонах слизистой оболочки желудка у больных раком желудка кишечного типа, носителей полиморфных аллелей генов цитокинов / Д.Г. Новиков // Молодой ученый. – 2012. – №3, Т.3. - С. 447-452.

На правах рукописи Новиков Дмитрий Георгиевич ОСОБЕННОСТИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ИНФИЛЬТРАТА, АТРОФИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА КИШЕЧНОГО ТИПА (14.03.02 – патологическая анатомия) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Омск – 20Подписано в печать 28.04.20Формат 6084/Бумага офсетная П.л. – 1,Способ печати – оперативный Тираж 1Издательско-полиграфический центр ОмГМА 644050, г. Омск, пр. Мира, 30, тел. 60-59-




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.